Deux techniques pour créer des souris Hypoparathyroid: Parathyroïdectomie Utilisation GFP Glands et Diphtérie-Toxin-Mediated parathyroïdienne Ablation

Summary

Des souris atteintes d’hypoparathyroïdie acquise seraient utiles pour étudier de nouvelles thérapies médicamenteuses contre l’hypoparathyroïdie. Deux procédures pour créer de telles souris sont démontrées. La souris GFP-PTX est générée par parathyroïdectomie chirurgicale guidée par des glandes parathyroïdes vertes fluorescentescentes. Une deuxième approche, non chirurgicale, est basée sur l’expression spécifique de la parathyroïde du récepteur de la toxine diphtérique.

Abstract

L’hypoparathyroïdie (HP) est un trouble caractérisé par de faibles niveaux de PTH qui entraînent une hypocalcémie, une hyperphosphatémie et un faible renouvellement osseux. La cause la plus fréquente de la maladie est l’ablation accidentelle des glandes parathyroïdes lors d’une chirurgie de la thyroïde. De nouvelles thérapies pour la HP sont nécessaires, mais leur test nécessite des modèles animaux fiables de HP acquis.

Ici, nous démontrons la génération de deux modèles murins de HP acquis. Dans le modèle GFP-PTX, des souris avec une protéine fluorescente verte (GFP) exprimée spécifiquement dans les parathyroïdes (PTHcre-mTmG) ont été créées en croisant des souris PTHcre⁺ avec des souris Rosa-mTmG^fl/fl. Les glandes parathyroïdes vertes fluorescentes sont facilement identifiées à l’aide d’un microscope à dissection de fluorescence et la parathyroïdectomie est réalisée en moins de 20 min. Après une chirurgie guidée par fluorescence, les souris sont profondément hypocalcémiques. Contrairement à la thyro-parathyroïdectomie traditionnelle, cette approche chirurgicale précise laisse les glandes thyroïdes et la fonction thyroïdienne intactes. Le deuxième modèle, qui ne nécessite pas de chirurgie, est basé sur une approche diphtérie-toxine. Les souris PTHcre-iDTR, qui expriment le récepteur de la toxine diphtérique (DT) spécifiquement dans les parathyroïdes, ont été générées en croisant la souris DTR inductible avec la souris PTHcre. Les cellules parathyroïdiennes sont ainsi rendues sensibles à la toxine diphtérique (DT) et peuvent être détruites de manière sélective en injectant systématiquement du DT à des souris. Le phénotype hypocalcémique qui en résulte est stable.

Introduction

Depuis la première description systématique des glandes parathyroïdes chez l' homme et dans plusieurs autres espèces par Sandström en 1880 ^1, la compréhension de l'importance de ce petit organe endocrine pour la physiologie humaine et la maladie a continuellement amélioré. glandes parathyroïdes sécrètent l'hormone parathyroïdienne (PTH), le principal régulateur de métabolisme du calcium. PTH est également une hormone importante pour l' homéostasie du phosphate et du remodelage osseux ^{1, 2.} Suppression accidentelle ou d' endommagement des parathyroïdes lors de la chirurgie du cou est la cause la plus fréquente de l' hypoparathyroïdie, une maladie caractérisée par une faible taux de calcium sanguin, faible PTH, et de phosphore élevées ^1.

Pour mieux étudier acquis hypoparathyroïdie et de test de nouvelles thérapies, fiable et facilement des modèles de souris accessibles sont nécessaires. Les souris sont largement utilisés dans la recherche, car une grande variété d'outils génétiques sont unvailable dans cette espèce permettant des études mécanistiques sophistiquées in vivo. Cependant, alors que parathyroidectomie chirurgical (PTX) peut être utilisé chez les rats ^{2, 3, 4, 5,} et les grands mammifères ^{6, 7, 8,} il est techniquement très difficile chez la souris en raison de la petite taille des glandes et leur répartition anatomique variables ^9. Par conséquent, thyro-parathyroïdectomie (TPTX) est généralement effectuée chez la souris, dans laquelle la thyroïde et les glandes parathyroïdes sont enlevés ensemble ^10. Cependant, les niveaux d'hormones thyroïdiennes faibles sont un facteur de confusion potentiel dans des expériences, ce qui complique ce modèle. En outre, les cellules C au sein de la glande thyroïde, qui produisent de la calcitonine, une hormone importante dans l'homéostasie du calcium chez les rongeurs, sont également perdues lors du retrait de la ièmeyroids ^11.

Plusieurs modèles de souris génétiques de l' hypoparathyroïdie existent, qui comprennent la souris ^PTH-12 null, la GCM2 nulle souris ¹³ et la souris Nuf avec une mutation activatrice du récepteur sensible au calcium (CaSR) ^{14, 15.} Cependant, ces anomalies génétiques sont déjà présents au cours du développement embryonnaire, et la fonction des parathyroïdes est donc déjà altérée au cours de l'embryogenèse. Ceci peut affecter le développement des organes tels que le squelette. Cela contraste avec les patients avec hypoparathyroïdie postopératoires qui acquièrent la maladie plus tard dans la vie. En outre, certains de ces modèles de souris présentent une létalité précoce et une fertilité réduite, ce qui complique davantage leur utilisation ^{12, 13, 14.}

Nous avons développé deux nouveaux m de la sourisodèles pour hypoparathyroïdie acquise. En utilisant des souris transgéniques qui expriment la GFP spécifiquement dans les glandes parathyroïdes permet parathyroïdes d'être facilement identifiés pour l'ablation chirurgicale sans enlever la glande thyroïde. Cette souris a été générée par croisement de souris Cre-PTH, qui exprime la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur de 5,5 kb PTH ¹⁶ avec la souris ROSA ^MTMG. Les PTHcre résultant; souris MTMG expriment la protéine fluorescente verte spécifiquement dans les cellules parathyroïdes. Le second modèle de souris utilise le même PTH-Cre, cette fois pour retirer une cassette d'arrêt de la souris DTR inductible, ayant pour résultat l'expression du récepteur de la toxine diphtérique spécifiquement dans les glandes parathyroïdes. L'administration systémique de DT détruit les cellules parathyroïdes, ce qui rend les animaux hypoparathyroid sans chirurgie.

Les deux modèles de souris présentés dans cette étude démontrent un phénotype hypocalcémiant stable au cours des péri d'observation de trois moisod. Les procédures sont faciles à réaliser, le phénotype est reproductible, et les souris hypoparathyroid présentent un taux ¹⁷ de survie élevé.

Protocol

Cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Hôpital général du Massachusetts. Obtenir l'approbation institutionnelle appropriée pour cette étude sur des animaux avant de commencer. Certaines techniques peuvent être ajustées en fonction des besoins locaux IACUC.

1. Les souris GFP-PTX

1. Obtenir des souris PTHcre ⁺ et les souris Rosa-MTMG à 8 - 10 semaines d' âge pour de plus amples accouplement.
2. Rétrocroisement les PTHcre ⁺ souris (mixtes 129; FVB arrière - plan) avec C57BL / 6 pour 6 générations pour obtenir des souris avec des souris C57BL / 6 fond.
3. Souris Inbreed PTHcre ⁺ pour obtenir PTHcre ^{+ / +} souris ^17.
   REMARQUE: Pour effectuer le génotypage, extraire l'ADN de la pointe de la queue et de l'utiliser pour la PCR. Les amorces de PCR pour vérifier les hétérozygotie et homozygotes du transgène PTHcre sont les suivantes: l'amorce A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, amorce inverse A ', TCAGATCACACCACACAGCA forward amorce B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, amorce inverse B ', GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT ^17.
4. Cross PTHcre ^{+ / +} souris ¹⁶ avec Rosa-MTMG souris ^18. Sevrage PTHcre; chiots MTMG à l'âge de 4 semaines.
5. Anesthetize 8 - 10 semaines PTHcre; souris MTMG par injection ip de tribromoéthanol (Avertin) à 0,6 mg / g de poids corporel, ou d'autres agents tels que la kétamine / xylazine. Utiliser la buprénorphine 0,1 mg / kg sc toutes les 12 h comme analgésique pendant 48 heures après la chirurgie selon un protocole approuvé. Veiller à la profondeur appropriée de l'anesthésie par le réflexe pincement de l'orteil de retrait ou d'autres moyens. Placer l'animal dans la position couchée.
6. Étendre et préparer la région du cou ventral par le rasage de la peau en utilisant des lames de bord simples. Désinfecter la peau rasée avec un tampon antiseptique povidone iodée.
7. Couvrir l'animal avec des champs opératoires stériles pour réduire la contamination du site chirurgical et utiliser micro autoclavérosurgical instruments pour l'intervention chirurgicale.
8. Couper une incision longitudinale de 2 cm dans la peau avec un scalpel chirurgical. Disséquer fascia et pousser les glandes salivaires sur le côté par dissection avec des pinces dentelées incurvées.
9. Sous le microscope de dissection en utilisant la lumière halogène et un 4 - grossissement 5X, couper et séparer les muscles paratrachéaux en utilisant des pinces acérées conseils et exposer la trachée.
10. Identifier la glande thyroïde avec le lobe de gauche à droite et situé à côté de la trachée.
11. Mettez la source de lumière à la lumière fluorescente et de visualiser les deux glandes parathyroïdes vert-fluorescent.
    NOTE: En règle générale, les deux glandes parathyroïdes sont situés à ou près de la surface de la glande thyroïde, mais parfois, ils sont situés plus loin.
12. Retirez délicatement les glandes parathyroïdes verts à l'aide de pinces chirurgicales et ciseaux. Utiliser de la gaze stérile pour l'hémostase et de vérifier soigneusement le long de la trachée afin d'assurer que tous les tissus vert a été supprimé.
13. Fermez les muscles paratrachéaux par suture interrompue en utilisant 6-0 polyglactine 910 sutures. Fermer l'incision de la peau par une suture Halsted en utilisant 6-0 polyglactine 910 sutures.
14. Facultatif: Injecter 10 ul / g de poids corporel d'une solution de chlorure de sodium stérile normale à 0,9% aux souris pour le remplacement du fluide.
15. Placer les animaux dans une cage postchirurgicales séparée sur un incubateur à chaud (37 ° C) pour la récupération de la température corporelle. Une fois que les souris sont éveillés et en position couchée, mettre culot chow et de l'eau avec de la nourriture de la gélatine sur le sol de la cage.
16. Après une période d'observation postopératoire de 2 h, retournez la souris à l'animalerie et de suivre les exigences locales en matière de soins postopératoires.
17. 3 jours après parathyroïdectomie, obtenir 10 ul sang de la queue et de mesurer le sang ionisé Ca ⁺⁺ en utilisant un analyseur tel que le système de gaz du sang Ca ⁺⁺ / pH de l' analyseur. Les résultats de la parathyroïdectomie réussies dans le sang ionisés Ca ⁺⁺ inférieure ou égale à -2SD de sham-exploité conDes souris TROL (1,20 mmol / L dans nos expériences de n = 30).

2. PTH-Cre-IDTR Souris

1. Obtenir PTHcre ⁺ et DTR ^{fl / fl} souris à 8 - 10 semaines d' âge pour l' accouplement.
2. Rétrocroisement les souris PTHcre (mixtes 129; FVB arrière-plan) avec C57BL / 6 pour 6 générations pour obtenir des souris avec des souris C57BL / 6 fond.
3. Inbreed le PTHcre ⁺ (C57BL / 6 arrière - plan) des souris pour obtenir PTHcre ^{+ / +} souris ^17.
   REMARQUE: Pour effectuer le génotypage, l'ADN de souris queue conseils a été extrait et utilisé pour la PCR. Amorces génotypage: l'amorce A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, inverser l' amorce A ', TCAGATCACACCACACAGCA, l'amorce B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, reverse B primer', GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT ^17.
4. Compagnon PTHcre ^{+ / +} souris ¹⁶ avec DTR ^{fl / fl 19} souris pour obtenir des souris PTHcre-IDTR.
5. Préparer la solution DT en diluant diphtheriune poudre de toxine avec une solution saline stérile à une concentration de 0,5 ug / ml. filtre stérile, et stocker des aliquotes à -80 ° C.
6. Choisissez 8 - 10 semaines souris PTHcre-IDTR pour expérience d'injection. Décongeler DT aliquote à température ambiante, on administre par voie intrapéritonéale DT à 5 ug / kg (10 ul / g) de poids corporel de l'animal. Pour une efficacité maximale et moins de toxicité, l' administration DT est répétée pour un total de 2 injections dans un intervalle de 3 jours ^17.
7. 3 jours après la seconde injection, prendre 10 pi queue sang de chaque PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR-MTMG souris et mesurer Ca ⁺⁺ dans le sang en utilisant un système Ca gaz sanguins ⁺⁺ / pH analyseur.
   REMARQUE: On définit les souris avec du sang ionisés Ca ⁺⁺ inférieure à 1,18 mmol / L de souris hypoparathyroid, ce qui correspond 2SD inférieure à la moyenne des souris témoins véhicule à injection (n = 22).

Results

Emplacement de la parathyroïde Glands

Tout d'abord, nous avons enregistré la répartition des glandes parathyroïdes de 54 souris PTHcre-MTMG comme observé sous la dissection microscope à fluorescence. 74% (40/54) des souris avait deux glandes parathyroïdes verts (Figure 1A, C, E), 26% (14/54) des souris avait une troisième glande parathyroïde supplémentaire (figure 1B, D, F). Pas de souris avec une seule glande ou plus de trois glandes ont été observées. Habituellement, les glandes parathyroïdes étaient situés près de la frontière supérieure de la glande thyroïde (58%, 71/122; Figure 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3)). 27% (33/122) glandes étaient situées près de la frontière inférieure de la glande thyroïde (figure 1C (1), D (3), F (1)), et 13% (16/122) étaient situés loin de la tglande hyroid (figure 1B (3), E (1), F (2)). Nos résultats sont cohérents avec et étendent les résultats antérieurs des emplacements des glandes parathyroïdes ²⁰ variables.

Les souris GFP-PTX

La chirurgie entière de l'anesthésie à la fermeture de l'incision de la peau a pris environ 20 min par souris. Le taux de souris postopératoires sur une période d'observation de 3 mois de survie était de 96,3% (53/55). 92,4% (49/53) des souris GFP-PTX présentaient des niveaux de calcium ionisé qui étaient 2 SD en dessous de la moyenne des souris témoins opérés de manière fictive ou inférieure. Le phénotype hypoparathyroid chez les souris GFP-PTX (hypocalcémie, faible PTH et de phosphate sérique) était stable pendant toute la durée d'observation de 3 mois. Fait important, la fonction thyroïdienne était pas différents des animaux opérés de manière fictive 3 mois après la chirurgie (TSH = 42 ± 24 vs 30 ± 15 mU / L, p = 0,171; T4 = 30,0 ± 0,6 vs 3,1 ± 0,9 mg / dl, p = 0,707 (figure 2).

PTH-cre-IDTR Souris

DT souris injectées PTH-Cre-IDTR hypoparathyroïdie développé (calcium ionisé artérielle basse, élevée de phosphore dans le sang, et le taux de PTH trop bas à la normale). Nous avons précédemment rapporté que des cellules positives à quelques PTH échapper à l'ablation par la toxine diphtérique, expliquant la PTH circulant mesurable et donc le phénotype peu plus doux de ces souris ^17.

Hypoparathyroïdie chez la souris GFP-PTX et PTH-cre-IDTR Souris

Des réductions significatives de Ca ⁺⁺ dans le sang et le taux de PTH sérique ont été observées chez les souris PTX-GFP 3 jours après l' intervention chirurgicale, par rapport aux niveaux observés chez les souris opérés de manière fictive (Ca ⁺⁺ = 1,05 ± 0,40 vs. (figure 3A, réimprimé avec la permission de (référence n ° 17)). Après 2 injections de 5 ug / kg DT à 3 jours d'intervalle, une dose et un régime optimisé pour utiliser le moins de DT pour donner le phénotype hypoparathyroid maximal, DT injecté les souris de IDTR PTH-Cre a montré une hypocalcémie significative et la PTH réduit par rapport à souris de contrôle du véhicule, qui ont persisté au cours de la période d'observation de 90 jours (Ca ⁺⁺ = 1,10 ± 0,07 mmol / l vs 1,26 ± 0,05 mmol / l, p <0,05; PTH = 218 ± 156 pg / ml vs 572 ± 164 pg / mL, p <0,05) (figure 3B, réimprimé avec la permission de (référence n ° 17)).

Figure 1: (A, C, E) ou trois (B, D, F) , les glandes parathyroïdes verts. La plupart des glandes parathyroïdes sont situés près de la frontière supérieure (A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3) ou à proximité du bord inférieur de la glande thyroïde (C (1), D (3), F (1)). Dans de rares cas, certains étaient situés ectopique (B (3), E (1), F (2)). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: TSH et T4 Niveau de souris GFP-PTX. 3 mois après la GFP-PTX, le sérum a été obtenu pour la TSH et T4 Measurem ents. GFP-PTX les souris ont montré des concentrations de TSH (42 ± 24 mU / L) (A) et T4 concentrations (3,0 ± 0,6 mg / dl) (B) qui ne diffèrent pas de souris témoins (TSH = 30 ± 15 mU / L, p = 0,171, n = 11, T4 = 3,1 ± 0,9, p = 0,707, n = 11). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Blood Ca ⁺⁺ et taux de PTH chez la souris GFP-PTX et DT Injecté Souris-IDTR PTH-Cre. Les deux souris GFP-PTX (A) et DT injecté PTH-Cre-IDTR souris (B) ont présenté une hypocalcémie stable et réduit le taux de PTH sur 3 période d'observation mois (N = 6-8, *** p <0,001) (re-imprimé avec la permission de la référence n ° 17).es / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Nous démontrons la technique de parathyroïdectomie GFP-guidée en utilisant des souris transgéniques avec expression de la GFP sélectivement dans les glandes parathyroïdes. Dans les PTHcre; souris MTMG, la double fluorescence (la GFP verte dans les cellules Cre-exprimés et rouge tomate dans la non-Cre cellules exprimé) nous a permis d'identifier clairement, et d'éliminer précisément toutes les glandes parathyroïdes sans enlever les thyroïdes. Alors que nous préférons l'utilisation de la double-fluorescence des souris MTMG pour la capacité d'identifier les tissus non-parathyroïdienne rouge fluorescent, notre procédure devrait aussi bien fonctionner en utilisant des animaux fluorescents simples tels que le rouge de la tomate (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) souris. La procédure est relativement facile à réaliser, nécessite environ 20 min par souris, et se traduit par un phénotype sévère hypoparathyroid et durable.

En outre, un autre avantage des glandes parathyroïdes positives à GFP est la facilité de détection des glandes parathyroïdes aberrantes. Nos études démontrentmauvaise localisation des parathyroïdes dans environ un quart des souris B6 (Figure 1), qui sont facilement détectés dans notre modèle de souris par la fluorescence verte. Contrairement à ce que thyro-parathyroidectomie, notre technique évite le retrait de la thyroïde avec un besoin ultérieur pour le remplacement de l'hormone de la thyroïde et de l'effet connu de la suppression de cellules C thyroïdiennes calcitonine productrices. parathyroïdes marquées par fluorescence peuvent aussi être utilisés pour d'autres investigations qui nécessitent l'isolement des glandes parathyroïdes. La limitation de ce modèle comprend l'exigence d'une intervention chirurgicale. compétences de microchirurgie de base et d'un microscope de dissection avec une source de lumière fluorescente sont nécessaires.

Une seconde technique pour générer des souris hypoparathyroid qui élimine la nécessité d'une intervention chirurgicale est mise en évidence. Toxine diphtérique-souris traitées PTHcre-IDTR présentent une hypoparathyroïdie phénotype plus doux, mais exigent simplement injecter DT par voie intrapéritonéale à la souris. La partie critique for génère ce modèle a été l'optimisation de la dose et le régime posologique. Des doses élevées de DT ont conduit à la toxicité, mais de faibles doses ont diminué l'efficacité de l'approche. Nous avons déterminé que le régiment de dose de 2 injections à 5 ug / kg, administrée 3 jours d'intervalle, a donné lieu à une hypocalcémie fiable et stable sans mortalité / minimal.

En fin de compte, nous espérons que ces deux approches offrent des modèles de souris utiles pour hypoparathyroïdie acquise. L' utilisation d' un roman PTH longue durée d'action, nous avons rapporté la première utilisation de ces deux modèles pour déterminer l'efficacité de nouveaux médicaments pour hypoparathyroïdie ^17.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
souris ROSAmT/mG	The Jackson Laboratory	7676
Souris PTH-Cre	The Jackson Laboratory	5989
iDTRmice	The Jackson Laboratory	7900
6-0 polyglactin 910 suture avec aiguille	Ethicon, Inc	J510G
Safety Single Edge Razor Blades	American Safety Razor Company	66-0089
Scalpel jetable	Feather Safety Razor Co., LTD	72042-11
Povidone-Iodine Prep Pads	Dynarex Corporation	1108
Ply	gaze Busse. Inc	BHD707
chlorure de sodium à 0,9 %	HOSPIRA Worldwide, Inc	07983-09
1 mL 29 g Seringue à insuline	BECTON DICKINSON	329622
Champs chirurgicaux d’incisée	3M	6640EZ
Dumstar Pince de biologie	Roboz Surgical Instrument Co., Inc	RS-4984
Micro Dissection Ciseaux à ressort	Roboz Surgical Instrument Co., Inc	RS-5605
Porte-aiguille	MILTEX.,Inc	V98-42
2,2,2-Tribromethanol	Sigma-Aldrich	T48402
2-Methyl-2-Butanol	Sigma-Aldrich	152463	Pour dissoudre le 2,2,2-Tribromethanol
Diphtérie Toxine Poudre	Sigma-Aldrich	D0564	Dissoudre dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 % à 1 mg/mL sous forme de solution mère en -80 ° ; C
Multicap Collection de sang Tubes capillaires	Siemens Healthcare Diagnostics Ltd	855578	Pour la collecte de sang dans l’analyse iCa2+ à l’aide de RapidLab 348 Analyseur de Ca2+/pH
RapidLab 348 Ca2+/pH	Siemens Healthcare		Pour l’analyse iCa2+