Une méthode pour mesurer le métabolisme dans des communautés triées sous-populations cellulaires complexes Utilisation Stable Isotope Tracing

Summary

Cet article décrit une méthode d’étude du métabolisme cellulaire dans des communautés complexes de plusieurs types de cellules, en utilisant une combinaison de traçage d’isotopes stables, de tri cellulaire pour isoler des types de cellules spécifiques et de spectrométrie de masse.

Abstract

Les types de cellules de mammifères présentent un métabolisme spécialisé, et il existe de nombreuses preuves que divers types de cellules coexistants s’engagent dans une coopération métabolique. De plus, même les cultures d’un seul type de cellule peuvent contenir des cellules dans des états métaboliques distincts, tels que des cellules au repos ou cycliques. Les méthodes de mesure des activités métaboliques de ces sous-populations sont des outils précieux pour comprendre le métabolisme cellulaire. Les populations cellulaires complexes sont le plus souvent séparées à l’aide d’un trieur de cellules, et les sous-populations isolées par cette méthode peuvent être analysées par des méthodes métabolomiques. Cependant, un problème avec cette approche est que la procédure de tri cellulaire soumet les cellules à des stress qui peuvent fausser leur métabolisme.

Pour surmonter ces problèmes, nous avons estimé que les distributions isotopomères de masse (MID) des métabolites provenant de cellules cultivées avec des nutriments marqués à des isotopes stables sont susceptibles d’être plus stables que les concentrations absolues de métabolites, car les MID se forment sur des échelles de temps plus longues et devraient être moins affectées par une exposition à court terme aux conditions de tri cellulaire. Nous décrivons ici une méthode basée sur ce principe, combinant le tri cellulaire avec la chromatographie liquide-spectrométrie de masse à haute résolution (LC-HRMS). La procédure consiste à analyser trois types d’échantillons : (1) des extraits de métabolites obtenus directement de la population complexe ; (2) des extraits de cellules « triées fictives » sont passés par l’instrument de tri de cellules sans exclure une population spécifique ; et (3) des extraits des populations réellement triées. Les cellules triées fictives sont comparées à l’extraction directe pour vérifier que les MID ne sont effectivement pas modifiés par la procédure de tri cellulaire elle-même, avant d’analyser les populations réellement triées. Nous montrons des exemples de résultats de cellules HeLa triées selon la phase du cycle cellulaire, révélant des changements dans le métabolisme des nucléotides.

Introduction

les organismes supérieurs contiennent des communautés complexes de types cellulaires distincts qui collaborent pour réaliser des fonctions plus complexes. Par exemple, les tumeurs contiennent non seulement les cellules cancéreuses, mais aussi des fibroblastes, des cellules qui constituent les vaisseaux sanguins et de cellules immunitaires souvent infiltrats ^1; sang contient un mélange complexe de plusieurs dizaines de sous - types de cellules immunitaires ^2; et même des lignées cellulaires cultivées peuvent être constituées de plusieurs sous - populations, comme l'luminale et les sous - types de base de cellules de ....

Protocol

1. Métabolite Extraction

1. Extraction du plat
   1. les cellules de culture dans une plaque à 6 puits en triple dans isotope marqué les milieux de culture stables + suppléments dialysés (sérum ou autres suppléments de croissance) jusqu'à ce que les cellules deviennent 75% confluentes.
      Remarque: ici , la culture des cellules HeLa pendant 48 h dans un milieu RPMI contenant 40% U- ¹³ C-glucose et 70% U- ¹³ C, ¹⁵ N2-glutamine et 5% de FBS dialyse (sérum bovin fœtal). Dialysée FBS est utilisé pour se débarrasser des petits métabolites de poids moléculaire qui pourrait contaminer les médias étiquetés. La cu....

Results

A titre d'exemple, nous décrivons ici une expérience d'instruction du métabolisme des cellules HeLa triés en fonction de la phase du cycle cellulaire. Étiqueter un large éventail de métabolites centraux sur les deux atomes de carbone et des atomes d' azote, on a cultivé les cellules pendant 48 heures en utilisant U- ¹³ C-glucose et U- ¹³ C, ¹⁵ N-glutamine comme traceurs. Pour obtenir MID riche pour l'expérience de validation, on a choisi ici un mélange de.......

Discussion

Notre méthode est basée sur le principe que MIDs dans les métabolites cellulaires reflètent l ' «histoire» des activités métaboliques d'une cellule. Ceci permet d'étudier les activités métaboliques dans les sous- population de cellules, car ils se sont produits dans le milieu complexe de cellules, préalablement à la procédure de tri cellulaire. En revanche, les zones de pointe de métabolites diffèrent sensiblement entre les extraits de cellules triées et extraction directe à partir de la boîte de culture

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H6648
INFLUX (trieur inFlux v7)	BD Biosciences
U-13C-Glucose	isotopes Cambridge	40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-Glutamine	Cambridge isotopes	CNLM-1275-H-0.1
Méthanol (JT Baker), grade HPLC	VWR	BAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV Filtres centrifuges. Durapore PVDF 0.1 & micro ; m	Millipore	UFC30VV00
Ultimate 3 000 UHPLC	Thermo Fisher scientific
Q-Exactive Spectromètre de masse Orbitrap	Thermo Fisher scientific
Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4,6   ; mm, 5 et micro ; m)	Merck KGaA	1.50444.0001
Colonne de garde Merk-Sequant ZIC HILIC (20 mm x 2,1 mm)	Merck KGaA
Acétonitrile Optima LC-MS, verre ambré	Fisher Scientific	A955-212
Milli-Q water	Millipore		Produit avec un système Milli-Q
Gradient Myrsyra 99,5 % Optima (acide formique)	Fisher Scientific	11423423
X100 Flacon à vis 1,5 ml, 8-425 32x11,6 mm, ambre, 100 unités	Thermo Fisher scientific	10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Bouchons à vis)	Thermo Fisher scientific	12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix	Sigma-Aldrich	MSCAL5	Kit d’étalonnage
SNAKESKIN 10K MWCO  ;	Thermo Fisher scientific	88245
Mathematica v.10  ;	Recherche