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La méthode ChIP-exo: Identification de protéine-ADN Interactions avec les environs de Base Paire de précision

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DOI :

10.3791/55016

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23 décembre 2016

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole permettant d’obtenir une résolution proche de la paire de bases des interactions protéine-ADN. Ceci est obtenu par un traitement à l’exonucléase de fragments d’ADN enrichis sélectivement par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-exo) suivi d’un séquençage à haut débit.

Résumé

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est un outil indispensable dans les domaines de l'épigénétique et la régulation des gènes qui isole les interactions spécifiques protéine-ADN. ChIP couplé à un séquençage à haut débit (ChIP-seq) est couramment utilisé pour déterminer la localisation génomique des protéines qui interagissent avec la chromatine. Cependant, ChIP-seq est entravée par résolution relativement faible de la cartographie de plusieurs centaines de paires de bases et le signal de fond élevé. La méthode ChIP-exo est une version raffinée de ChIP-seq qui améliore sensiblement à la fois la résolution et le bruit. La distinction clé de la méthodologie ChIP-exo est l'incorporation de lambda exonucléase digestion dans le flux de travail de préparation de la bibliothèque Footprint efficacement la gauche et droite 5 frontières 'ADN du site de réticulation de protéine-ADN. Les bibliothèques de copeau exo sont ensuite soumis à un séquençage à haut débit. Les données obtenues peuvent être mis à profit pour fournir des aperçus uniques et ultra-haute résolution dans l'organisation fonctionnelle of génome. Ici, nous décrivons la méthode ChIP-exo que nous avons optimisé et rationalisé pour les systèmes de mammifères et de prochaine génération plate-forme de séquençage par synthèse.

Introduction

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une méthode puissante pour étudier les mécanismes de régulation des gènes en enrichissant sélectivement des fragments d'ADN qui interagissent avec une protéine donnée dans les cellules vivantes. Méthodes de fragments d'ADN ChIP enrichi de détection ont évolué comme la technologie améliore, de la détection d'un seul locus (standard ChIP-qPCR) pour hybridation sur microréseaux d'oligonucléotides (ChIP-chip) à séquençage à haut débit (ChIP-seq) 1. Bien que ChIP-seq a vu une large application, l'hétérogénéité de la chromatine et les interactions d'ADN non spécifiques ont entravé la qualité des données conduisant à des faux positifs et la cartographie imprécise. Pour contourner ces limitations, le Dr Frank Pugh a développé la méthode ChIP-exo 2. Le trait saillant de ChIP-exo est qu'il intègre un 5 'à 3' exonucléase, Footprinting efficacement des emplacements de liaison du facteur de transcription. Par conséquent, la méthode ChIP-exo obtient une résolution plus élevée, une plus grande plage dynamique de detection, et le bruit de fond inférieur.

Bien que ChIP-exo est techniquement plus difficile à maîtriser que ChIP-seq, il est largement adopté comme études visent à mieux comprendre à haute résolution ultra uniques en utilisant des systèmes biologiques divers 3-8. En effet, ChIP-exo a été appliquée avec succès à des bactéries, des levures, la souris, le rat et les systèmes cellulaires humains. Comme preuve de principe, ChIP-exo a été initialement utilisé pour identifier le motif de liaison précis pour une poignée de facteurs de transcription de levure 2. La technique a également été utilisée dans la levure pour étudier l'organisation du complexe de pré-initiation de transcription, et à déchiffrer la structure subnucleosomal de diverses histones 9,10. Plus récemment, nous avons tiré parti ChIP-exo pour résoudre TFIIB adjacente et Pol II événements à des promoteurs humains de liaison, et montré que la transcription divergente répandue découle de complexes d' initiation distincts 11.

Le flux de travail présenté ici est optimisé et streamlined pour les mammifères ChIP-exo (Figure 1). Tout d' abord, les cellules vivantes de cultures primaires ou de tissus sont traités avec du formaldéhyde pour préserver dans les interactions protéine-ADN in vivo grâce à une réticulation covalente. Les cellules sont lysées et la chromatine cisaillées à environ 100 - 500 paires de bases de fragments de taille. ChIP puis enrichit sélectivement des fragments d'ADN réticulés à la protéine d'intérêt. A ce stade, les bibliothèques de copeau suivants sont préparés typiquement, ce qui limite inhérente à la résolution de détection de la taille moyenne des fragments de quelques centaines de paires de bases. Cependant, ChIP-exo surmonte cette limitation en coupant le droit 5 frontières 'ADN du site de réticulation de protéine-ADN avec lambda exonucléase et gauche. bibliothèques de séquençage sont ensuite construits à partir de exonucléase ADN digéré comme détaillé ci-dessous. Les frontières imbriquées 5 'résultantes représentent une empreinte in vivo de l'interaction protéine-ADN (figure 1, étape 14), et sont détectées par séquençage à haut débit. Although la méthodologie ChIP-exo est plus impliqué que ChIP-seq, les transitions entre la plupart des étapes nécessite le lavage des billes simple, qui minimise la perte d'échantillonnage et de la variabilité expérimentale. Il est important, puisque ChIP-exo est une version raffinée de ChIP-seq, tout échantillon qui a du succès avec ChIP-seq devrait également avoir du succès avec ChIP-exo.

L'empreinte des interactions protéine-ADN avec des résultats ChIP-exo dans une structure de données fondamentalement distinctes de ChIP-seq in vivo. Bien que les appelants ChIP-seq communs peuvent être appliquées à des données ChIP-exo, pour obtenir des appels de pointe les plus précis, nous recommandons des outils bioinformatiques spécifiquement conçus avec la structure unique de données ChIP-exo à l'esprit. Ceux - ci comprennent Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla et ExoProfiler 12-15.

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Protocole

Note: Double H 2 O distillée ou équivalent moléculaire de qualité est recommandé pour tous les tampons et les réactions mélanges.

Jour 0: Préparation du matériel et Cell récolte

1. Préparation du tampon

  1. Préparer Lysis Tampons 1 - 3 (tableaux 1 - 3) et ajouter 100 pi complète inhibiteur de protéase stock (IPC) à 50 ml de chaque tampon juste avant l'utilisation. Préparer IPC en dissolvant un comprimé dans 1 ml de grade moléculaire H 2 O.
  2. Préparer ChIP Tampons (tableaux 4 - 7). Ajouter 100 pi IPC disponible à 50 ml de blocage et des tampons RIPA. Ne pas ajouter de l'IPC à Tris et ChIP Elution tampons.

2. Recuit de l'adaptateur Oligonucleotides

Remarque: des séquences d'oligonucléotides spécifiques peuvent être trouvées dans la section Informations supplémentaires.

  1. Préparer les mélanges Adapter Recuit (tableaux 8 - 9). Vortex pour mélanger et brièvementtourner les tubes pour recueillir le contenu. Aliquoter 100 pi de chaque mélange dans 0,5 ml tubes.
  2. Hybrider les oligonucléotides en exécutant le programme (tableau 10) dans le thermocycleur.
    Magasin recuite oligonucléotides à -80 ° C.

3. chromatine in vivo Reticulation avec du formaldéhyde

NOTE: Pour une expérience de ChIP typique, la matière de départ doit contenir environ 50 millions de cellules.

  1. Ajouter frais formaldehyde solution mère sans méthanol 37% à tampon phosphate salin (PBS) lavé culture cellulaire à une concentration finale de 1% (v / v), bien mélanger et laisser reposer à température ambiante pendant 10 min.
    REMARQUE: par exemple, on ajoute habituellement 1,4 ml de 37% de formaldéhyde sans méthanol à des cellules dans 50 ml de PBS température ambiante. Aussi, évitez de formaldéhyde de réticulation dans les médias car les protéines dans les médias étancher une partie du formaldéhyde.
  2. Quench réaction de réticulation en ajoutant 2,5 M glycinee pour une concentration finale de 125 mM. Bien mélanger.
  3. Transfert des cellules à 50 ml tube sur la glace. Spin cellules pendant 5 min à 1000 xg à 4 ° C. Décanter le surnageant.
  4. Ajouter 1 ml glacée 1x PBS à culot cellulaire et remettre en suspension par pipetage. Transfert à 1,5 ml tube.
  5. Spin cellules pendant 3 min à 2000 xg à 4 ° C. surnageant Aspirer.
  6. Congeler immédiatement à clignoter les culots cellulaires dans des tubes de 1,5 ml avec de l'azote liquide. Conserver à -80 ° C. cellules réticulés sont stables indéfiniment à -80 ° C.

Jour 1: Lyse cellulaire, sonication et ChIP

4. Lyse cellulaire

REMARQUE: Pendant toutes les sections de lyse cellulaire, les échantillons doivent être conservés sur la glace ou à 4 ° C pour minimiser l'inversion réticuler.

  1. Brièvement dégeler culot cellulaire réticulé. Bien resuspendre chaque culot dans 0,5 ml de tampon de lyse 1 et combiner avec 4,5 ml Lysis Buffer 1 dans un tube de 15 ml de polystyrène.
  2. tubes Rock pendant 10 min à 4 ° Cpour une plate-forme à bascule. Spin pendant 4 min à 2000 xg à 4 ° C. Décanter le surnageant.
  3. Bien resuspendre chaque culot dans 0,5 ml Lysis Buffer 2 et ajouter 4,5 ml Lysis Buffer 2 fois remis en suspension.
  4. Roche pendant 5 min à 4 ° C sur une plate-forme à bascule. Spin pendant 5 min à 2000 xg à 4 ° C. Décanter le surnageant et tapotez doucement l'excès sur une serviette en papier.
  5. Bien resuspendre chaque culot dans 0,5 ml Lysis Buffer 3 et ajouter 1 ml Lysis Buffer 3 fois remis en suspension. Gardez lysats nucléaires sur la glace et procéder immédiatement à sonication.

5. La sonication des lysats nucléaires

REMARQUE: Pendant toutes les sections de sonication, les échantillons doivent être conservés dans la glace afin de minimiser l'inversion réticuler. Le modèle spécifique de sonicateur utilisé en association avec le protocole ci-dessous peut être trouvé dans la Table des Matières. Détails sur l'utilisation et les lignes directrices pour d'autres instruments sonicator spécifiques peuvent être trouvés dans la section Informations supplémentaires.

  1. PLace adaptateurs de résonance dans 15 ml tubes de polystyrène contenant des extraits nucléaires (la barre métallique ne doit pas toucher la paroi du tube).
  2. lysats nucléaires de sonication dans un bain d'eau froide de la glace pendant 2 x 15 sessions min avec 30 sec ON / OFF 30 sec à puissance moyenne. soniquer seulement deux tubes de 15 ml à la fois. Ces paramètres fonctionnent sur un large éventail de lignées cellulaires et types de cellules primaires, mais une optimisation supplémentaire peut être nécessaire si le cisaillement de la chromatine est incomplète.
  3. Pour vérifier les résultats de la sonication, le transfert 2 x 10 échantillons ul de lysat en tubes de 1,5 ml.
    1. À inverser reticulations, mélanger la première aliquote de 10 pi avec 10 pi de TE-RNAse A et 0,2 pl de proteinase K. On incube à 37 ° C pendant 30 min. Ajouter 4 pl 6x colorant d'ADN de xylène.
    2. Pour préserver réticulations, combiner la seconde partie aliquote de 10 pi avec 2 pl 6x colorant d'ADN de xylène.
    3. Exécuter à la fois des échantillons sur un gel d'agarose à 1,5% à 140 V pendant environ 30 - 45 min jusqu'à ce que le colorant de bromophénol dans l'échelle is ¾ de la descente du gel.
  4. Si la sonication était (la plupart des fragments d'ADN cisaillé à 100-500 pb), transféré à une sonication lysats tubes de 2 ml contenant 150 ul de 10% de Triton X-100. Vortex pour mélanger.
  5. Pour sédimenter chromatine insoluble et les débris, le spin soniquée lysat nucléaire pendant 10 min à 20 000 xg à 4 ° C.
  6. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2 ml. Procéder immédiatement à des échantillons de ChIP ou stocker à -80 ° C indéfiniment. des extraits soniqués ne doivent pas être congelées et décongelées deux fois.

6. Le couplage des anticorps à des billes

REMARQUE: Ne jamais vortex ou de gel / dégel des billes magnétiques car ils briseront et augmenter le signal de fond.

  1. Après avoir mélangé à fond boursier, aliquote Y ul perles suspension dans 1,5 ml tube où Y = 1,1 x 2,5 pi x (nombre d'échantillons de ChIP). Reliure capacité de 2,5 pi bourrelet suspension est jusqu'à 13 pg d'IgG. Lavez perles mises en commun 3x avec 1 ml de blocageTampon.
  2. Pour aliquotage plus cohérente des billes après lavages, perles de resuspendre dans 10x volume de boue d'origine (25 pl / ChIP) avec tampon de blocage. Aliquote de 25 ul par échantillon ChIP dans 1,5 ml tubes.
  3. Ajouter 5 - 10 pg d'anticorps à aliquote de billes de remettre en suspension correspondante. Apportez volume final de 250 pi avec un tampon bloquant. Incuber les échantillons pendant 4 heures (alternativement, pendant la nuit pendant 16 heures) sur une plate-forme tournante à 4 ° C.
  4. surnageant Aspirer. Pour retirer l'anticorps non lié ou d'excès, se laver les perles une fois avec 1 ml de tampon de blocage.
  5. Après aspiration dernier lavage, ajouter immédiatement 50 millions d'équivalents cellulaires d'extraits soniquées (~ 1,6 ml) à l'anticorps: conjugués de perles. Si extraits soniquées ne sont pas prêts, perles de remettre en suspension dans 100 pi de tampon de blocage jusqu'à ce qu'ils soient prêts. Il est essentiel de ne jamais laisser les perles sèches.

7. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

  1. Pour chaque échantillon de ChIP, mélanger 1,5 ml de sonicationextraits d 'anticorps avec: conjugués de perles dans 1,5 ml ou 2 ml tubes.
  2. Incuber les tubes sur un rotateur mini-tube de la nuit (environ 16 h) au réglage de la vitesse de 9 à 4 ° C. Vérifiez après quelques minutes afin que les échantillons ne fuient pas et se mélangent bien.

Jour 2: ChIP Washes et sur résine Enzymatic Réactions

8. ChIP Washes

NOTE: Afin de minimiser la contamination croisée, brièvement tourner les tubes entre chaque lavage. Pour la première aspiration, changer des conseils entre chaque échantillon. Pendant les lavages suivants, la même pointe peut être utilisé tant qu'il n'a pas touché les perles. Voir la section Informations supplémentaires pour les directions sur le lavage des ChIP appropriée.

  1. Très centrifuger brièvement les tubes en utilisant une microcentrifugeuse (~ 3 sec à 500 g) pour recueillir le liquide dans les calottes et les placer sur la grille magnétique pendant 1 min. Tout en restant sur la grille magnétique, extrait de aspirée.
  2. Ajouter 0,75 ml RIPA tampon à chaque tube. Retirer les tubes de support magnétiqueet inverser plusieurs fois pour mélanger. Remplacer les tubes sur la grille magnétique et aspirer le surnageant. Répétez 7x.
  3. Ajouter 0,75 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) à chaque tube. Retirer les tubes de support magnétique et inverser plusieurs fois pour mélanger. Remplacer les tubes sur la grille magnétique et aspirer le surnageant. Répéter 2x.
  4. Après aspiration dernier lavage, passez à polir.
    Remarque: Après chaque réaction d'incubation dans les sections 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3 et 15.3, tubes de spin brièvement et place contre support magnétique pour 1 min et aspirer le surnageant. Lavage 2 fois avec 0,75 ml de tampon RIPA et 2x avec HCl 0,75 ml de Tris (pH 7,5).

9. Polissage Réaction

  1. Remplissez Polissage calculs master mix (tableau 11). Faire de polissage mélange dans 1,5 ml tube sur la glace. Pipet pour mélanger.
  2. Immédiatement après le dernier lavage de ChIP est aspiré, ajouter 50 pi de polissage mélange pour chaque résine d'échantillon tout en restant sur le support magnétique. Incuber les échantillons pendant 30 min à 3 xgà 30 ° C dans un thermomixer.
  3. Après aspiration dernier lavage comme décrit dans la note après la section 8.4, passez à l'A-tailing.

Réaction 10. A-tailing

  1. Remplissez calculs master mix A-tailing (tableau 12). Make A-tailing mélange dans un tube de 1,5 ml sur la glace. Pipet pour mélanger.
  2. Immédiatement après le polissage de l'article, ajouter 50 pl d'un mix-tailing pour chaque échantillon de résine tout en restant sur le support magnétique. Incuber les échantillons pendant 30 min à 3 g à 37 ° C dans un ThermoMixer.
  3. Après aspiration dernier lavage comme décrit dans la note après la section 8.4, passez à P7 Adapter Ligation.

11. P7 Adapter Ligation Reaction

  1. Remplissez calculs maître Ligation mix (tableau 13). Faire Ligation mélanger dans 1,5 ml tube sur la glace. Pipette pour mélanger.
  2. Immédiatement après la section A-tailing, ajouter 48 ul P7 Ligation Master Mix et 2 ul d'un indice d'adaptateur différent to chaque résine d'échantillon tout en restant sur le support magnétique. Incuber les échantillons pendant 2 h à 3 g à 25 ° C dans un thermomixer.
    Note: L'utilisation de différents indices pour chaque échantillon permettra plus d'échantillons à séquencer dans une cellule à flux unique.
  3. Après aspiration dernier lavage comme décrit dans la note après la section 8.4, passez à Φ-29 Nick réparation.

Réparation 12. Phi-29 Nick Reaction

  1. Remplissez Φ-29 calculs de mixage master (tableau 14). Faire Φ-29 mélange dans 1,5 ml tube sur la glace. Pipet pour mélanger.
  2. Immédiatement après l'article P7 Ligation, ajouter 50 pi de Φ-29 mélange pour chaque résine échantillon tout en restant sur le support magnétique. Incuber les échantillons pendant 20 min à 3 g à 30 ° C dans un thermomixer.
  3. Après aspiration dernier lavage comme décrit dans la note après la section 8.4, procéder à une réaction Kinase.

13. Kinase Réaction

  1. Remplissez Kinase calculs master mix ( Tableau 15). Faire Kinase mélanger dans 1,5 ml tube sur la glace. Pipet pour mélanger.
  2. Immédiatement après Φ-29 section, ajouter 50 ul de Kinase se mélangent pour chaque résine d'échantillon tout en restant sur le support magnétique. Incuber les échantillons pendant 20 min à 3 g à 37 ° C dans un thermomixer.
  3. Après aspiration dernier lavage comme décrit dans la note après la section 8.4, passez à la réaction Lambda exonucléase.

14. Lambda exonucléase Réaction

  1. Remplir Lambda exonucléase calculs master mix (tableau 16). Faire Lambda exonucléase mélanger dans 1,5 ml tube sur la glace. Pipet pour mélanger.
  2. Immédiatement après l'article Kinase, ajouter 50 pl de Lambda exonucléase se mélangent pour chaque résine d'échantillon tout en restant sur le support magnétique. Incuber les échantillons pendant 30 min à 3 g à 37 ° C dans un ThermoMixer.
  3. Après aspiration dernier lavage comme décrit dans la note après la section 8.4, passez à RecJ f réaction.

15. RecJ fréaction nucléase

  1. Remplissez calculs master RecJ f mix (tableau 17). Faire RecJ f mélange dans 1,5 ml tube sur la glace. Pipet pour mélanger.
  2. Immédiatement après l' article Lambda exonucléase, ajouter 50 pi de RecJ f mélange pour chaque résine d'échantillon tout en restant sur le support magnétique. Incuber les échantillons pendant 30 min à 3 g à 37 ° C dans un ThermoMixer.
  3. Après aspiration dernier lavage comme décrit dans la note après la section 8.4, passez à ChIP Elution.

16. Elution et Crosslink Reversal

  1. Préparer mélange maître: nombre d'échantillons x 1,1 x (200 pi ChIP Elution Buffer + 1 pi 20 mg / ml de proteinase K) dans 1,5 ml tube. Ajouter 200 pi ChIP Elution Buffer + Proteinase K mélange maître à chaque résine échantillon.
  2. Incuber les échantillons pendant une nuit (environ 16 h) à 3 g à 65 ° C dans un thermomixer avec un couvercle chauffé pour éviter la condensation.

Jour 3: Extrait de l'ADNion et adaptateur Ligation

17. Elution et Crosslink Reversal (suite)

  1. Après une nuit d'incubation à 65 ° C, centrifuger brièvement pour recueillir des échantillons de condensat. Placer les échantillons sur la grille magnétique pendant 1 min.
  2. Transfert 200 ul surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml contenant 200 pi de tampon TE (pH 7,5).

18. Phénol Chloroforme alcool isoamylique (PCIAA) Extraction

  1. Ajouter 400 ul de phénol chloroforme, l'alcool isoamylique à chaque échantillon. Vortex à mélanger pendant 20 sec.
  2. Centrifuger pendant 10 min à 20 000 xg à la température ambiante (RT). transférer soigneusement 325 ul de la phase aqueuse supérieure dans un tube frais.
    Remarque: Prenez soin de ne pas transférer de l'organique (couche inférieure) dans le nouveau tube.
  3. Ajouter 1/10 volume de NaOAc 3 M (pH 5,5) et 1 ul de 20 mg / ml de glycogène à chaque échantillon. Pour de multiples échantillons, préparer un mélange maître.
  4. Ajouter 3 volumes de glace froid éthanol à 100% à chaque échantillon. Vortexmélanger. Incuber pendant 15 min à -80 ° C.
  5. Centrifugeuse pendant 15 min à 20 000 xg à 4 ° C. Décanter avec soin surnageant, en veillant à ne pas perturber le culot.
  6. Ajouter délicatement 500 pi fraîchement préparés glacé 70% d'éthanol, en veillant à ne pas perturber le culot. Centrifugeuse pendant 5 min à 20 000 xg à 4 ° C. Décanter avec soin surnageant.
  7. granulés à sec pendant environ 20 minutes (ou jusqu'à ce que sec) dans un vide de vitesse à 45 ° C.
    NOTE: Ceci est un point dans le protocole de pause. culots d'ADN secs peuvent être conservés à -20 ° C.
  8. Pellets Resuspendre dans 10 ul ddH 2 O. Pipet à plusieurs reprises sur la zone où l'ADN granulée, même si le culot séché ne peut pas être vu.
  9. Transférer 10 ul de chaque échantillon à un 0,3 ml tube PCR frais ou 8-rack, en fonction du nombre d'échantillons.

Réaction 19. P7 Primer Extension

  1. Remplir P7 Primer Extension des calculs de mixage master (tableau 18). Faire Extension mélanger dans 1,5 ml tube sur la glace. Pipet pour mélanger.
  2. Ajouter 10 ul de mélange d'extension (moins Φ-29 polymerase) à chaque échantillon de 10 ul. Pipet pour mélanger.
  3. Échantillons Exécuter dans le thermocycleur en utilisant le programme (tableau 19) à recuire amorce à la matrice jusqu'à ce que le 30 ˚C "tiennent" pas.
  4. Ajouter 1 ul Φ-29 polymerase au cours de la 30 ˚C "hold" étape du programme. Pipet pour mélanger. Reprendre le reste du programme (tableau 19).

Réaction 20. A-tailing

  1. Remplissez calculs master mix A-tailing (tableau 20). Make A-tailing mélange dans un tube de 1,5 ml sur la glace. Pipet pour mélanger.
  2. Ajouter 10 pl d'un mix-tailing à chaque échantillon. Pipet pour mélanger.
  3. Dans le thermocycleur, incuber les échantillons pendant 30 minutes à 37 ° C, puis la chaleur inactiver pendant 20 min à 75 ° C.

21. P5 Adaptateur Ligation Reaction

  1. fill out P5 Adapter ligatures calculs Master Mix (tableau 21). Faire Ligation mélanger dans 1,5 ml tube sur la glace. Pipet pour mélanger.
  2. Ajouter 20 ul de mélange de ligation P5 à chaque échantillon. Pipet pour mélanger.
  3. Dans le thermocycleur, incuber les échantillons pendant 2 heures à 25 ° C.

22. Perle Clean-up

Note: S'il vous plaît voir la section Matériaux pour les détails du fabricant sur le cordon nettoyer.

  1. Transférer chaque échantillon de 50 ul dans un nouveau tube de 1,5 ml.
  2. Resuspendre nettoyer des perles sur un rotateur mini-tube au niveau de réglage de la vitesse de 15 pendant 15 min à température ambiante. Ne laissez pas les billes se déposent avant pipetage.
  3. Ajouter 60 pi nettoyer perles à déguster (1.2: 1 nettoyer perles ratio échantillon est critique pour éliminer l'ADN qui est plus courte que 200 paires de bases). Pipet à mélanger pendant 20 secondes.
  4. Resuspendre nettoyer des perles sur un rotateur mini-tube au niveau de réglage de la vitesse de 15 pendant 3 min à température ambiante. Centrifuger brièvement les tubes.
  5. Placer les tubes sur le support magnétique pour 1 min.Pipet et jeter le surnageant.
    NOTE: NE PAS utiliser l'aspiration dans cette section car il va aspirer les billes de nettoyage.
  6. Ajouter 400 ul de fraîchement préparé RT 70% d'éthanol à chaque échantillon alors qu'ils sont sur la grille magnétique. Ne pas mélanger. surnageant Aspirer. Répéter 2x.
  7. Sécher les perles de nettoyage pendant 10 min à température ambiante. La couleur des perles se tourner foncé à fissures brunes et très petites lumière sera visible dans la pastille de résine lorsque les perles sont sèches.
  8. Pour éluer l'ADN, ajouter 40 ul de Tris 10 mM (pH 7,5). Bien pipeter mélanger pendant 20 secondes.
  9. Placer les échantillons sur le support magnétique pour 1 min. pipeter lentement et transférer 36 ul éluat directement à 0,3 ml tubes PCR.
  10. Passez directement à la PCR réaction ou magasin éluats à -20 ° C.

Jour 4: Analyse PCR et Gel

23. PCR

  1. Remplissez calculs PCR Master Mix (tableau 22). Créer un mix PCR. Pipet très doucement pour mélanger pour éviterbulles.
  2. Ajouter 14 ul de mélange de PCR pour chaque échantillon d'ADN 36 ul. Pipet pour mélanger. Gardez les échantillons sur la glace jusqu'au moment de mettre en Thermocycleur.
  3. Pour le contrôle positif à la PCR, inclure une bibliothèque préparée précédemment. Pour le contrôle négatif PCR, y compris l'eau. Échantillons Exécuter dans le thermocycleur en utilisant le programme PCR (tableau 23).

24. Préparation du gel, l'ADN Excision et visualisation

  1. Nettoyer et rincer une boîte de gel de taille appropriée avec de l'eau déminéralisée. Préparer un gel d'agarose à 1,5% (contenant 0,5 mg / ml de bromure d'éthidium) avec une épaisseur de peigne, large et qui peut contenir 60 ul.
    NOTE: Le bromure d'éthidium (EtBr) est un agent cancérigène et doit être manipulé avec précaution.
  2. Isoler tubes d'échantillons PCR brièvement pour recueillir la condensation.
  3. Ajouter un cinquième volume de 6x ADN xylène colorant échantillon combiné. Ne pas utiliser de bleu de bromophénol dans de l'ADN de colorant car il migre au même endroit que l'échantillon d'ADN.
  4. Charger l'ensemble de l'échantillon into chaque puits, de préférence avec des puits vides entre les échantillons.
    Note: Les bibliothèques avec les mêmes indices ne doivent PAS être exécutés dans le même gel.
  5. Charge 7 pl 100 pb échelle de chaque côté d'échantillons. Exécutez gel à 140 V pendant environ 30-45 min jusqu'à ce bromophénol colorant dans l'échelle est ¾ chemin vers le bas du gel.
  6. Image et visualiser le gel sur un transilluminateur à un faible niveau d'UV. Exciser les sections d'agarose contenant des fragments d'ADN 200 - 500 pb. Soyez très prudent pour éviter de couper des bandes adaptateur dimère qui fonctionne à 125 pb.
  7. Placez chaque tranche de gel excisée dans un tube de 15 ml. poids net record de chaque tranche de gel. Ecrire ce poids directement sur le tube.
  8. Image, enregistrer et annoter gel excisée pour confirmer plage correcte de la taille choisie.

25. Gel Purification

  1. Purifier l'ADN de excisée tranche de gel selon les instructions du fabricant, avec les modifications suivantes.
  2. Dissoudre la tranche de gel en basculantà la température ambiante sur la plate-forme à bascule. Il faudra environ 20 minutes pour dissoudre.
  3. Pour obtenir de l'ADN hautement purifié, laver colonnes avec 0,5 ml de tampon QG gel après dissous est passé à travers la colonne.
  4. Après tampon PE lavage, laissez les colonnes sont assis à la température ambiante pendant 2 - 5 min. Spin pendant 1 min à 13 000 xg à la température ambiante.
  5. Pour laisser place à mélange maître de réaction PCR, les échantillons éluer avec 40 ul EB Buffer dans un nouveau tube de 1,5 ml.

26. Quantification de l'ADN

  1. Préparer les échantillons selon les instructions du fabricant (tableau 24). Mesure d'échantillons dans l'instrument spécifié avec des tubes optiques.
  2. Une fois que les bibliothèques ChIP-exo sont quantifiés, présenter pour le séquençage sur une plate - forme qui utilise le séquençage par synthèse chimique 16 qui est compatible avec les adaptateurs d'ADN dans ce protocole.
    NOTE: En règle générale, 2 pi de l'échantillon est suffisante pour la quantification, mais plus peut être nécessaire si la concentration de l'échantillon est faible. Les rendements typiques de l'ADNgamme ly entre 50 et 200 ng.
  3. Après quantification, conserver les échantillons à -20 ° C.

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Résultats

Les figures suivantes illustrent des résultats représentatifs du protocole ChIP-exo présenté ici. Contrairement aux méthodes ChIP-seq traditionnels avec quelques étapes enzymatiques, ChIP-exo nécessite onze réactions enzymatiques séquentiellement dépendantes (Figure 1). Ainsi, il faut prendre soin à chaque étape pour faire en sorte que chaque composant de réaction est ajouté à son maître de mélange réactionnel respectif. Nous vous recommandons de générer une feuille de c...

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Discussion

Nous présentons un protocole de génomique fonctionnelle pour déterminer l'emplacement de liaison précise pour chromatine protéines interagissant dans, d'une manière pangénomique impartiale à proximité de la résolution de paires de bases. L'étape la plus critique pour atteindre base près de la résolution de mappage de la paire est un traitement par une exonucléase de l'ADN ChIP enrichi tandis que le reste immunoprécipité sur la résine magnétique. Ostensiblement, des complexes de protéines pourraient...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le laboratoire Venters et les membres du département de physiologie moléculaire et de biophysique pour les discussions utiles. Un merci spécial à Frank Pugh pour ses conseils, son mentorat et ses nombreuses discussions perspicaces sur les nuances de ChIP-exo alors que j’étais boursier postdoctoral dans son laboratoire.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
37 % formaldéhyde, sans méthanol, 10 ampoules de 10 mlThermoFisher Scientific28908Section 3
Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase (CPI)Roche Life Science11873580001Sections 4, 8
Bioruptor sonicatorDiagenodeUCD200Section 5
Tubes en polystyrène de 15 mlBD Falcon352095Section 5
Protéines MagSepharose G Xtra billesGE Healthcare28-9670-66Section 6
DynaMag-1.5 ml Rack magnétique latéralInvitrogen12321DSections 6-17, 22
Mini-Tube RotatorFisher Scientific05-450-127Sections 7, 22
T4 ADN polyméraseNew England BioLabsM0203Section 9
ADN polymérase I, KlenowNew England BioLabsM0210Section 9
10x NEBuffer 2 (10x Tampon de réaction 2)New England BioLabsB7002Sections 9-11, 13, 15, 20
Thermomixeur CEppendorf5382Sections 9-16
ATPRoche Life Science010419979001Sections 9, 11, 13
dNTPsNew England BioLabsN0447Sections 9, 12, 19, 23
Polynucléotide KinaseNew England BioLabsM0201Sections 9, 13
dATPNew England BioLabsN0440Sections 10, 20
Klenow 3'-5' Exo MinusNew England BioLabsM0212Sections 10, 20
T4 ADN ligase  ;New England BioLabsM0202Sections 11, 21
&Phi ;-29 ADN polyméraseNew England BioLabsM0269Sections 12, 19
10x &phi ;-29 BufferNew England BioLabsB0269Sections 12, 19
Lambda ExonucleaseNew England BioLabsM0262Section
14 10x Tampon LambdaNew England BioLabsB0262Section 14
RecJf ExonucléaseNew England BioLabsM0264Section 15
Proteinase KRoche Life Science03115828001Section 16
GlycogenRoche Life Science010901393001Section 18
10x T4 Ligase BufferNew England BioLabsB0202Section 21
AMPure XP (nettoyage) billes  ;Beckman CoulterA63881Section 22
Q5 Démarrage à chaud ADN polymérase  ;New England BioLabsM0493Section 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)New England BioLabsB9027Section 23
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Section 25
Qubit FluorometerInvitrogenQ33216Section 26
Optical Clear Qubit Tubes  ;InvitrogenQ32856Section 26
Qubit dsDNA Kit de dosage haute sensibilitéInvitrogenQ32851Section 26

Références

  1. Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
  2. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
  5. Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
  6. Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
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  8. Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035(2015).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
  10. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
  11. Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339(2016).
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  13. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).
  14. Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
  15. Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).
  16. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
  17. Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).
  18. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
  19. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147(2013).
  20. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).

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Mots-clés

Digestion par l exonucl ase lambdaImmunopr cipitation de la chromatineS quen age haut d bitConditions de sonicationIncubation sur portoir magn tiqueR action de la nucl ase RecJfvaluation par BioanalyzerSites d initiation de la transcription

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