La méthode ChIP-exo: Identification de protéine-ADN Interactions avec les environs de Base Paire de précision

Résumé

Ici, nous présentons un protocole permettant d’obtenir une résolution proche de la paire de bases des interactions protéine-ADN. Ceci est obtenu par un traitement à l’exonucléase de fragments d’ADN enrichis sélectivement par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-exo) suivi d’un séquençage à haut débit.

Résumé

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est un outil indispensable dans les domaines de l'épigénétique et la régulation des gènes qui isole les interactions spécifiques protéine-ADN. ChIP couplé à un séquençage à haut débit (ChIP-seq) est couramment utilisé pour déterminer la localisation génomique des protéines qui interagissent avec la chromatine. Cependant, ChIP-seq est entravée par résolution relativement faible de la cartographie de plusieurs centaines de paires de bases et le signal de fond élevé. La méthode ChIP-exo est une version raffinée de ChIP-seq qui améliore sensiblement à la fois la résolution et le bruit. La distinction clé de la méthodologie ChIP-exo est l'incorporation de lambda exonucléase digestion dans le flux de travail de préparation de la bibliothèque Footprint efficacement la gauche et droite 5 frontières 'ADN du site de réticulation de protéine-ADN. Les bibliothèques de copeau exo sont ensuite soumis à un séquençage à haut débit. Les données obtenues peuvent être mis à profit pour fournir des aperçus uniques et ultra-haute résolution dans l'organisation fonctionnelle of génome. Ici, nous décrivons la méthode ChIP-exo que nous avons optimisé et rationalisé pour les systèmes de mammifères et de prochaine génération plate-forme de séquençage par synthèse.

Introduction

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une méthode puissante pour étudier les mécanismes de régulation des gènes en enrichissant sélectivement des fragments d'ADN qui interagissent avec une protéine donnée dans les cellules vivantes. Méthodes de fragments d'ADN ChIP enrichi de détection ont évolué comme la technologie améliore, de la détection d'un seul locus (standard ChIP-qPCR) pour hybridation sur microréseaux d'oligonucléotides (ChIP-chip) à séquençage à haut débit (ChIP-seq) ^1. Bien que ChIP-seq a vu une large application, l'hétérogénéité de la chromatine et les interactions d'ADN non spécifiques ont entravé la qualité....

Protocole

Note: Double H ₂ O distillée ou équivalent moléculaire de qualité est recommandé pour tous les tampons et les réactions mélanges.

Jour 0: Préparation du matériel et Cell récolte

1. Préparation du tampon

1. Préparer Lysis Tampons 1 - 3 (tableaux 1 - 3) et ajouter 100 pi complète inhibiteur de protéase stock (IPC) à 50 ml de chaque tampon juste avant l'utilisation. Préparer IPC en dissolvant un comprimé dans 1 ml de grade moléculaire H ₂ O.
2. Préparer ChIP Tampons (tableaux 4 - 7). Ajouter 100 pi IPC disponible à 50 ml de blocage et des ta....

Résultats

Les figures suivantes illustrent des résultats représentatifs du protocole ChIP-exo présenté ici. Contrairement aux méthodes ChIP-seq traditionnels avec quelques étapes enzymatiques, ChIP-exo nécessite onze réactions enzymatiques séquentiellement dépendantes (Figure 1). Ainsi, il faut prendre soin à chaque étape pour faire en sorte que chaque composant de réaction est ajouté à son maître de mélange réactionnel respectif. Nous vous recommandons de générer une feuille de c.......

Discussion

Nous présentons un protocole de génomique fonctionnelle pour déterminer l'emplacement de liaison précise pour chromatine protéines interagissant dans, d'une manière pangénomique impartiale à proximité de la résolution de paires de bases. L'étape la plus critique pour atteindre base près de la résolution de mappage de la paire est un traitement par une exonucléase de l'ADN ChIP enrichi tandis que le reste immunoprécipité sur la résine magnétique. Ostensiblement, des complexes de protéines pourraient.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
37 % formaldéhyde, sans méthanol, 10 ampoules de 10 ml	ThermoFisher Scientific	28908	Section 3
Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase (CPI)	Roche Life Science	11873580001	Sections 4, 8
Bioruptor sonicator	Diagenode	UCD200	Section 5
Tubes en polystyrène de 15 ml	BD Falcon	352095	Section 5
Protéines MagSepharose G Xtra billes	GE Healthcare	28-9670-66	Section 6
DynaMag-1.5 ml Rack magnétique latéral	Invitrogen	12321D	Sections 6-17, 22
Mini-Tube Rotator	Fisher Scientific	05-450-127	Sections 7, 22
T4 ADN polymérase	New England BioLabs	M0203	Section 9
ADN polymérase I, Klenow	New England BioLabs	M0210	Section 9
10x NEBuffer 2 (10x Tampon de réaction 2)	New England BioLabs	B7002	Sections 9-11, 13, 15, 20
Thermomixeur C	Eppendorf	5382	Sections 9-16
ATP	Roche Life Science	010419979001	Sections 9, 11, 13
dNTPs	New England BioLabs	N0447	Sections 9, 12, 19, 23
Polynucléotide Kinase	New England BioLabs	M0201	Sections 9, 13
dATP	New England BioLabs	N0440	Sections 10, 20
Klenow 3'-5' Exo Minus	New England BioLabs	M0212	Sections 10, 20
T4 ADN ligase  ;	New England BioLabs	M0202	Sections 11, 21
&Phi ;-29 ADN polymérase	New England BioLabs	M0269	Sections 12, 19
10x &phi ;-29 Buffer	New England BioLabs	B0269	Sections 12, 19
Lambda Exonuclease	New England BioLabs	M0262	Section
14 10x Tampon Lambda	New England BioLabs	B0262	Section 14
RecJf Exonucléase	New England BioLabs	M0264	Section 15
Proteinase K	Roche Life Science	03115828001	Section 16
Glycogen	Roche Life Science	010901393001	Section 18
10x T4 Ligase Buffer	New England BioLabs	B0202	Section 21
AMPure XP (nettoyage) billes  ;	Beckman Coulter	A63881	Section 22
Q5 Démarrage à chaud ADN polymérase  ;	New England BioLabs	M0493	Section 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)	New England BioLabs	B9027	Section 23
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Section 25
Qubit Fluorometer	Invitrogen	Q33216	Section 26
Optical Clear Qubit Tubes  ;	Invitrogen	Q32856	Section 26
Qubit dsDNA Kit de dosage haute sensibilité	Invitrogen	Q32851	Section 26