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Article de méthode

Capillaire Feeder Assay mesures prise alimentaire dans

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DOI :

10.3791/55024

⸱

17 mars 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Zoology, Albertus-Magnus University of Cologne, 2Department of Veterinary Biomedical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

Dans cet article

Résumé

Le dosage CApillary FEeder (CAFE) est une méthode simple, économique et très fiable pour étudier les mécanismes sous-jacents à l’apport alimentaire. Utilisé avec l’organisme modèle génétique très polyvalent Drosophila melanogaster, il fournit un moyen puissant d’obtenir de nouvelles connaissances sur les mécanismes de régulation de l’apport alimentaire.

Résumé

Pour la plupart des animaux, l’alimentation est un comportement essentiel pour assurer la survie et influence le développement, la locomotion, la santé et la reproduction. L’ingestion du bon type et de la bonne quantité d’aliments a donc une influence majeure sur la qualité de vie. La recherche sur le comportement alimentaire se concentre sur les processus sous-jacents qui assurent l’alimentation réelle et dévoile le rôle des facteurs régulant l’homéostasie énergétique interne et les bases neuronales de la prise de décision. L’organisme modèle Drosophila melanogaster, avec sa grande variété d’outils génétiquement traçables pour le marquage et la manipulation de neurones uniques, permet la cartographie des réseaux neuronaux et l’identification des cascades de signalisation moléculaire impliquées dans la régulation de la prise alimentaire. Ce rapport fait la démonstration du dosage CApillary FEeder (CAFE) et montre comment mesurer l’apport alimentaire chez un groupe de mouches pendant des périodes allant de quelques heures à quelques jours. Ce test facile à utiliser se compose de capillaires en verre remplis de nourriture liquide à laquelle les mouches peuvent accéder librement et dont elles peuvent se nourrir. La consommation alimentaire dans le test est déterminée avec précision à l’aide d’outils de mesure simples. Nous décrivons ici étape par étape la méthode de la configuration à l’exécution réussie du test CAFE, et fournissons des exemples pratiques pour analyser la consommation de nourriture d’un groupe de mouches dans des conditions contrôlées. Le lecteur est guidé à travers les limites possibles de l’essai, et les avantages et les inconvénients de la méthode par rapport à d’autres essais d’alimentation chez D. melanogaster sont évalués.

Introduction

Manger est essentielle; Cependant, la déréglementation de l' apport alimentaire entraînant des troubles de l' alimentation tels que la boulimie, l' anorexie ou la tendance générale à suralimenter impose des coûts aux individus et à la société 1, 2, 3. L'objectif de la présente recherche est de découvrir les mécanismes de régulation de la prise alimentaire et de fournir une stratégie pour contourner la formation de trouble. De nombreuses études utilisant des organismes modèles de mammifères ont fourni de nouvelles informations sur les circuits et le rôle des systèmes de signalisation dans les troubles de 4, 5, 6 alimentation. Néanmoins, notre connaissance des bases neuronales et moléculaires qui sous-tendent ces troubles reste loin d'être complète. Au cours des dernières années, la mouche Drosophila melanogaster est devenu un système de modèle utile pour démêler des idées mécanistes de base dans le règlement de METABOLIm 7, 8, 9. Le test capillaire Feeder (CAFE) pour Drosophila melanogaster a été créé dans le laboratoire de Seymour Benzer en 2007 inspiré par une œuvre plus tôt par Dethier dans blowfly 10, 11. L'essai CAFE a permis de mesurer directement la consommation de nourriture chez Drosophila melanogaster. Dans ce système de test de comportement, les mouches se nourrissent d'aliments liquides fournis dans des capillaires en verre graduées placées à l'intérieur d'un flacon. Le déclin du ménisque capillaire indique une perte de solution alimentaire par évaporation et de la consommation alimentaire. La détermination du taux d'évaporation par des flacons sans mouches permet la quantification précise de la prise alimentaire.

Le dosage de CAFE est l' un de plusieurs paradigmes comportementaux utilisés pour mesurer l' alimentation chez Drosophila melanogaster et les chercheurs doivent choisir le plus approprié pour leur proprequestion. La décision d'utiliser un certain dosage doit tenir compte des points suivants: la nature de la nourriture fournie; l'état d'alimentation; la mesure de la consommation ou de l'absorption des nutriments et l'enquête de la consommation alimentaire ou de la réponse à la nourriture.

L'essai de CAFE tel que décrit dans le présent rapport est idéal pour suivre l'apport alimentaire d'une source de nourriture liquide sous une condition d'alimentation verticale. En variante, l'apport alimentaire peut être mesurée pour un groupe de mouche sur une source d'alimentation colorée dans un flacon ou dans une assiette. Les mouches sont normalement tuées ou anesthésiés après le repas et la quantité de colorant ingéré est déterminée par spectrométrie ou une inspection visuelle de l'abdomen teinté. Les mouches commencent à excréter la nourriture ingérée seulement 30 min après l' ingestion, par conséquent , cette approche est difficile à utiliser pour l'analyse de l' alimentation continue plus les comportements 12, 13.

A l'opposé les mouches sont conservés intacts lors de colorant absorbables avec des traceurs radioactifs sont utilisés et leur consommation de radioisotopes est marqué dans un compteur à scintillation 14, 15. L'absorption du radiomarqueur par le système digestif mouche rend la mesure de la prise alimentaire à long terme possible, mais pourrait conduire à une sous-estimation de la consommation en raison des molécules non absorbées et excrétées traceurs. Une autre approche pour mesurer la réponse à l' alimentation dans Drosophila melanogaster est la réponse proboscis d'extension (PER), qui se produit normalement pour la prise alimentaire 16. Cette méthode élégante mesure la réponse initiale à un stimulus alimentaire, mais ne comptabilise pas la quantité d'admission. L' apport alimentaire est ajustée de façon dynamique lors de l' alimentation en utilisant plusieurs signaux de rétroaction post-digestifs qui sont essentiels pour la régulation de l' alimentation 17, 18. Plusieurs tentatives ont été faites ces dernières années pour la collecte des données semi automatisent dans le dosage PAR 19, 20. Le PER est détectée par un plot électrique ou une combinaison d'électrodes et comptées par ordinateur. La combinaison de l'essai PER avec radioisotope absorption a révélé que cette analyse est limitée par une faible sensibilité à la détection de différences quantité d'alimentation 18. Le dosage d'alimentation manuelle (Mafe) 21, dans lequel une mouche est introduite manuellement à l' aide d' un capillaire en verre, a récemment été développé pour mesurer l' absorption alimentaire chez une mouche immobilisée. Le dosage MAFE élimine les interférences de la recherche de nourriture et d'alimentation d'initiation et a une résolution temporelle de secondes, et le début du PER et de la consommation alimentaire peut être contrôlée indépendamment dans le dosage. Cependant, la façon dont l' immobilisation de la mouche sur certains aspects du comportement alimentaire (par exemple , la locomotion, la motivation) doit encore être étudiée. Pour d' excellentes critiques comparatifs des différents tests de mesure de la consommation alimentaire chez la drosophile melanogaster et pour aider les chercheurs à trouver la plus appropriée, voir les rapports de Deshpande et Marx 13, 22.

L'essai CAFE évite certains des inconvénients des autres dosages décrits ci-dessus et combine la simplicité d'utilisation avec une mesure fiable de la prise alimentaire. Ici, une description détaillée de l'essai CAFE est fourni et nous montrent une modification de configuration simple pour réduire l'évaporation. Les résultats représentatifs, y compris un choix dosage deux aliments (à court et à long terme) et l'absorption du saccharose de mouches est démontrée. Dans la discussion que nous comparons notre méthode décrite avec d'autres moyens pour effectuer le test de CAFE, et mettre en évidence les limites potentielles.

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Protocole

1. Le dosage de CAFE

NOTE: Le test se compose de trois éléments: un flacon expérimental, un couvercle spécifique et capillaires micro. Une boîte en plastique avec couvercle est utilisé pour transporter les flacons préparés et de contrôler l'humidité plus efficacement.

  1. Utiliser un flacon de culture de Drosophila melanogaster en plastique ( en option 8 cm de hauteur, 3,3 cm de diamètre) en tant que tube pour l'essai.
  2. Sceller le flacon avec un couvercle en plexiglas manufacturé contenant un joint torique (Figures 1A, 1B). Charge vole en tapotant ou avec un chalumeau à travers l'ouverture du couvercle central (0,9 cm de diamètre), ce qui permet également pour la circulation de l'air et de l'approvisionnement en eau, et fermer le trou avec un bouchon en éponge. Six ouvertures coniques plus petits (0,4 cm de diamètre supérieur, 0,3 cm de diamètre intérieur) entourent le trou central et le montage des embouts de pipette de 2-20 volume de pi pour maintenir les capillaires en place. (Voir les chiffres supplémentaires pour les détails techniques du couvercle.)
    NOTE: L'utilisationd'un bouchon d'éponge avec des ouvertures pour les capillaires à la place du couvercle sur mesure utilisé dans notre manuscrit est possible. Notre couvercle personnalisé permet une manipulation sûre des flacons préparés en minimisant le risque de capillaires tomber.
  3. Pour présenter la nourriture liquide, utiliser 5 microcapillaires uL avec 1 marque uL. Positionner les capillaires dans les ouvertures coniques dans le couvercle en coupant la partie supérieure d'un 2 - pointe 20 pi de pipette et insérer la pointe dans le trou (figure 1B, marqué avec le bord rouge). Pour empêcher les mouches de s'échapper, insérer un 2 uncut - 20 pi pointe de la pipette dans la même ouverture.
  4. Pour gérer en toute sécurité des flacons préparés, placez - les dans une boîte en plastique avec un insert maillé (figure 2A).

2. Préparation des Mouches

  1. Gardez les mouches sur la nourriture standard à 25 ° C, 60% d'humidité relative et un cycle de lumière-obscurité / 12 h 12 h.
  2. Pour contrôler les conditions d'élevage, d'introduire 35 femelles vierges uned 15 mâles pour chaque groupe expérimental, dans un flacon de culture en matière plastique (9,8 cm de hauteur, 4,8 cm de diamètre) contenant 50 ml mouche alimentaire. Permettre aux mouches pondent des œufs pour les 3 premiers jours, puis transférer les mouches adultes dans des flacons de produits frais et de les laisser pondre pendant deux jours. Après cette répéter le transfert. adulte Jeter vole au bout de 2 jours.
  3. Comme l' apport alimentaire dépend de la taille de la mouche, déterminer le poids d'un groupe de 100 mouches par anesthésier 2 à 3 jours d'âge adulte vole en utilisant un tampon de mouche CO 2 et les recueillir dans un tube en plastique de 1,5 mL et mesurer avec une norme échelle du laboratoire. Déterminer le poids humide d'au moins quatre groupes de mouches indépendants classés par sexe (tableau 1); utiliser le poids pour calculer pi la consommation alimentaire par mouche mg. Utilisez la valeur pour déterminer la quantité de nourriture qu'une seule mouche se nourrit par expérience et d'ajuster le nombre de capillaires alimentaires remplis en conséquence pour éviter la vidange des capillaires par l'alimentation.
    1. Pour un 3 h test, l'utilisation20 mouches et les deux capillaires remplis. Pour une expérience à long terme (> 3 h et jusqu'à 9 jours), utiliser un groupe de huit mouches avec un approvisionnement de quatre capillaires remplis (des résultats fiables ne peuvent être obtenus avec moins de huit mouches dans les conditions décrites).
  4. Mouches séparés en groupes (8 ou 20 mouches) après la mesure du poids sous CO 2 exposition. Transférer le groupe à un nouveau flacon alimentaire (contenant 15 mL alimentaire standard) pour permettre la récupération du CO 2 sédation pendant 48 h avant l'expérience. Utilisez 4 à 6 jours d'âge des mouches pour le dosage de CAFE.
  5. Comme les mouches non-affamés de type sauvage ne se nourrissent que marginalement 19, 21, pré-mourir de faim vole pour des expériences d'alimentation 3 h. Pas de jeûne est nécessaire lorsque la consommation alimentaire est surveillée pendant plusieurs jours. Pour le jeûne, le transfert vole 16 à 20 h avant le test en les tapotant doucement dans un flacon contenant seulement un diamètre plié papier filtre de 45 mm humidifié avec ~ 0,5 ml ddH2 O (double eau distillée), et fermer avec un couvercle de dosage de CAFE branché.

3. Préparation des aliments liquides

  1. Préparer un 3 M (10%, p / v) solution de saccharose stock en remplissant 102,6 g de saccharose (C 12 H 22 O 11) à 100 mL ddH 2 O. Pipette 3 pi, 33 pi, 333 pi, 3,3 mL et 6,6 mL de la solution mère dans un tube en plastique de 15 ml; ajouter 2 mL de colorant alimentaire (pour le rouge: cochenille [E124]; pour le bleu: indigo carmin [E132]) et compléter à 10 ml avec ddH 2 O. Les concentrations obtenues sont 0,001, 0,01, 0,1, 1 et 2 M de saccharose .
    NOTE: Le colorant alimentaire permet de visualiser le ménisque plus facilement. Cependant, le colorant peut avoir une incidence sur la consommation de nourriture. Afin d'éviter un biais dû au colorant distribuer le colorant alimentaire ou aléatoire l'utilisation des colorants pour les échantillons de produits alimentaires au cours de l'expérience et les groupes.
  2. Pour tester la pipette de préférence d'alcool 333 pl de la solution mère de 3 M de saccharose dans un tube de 15 ml en plastique.Ajouter 1,5 ml (2,3 ml) de 100% EtOH (éthanol) et ajouter ddH 2 O jusqu'à 10 ml pour aboutir à 15% (0,25 mM) et 23% (0,39 mM) de solutions de travail.
  3. Gardez des solutions mères à -20 ° C et des solutions de travail à 4 ° C; utiliser dans 1 semaine.
  4. Remplir jusqu'à 10 capillaires en même temps avec une solution alimentaire colorée, par une force capillaire. Insérer les extrémités des capillaires dans la solution de saccharose (en maintenant les capillaires à un angle par rapport à la solution à 45 °). Arrêtez si le liquide atteint le sommet (5 pi) marque du capillaire, et enlever l'excès de solution à l'extérieur et à l'intérieur avec du papier de soie.

4. Montage et réalisation du test capillaire Feeder

  1. Si le jeûne est pas nécessaire, transférer les mouches expérimentales à l'essai en tapotant ou en chalumeau. Assurez-vous d'inclure trois flacons de contrôle sans mouches pour quantifier l'évaporation.
  2. Retirez délicatement une pointe de pipette (2-20 en volume pi) qui ferme l'un des openin externegs, et insérez un capillaire en verre, en bas-end rempli d'abord. Fixer le capillaire en plaçant la pointe de la pipette de retour à côté du capillaire. Si plusieurs solutions alimentaires sont testées, répétez cette procédure en conséquence.
  3. Placez les extrémités du capillaire à l'intérieur de tous les flacons au même niveau pour éviter les biais qui pourraient se produire si les sources de nourriture étaient situés à des hauteurs différentes (3 - 4 cm du couvercle); garder une distance sur le papier filtre pour empêcher le capillaire de fuir en touchant accidentellement le papier filtre ou différentes viscosités de sources alimentaires.
  4. Etiqueter l'extrémité supérieure du liquide coloré en utilisant un stylo marqueur (marque début). Pour assurer les différents capillaires peuvent être identifiés, les étiqueter individuellement en utilisant un code de couleur ou d'une bande.
  5. Placez plusieurs dosages CAFE préparés dans une boîte en plastique avec incrustation maillées et transférer la boîte (figure 2A) à une position de sécurité dans des conditions de laboratoire ou dans un en température, clim lumière et humidité contrôléeate chambre (paramètres: 25 ° C, humidité relative de 60%, le cycle lumière-obscurité / 12 h 12 h) pour la période expérimentale (par exemple 3 h ou jours).
  6. Comme papier filtre bas dessèche si le dosage est effectué sur plusieurs jours, appliquer de l' eau fraîche toutes les 24 h par l'éponge bonde (100 pi) pour maintenir constante l' humidité à l' intérieur du dosage. Utilisez quatre flacons séparés (8 cm de hauteur, 3,3 cm de diamètre) remplis de 30 ml ddH 2 O en tant que dispositifs d'humidité et de les placer à côté des essais CAFE dans la boîte en plastique. Utilisez un couvercle pour la boîte en plastique pour créer un environnement contrôlé d'humidité pendant l'expérience (figure 2A).
    REMARQUE: La variabilité plus large se produit dans des conditions de laboratoire; cependant, il est possible d'effectuer le test CAFE à la température ambiante (par ex., dans une classe). L'utilisation d'un dispositif d'humidification (papier filtre, avec ou sans une éponge humide bonde, rempli des flacons d'eau et le couvercle de la boîte en plastique) est fortement encouragée pour diminuer l'évaporation ( Figure 2B).
  7. Remplacez les capillaires avec ceux fraîchement remplis pour des expériences à long terme toutes les 24 h. Prenez note de mouches mortes avant chaque h intervalle de 24 et d'utiliser le nombre de mouches vivantes pour calculer la consommation par la mouche pour la période suivante. Jeter les vieux capillaires après la mesure de la baisse du ménisque (voir 5.1).
    NOTE: Au cours d'une expérience de 3 h, nous voyons guère de mouches mortes. Au cours d'une étude de 4 jours, nous trouvons habituellement 1 - 3 mouches mortes.
  8. A la fin de l'essai ou avant de remplacer le capillaire, marquer les ménisque inférieur du capillaire (marque de fin) avec un stylo marqueur tandis que le test de CAFE est toujours en position verticale. Jeter les données si marque de fin ne sont pas en dessous de la marque initiale (marque le début). Ne pas retirer le couvercle, car cela pourrait changer le ménisque.
  9. Retirez soigneusement les capillaires de l'essai et de les stocker pour la collecte de données. Vérifiez si le liquide à l'intérieur du capillaire a atteint l'extrémité inférieure sinon Discard les données, car la nourriture était pas accessible aux mouches. Recueillir tous les capillaires par flacon en tant que groupe. Insérez les embouts de pipette non coupés dans toutes les ouvertures pour empêcher les mouches de s'échapper. Démonter la configuration et laver les flacons, les couvercles et bouchons en éponge dans un bain de savon et sécher pendant la nuit à la température ambiante pour une utilisation ultérieure.
    NOTE: Les mouches peuvent être analysées plus loin après le dosage. Confirmer l'absorption de nourriture à l'oeil nu ou sous un microscope de dissection.
  10. Répéter les expériences avec les mêmes génotypes sur au moins trois jours différents.

5. Collecte et analyse des données

  1. Mesurer la distance entre la marque début et la fin marque sur le capillaire à l' aide d' un étrier ou une règle. Pour transférer des données directement à une feuille de calcul, utilisez un port USB (Universal Serial Bus) connecté étrier numérique (figure 1E). Jeter les capillaires après la mesure.
  2. Compte pour la taille capillaire pour calculer l'absorption ou l'évaporation des aliments. Par exemple, considérons un bouchonIllary qui est de 73 mm de long et contient de 5 pi d'une solution alimentaire. Une diminution de 14,6 mm dans le ménisque reflète l'absorption de 1 pi de solution. Calculer l'absorption d'aliments en utilisant la formule suivante:
    l'absorption d'aliments (pi) = distance mesurée (mm) / 14,6 mm
  3. Pour exclure l'effet de l'évaporation sur la prise alimentaire, calculer l'évaporation dans les trois (au minimum) des flacons de contrôle sans mouches signifie. Soustraire cette valeur moyenne de la valeur obtenue pour la consommation alimentaire des mouches.
  4. Utilisez la formule suivante pour déterminer la consommation totale par la mouche:
    La consommation alimentaire (pi) = (Food absorption [ul] - perte par évaporation [pi]) / nombre total de mouches dans le flacon. Pour long terme des expériences utilisent le nombre de mouches vivantes avant le début de l'intervalle de 24 h.
  5. Pour tenir compte des différences dans la taille du corps, comme entre les hommes et les mouches femelles, de normaliser la consommation alimentaire au poids corporel (ul alimentaire / fly mg).
  6. Utilisez un logiciel statistique pour l'analyse des données. Pour la normedonnées distribuées, allié T de -Tests utilisation de l' étudiant afin de déterminer les différences entre les deux groupes de mouches, et utilisent ANOVA (analyse de variance) avec les tests post hoc de Tukey Cramer pour plus de deux groupes. Dans une situation de choix, d'analyser les différences de choix aléatoire en utilisant un nonparametric un échantillon signe test.

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Résultats

Les mouches du génotype w 1118 sont utilisés pour démontrer comment le dosage est effectué. Les mutants w 1118 sont couramment utilisés pour générer des lignées transgéniques et pour contrôler l'arrière - plan génétique de transgènes marqué avec le gène blanc. Normalement, pour des expériences comportementales, toutes les lignées transgéniques sont rétrocroisement depuis cinq générations à la même w 1.118 actions, q...

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Discussion

Le rapport décrit le dosage de CAFE dans un mode étape par étape, en se concentrant sur la configuration technique et sa performance réussie dans le laboratoire. En raison de sa simplicité, ce test pourrait également être utilisé éducatif comme une expérience scolaire. Les exemples montrent que le dosage permet d' étudier la détection de la nourriture, la préférence et la consommation dans Drosophila melanogaster sur de courtes périodes et plus longs (heures à quelques jours). L'essai de CAFE a été larg...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous remercions les membres passés et présents du laboratoire Scholz pour la discussion et Helga Döring pour l’excellent support technique. Nous remercions tout particulièrement les membres de l’atelier Biocenter de l’Université de Cologne pour leur soutien et leur créativité. Les travaux sont soutenus par SFB 1340, SysMedAlc et DAAD-Siemens.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Flacons (sélection)Flacons960177 www.greinerbioone.comGreiner Bio-One
(dosage CAFE)Greiner Bio-One217101
www.greinerbioone.com Lid-CAFE&ndash ;&ndash ;
Boîte en plastique, paroi bassePlastime353www.plastime.it
Couvercle pour la boîte en plastiqueAtelier&ndash ;&ndash ;
CapillairesBLAUBRAND  ;REF 7087 07www.brand.de
Pointes de pipetteGreiner Bio-One771290www.greinerbioone.com
Cercles en papier filtreWhatman10 311 804www.sigmaaldrich.com
D(+)-SucroseAppliChem57-50-1www.applichem.com
Éthanol absoluVWR Chemicals20,821,330www.vwr.com
Colorant alimentaire (rouge, E124)Backfun10027www.backfun.de
Colorant alimentaire (bleu, E133)Backfun10030www.backfun.de
Solution de savon (CVK 8)CVH103220www.cvh.de
Pied à coulisse numériqueGARANT412,616www.hoffmann-group.com
Flacons (élevage)Hauteur 9,8 cm, diamètre 4,8 cm  ;
Flacons (test CAFE)Hauteur 8 cm, diamètre 3,3 cm
Test Lid-CAFEProduit dans l’atelier universitaire, dessin technique fourni
Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Boîte en plastique, paroiUne incrustation de grille en plastique a été fabriquée sur mesure pour 8 x 10 positions de flacon  ;
Couvercle de la boîteDimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillairesnorme DIN ISO 7550,  ; Directive IVD 98/79 EG, extrémités polies
PointesLes pipettes pour le cercle extérieur sont coupées en fonction du couvercle
Cercles45 mm de diamètre fonctionnent bien s’ils sont pliés pour les flacons utilisés
D(+)-SaccharoseNon nocif
AbsoluLiquide et vapeur hautement inflammables
Colorant alimentaire (rouge, E124)Non indiqué
Colorant alimentaire (bleu, E133)Non indiqué
Solution de savon (CVK 8)Savon neutre en odeur
Pied à coulisse
Nourriture anti-mouches(pour 20 L)
Agar160 g
Levure299,33 g
Semoule de maïs1 200 g
Atelier de dosage basse en plastique de pipette en papier filtre de d’éthanol numérique standard de bière Mélasse 1,6 L Acide propionique 57,3 mL Nipagin 30 % 160 mL

Références

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