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Article de méthode

Règlement de Picornavirus Tropisme base microARN-

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DOI :

10.3791/55033

⸱

6 février 2017

 , 
1Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une méthode de régulation du tropisme du picornavirus en incorporant des séquences complémentaires à des microARN spécifiques dans le génome viral. Ce protocole peut être adapté à toutes les différentes classes de virus, avec des modifications en fonction de la durée et de la nature de leur cycle de vie.

Résumé

La restriction cellulaire de la réplication virale sans atténuation concomitante peut être bénéfique pour le développement de vaccins, la thérapie génique, la virothérapie oncolytique et la compréhension des propriétés biologiques des virus. Il existe plusieurs mécanismes pour réguler le tropisme viral, mais ils ont tendance à être spécifiques à une classe de virus et beaucoup entraînent une atténuation du virus. De plus, de nombreux virus, y compris les picornavirus, présentent des contraintes de taille qui ne permettent pas d’incorporer de grandes quantités de matériel génétique étranger nécessaire à certaines méthodes de ciblage. Les microARN sont de courts ARN non codants qui régulent l’expression des gènes dans les cellules eucaryotes en liant des séquences cibles complémentaires dans les ARN messagers, empêchant leur traduction ou accélérant leur dégradation. Différentes cellules présentent des signatures de microARN distinctes et de nombreux microARN servent de biomarqueurs. Ces modèles d’expression différentiels peuvent être exploités pour restreindre l’expression des gènes dans les cellules qui expriment des microARN spécifiques tout en maintenant l’expression dans les cellules qui ne le font pas. En ce qui concerne la régulation du tropisme viral, des séquences complémentaires à des microARN spécifiques sont incorporées dans le génome viral, généralement dans les régions non codantes 3', les ciblant pour la destruction en présence des microARN apparentés, empêchant ainsi l’expression et/ou la réplication des gènes viraux. Le ciblage par microARN est une technique qui, théoriquement, peut être appliquée à tous les vecteurs viraux sans altérer la puissance du virus en l’absence des microARN correspondants. Nous décrivons ici les méthodes expérimentales associées à la génération d’un picornavirus ciblant les microARN et à l’évaluation de l’efficacité et de la spécificité de ce ciblage in vitro. Ce protocole est conçu pour un virus à réplication rapide avec un cycle de réplication lytique, cependant, la modification des points temporels analysés et des lectures de titrage spécifiques du virus utilisées aidera à l’adaptation de ce protocole à de nombreux virus différents.

Introduction

Le développement d'une méthode largement applicable, facile et efficace pour l'ingénierie d'un vecteur à tropisme restreint offre une opportunité majeure pour améliorer la sécurité, la compréhension biologique et une utilité thérapeutique des virus. Il existe plusieurs mécanismes pour cibler tropisme viral comprenant traductionnelle, la transcription, et des techniques à base de traduction. Cependant, ces procédés ne sont généralement pas applicables à tous les systèmes de vecteurs, peut nécessiter des voies de signalisation défectueux dans des cellules ciblées ou nécessitent l'insertion de grandes séquences codantes dans le génome viral. En outre, ces procédés peuvent conduire à une atténuation du virus, ce qui entrave considérablement leur activité thérapeutique et limitant un aperçu du système non modifié.

Les microARN sont de petits (22-25 nucléotides), ARNs non codants qui interviennent dans le silençage génique dans des cellules eucaryotes. fonction microARN par des séquences cibles complémentaires (éléments de réponse) en ARN messagers de liaison (ARNm) resulti ng dans la transcription déstabilisation, la dégradation ou la répression traductionnelle. Les microARN se lient normalement des éléments de réponse avec une complémentarité partielle et donnent de petites modifications dans l' expression des gènes 1, 2, 3, 4, 5. Plus de modifications significatives dans l' expression génique peut être obtenue en augmentant la complémentarité de l'élément de réponse 6. Des milliers de micro - ARN matures ont été identifiés dans une variété d'espèces et de nombreux motifs d'expression différentiels d'exposition dans une variété de types cellulaires et tissulaires 7, 8, 9. Ces signatures de microARN peuvent être exploitées pour la restriction spécifique à la cellule d'amplification du virus en y incorporant des éléments de réponse parfaitement complémentaires dans le génome viral 10,= "xref"> 11, 12, 13. L'objectif global de cette technique de microRNA-ciblage est de contrôler le tropisme d'un génome de vecteur sans atténuation supplémentaire.

L'utilité de cette méthode de régulation tropisme viral a été démontrée dans des vecteurs lentiviraux pour limiter l' expression du transgène dans des tissus spécifiques 14, 15, 16. Cette technique a ensuite été appliquée à un large éventail de se répliquer et ne se répliquant pas des vecteurs viraux pour la thérapie génique accrue, ainsi que pour améliorer les profils de nombreux virus oncolytiques de sécurité en éliminant les effets toxiques indésirables dans les tissus normaux 10, 11, 12, 13, 17 . Il a également été utilisée pour générer sûre et eles vaccins vivants atténués EFFICACE ainsi que pour améliorer le virus et la fabrication de vaccins traite 18, 19, 20, 21. MicroARN-ciblage d'un vecteur peut permettre à l'atténuation dans des hôtes vaccinés ou systèmes ciblés, tout en maintenant les niveaux de croissance de type sauvage dans les systèmes de production. MicroARN-ciblage peut également être utilisé pour améliorer la biosécurité des virus à des fins de recherche en limitant la transmission dans une espèce (par exemple les humains) , tout en maintenant la transmission dans d' autres hôtes 22. Enfin, microRNA-ciblage peut permettre des analyses en profondeur des cycles de vie viraux et des rôles spécifiques de types de cellules dans la pathogénie et l' immunité en séparant la croissance virale 23, 24, 25, 26.

Cette technique offre une alternative méthode qui est facilement mis en oeuvre et applicables à tous les systèmes de ciblage de virus. En outre, la collection sans cesse croissante de microARN matures avec des profils d'expression différentielle dans des types cellulaires spécifiques rend cette technique très polyvalent. le ciblage basé sur microARN se sont révélées efficaces pour une variété de systèmes de virus sans compromettre le fonctionnement du système. Les principales limites de cette technique comprennent essai et l'optimisation d'erreur, le potentiel de mutations d'échappement, et potentiels hors-cible des effets sur les transcriptions endogènes. Toutefois, ces limitations peuvent généralement être surmontés avec la conception des éléments de réponse optimisée et rationnelle. Les virus à ARN de sens positif ont tendance à être particulièrement sensible aux micro-ARN-cible due à l'orientation de sens positif de leur génome et de la disponibilité des transcriptions à la machine de microARN au cours du cycle de réplication complètement cytoplasmique. Nous décrivons ici un protocole pour générer un picornavirus microRNA-ciblée et l'expérimméthodes entales pour vérifier l'efficacité et la spécificité de ce ciblage in vitro.

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Protocole

1. Clonage Éléments de réponse microARN dans le génome viral

  1. Inserts d'éléments de réponse Conception de microARN.
    1. Identifier les micro-ARN souhaité et sa séquence cible correspondante. Plusieurs bases de données sont disponibles avec des séquences de microARN matures. Recommandé: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
  2. Cloner l'élément de réponse à l' ADN plasmidique codant pour le génome du vecteur ou de la transcription.
    NOTE: Pour les deux ou plusieurs éléments de réponse à la copie en utilisant un site unique de restriction pour l'insertion est plus simple et plus polyvalent.
    1. Insérer élément de réponse ou d'un site unique de restriction en utilisant l'extension d'épissage chevauchement (SOE) PCR. Cette méthode a été décrite en détail 31.
    2. Si l'on utilise un site de restriction pour l'insertion, purchasser synthétisé dans le commerce, le sens PAGE purifié et ultramers antisens codant pour les séquences d'insertion flanqués par les séquences d'extrémité protubérante du site de restriction unique (figure 2).
    3. Combiner 0,5 ug sens ultramer, 0,5 pg anti - sens ultramer, un tampon de ligature d' ADN à une concentration finale de 1 x, et porter à 50 ul avec du H 2 O. recuire le ultramers en incubant la réaction à 85 ° C pendant 10 min, puis réduction de la température par 0,5 ° C toutes les 30 secondes jusqu'à ce que la réaction atteigne 25 ° C.
    4. Combiner 0,5 pg d'ADN du vecteur codant pour le nouveau site de restriction unique, une enzyme tampon jusqu'à une concentration finale de 1 x, 1 pl de l'enzyme de restriction appropriée, et amener à un volume final de 20 ul avec du H 2 O. Digest du vecteur à 37 ° C pendant 2 heures. On purifie l'ADN linéarisé par purification sur gel d' agarose 32.
    5. Ligaturer les ultramers recuits dans le vecteur digéré pendant la nuit à 16 °; C en utilisant un mélange 3: 1 ultramers: rapport molaire vecteur et des techniques de ligature standard 33.
      Remarque: Lors de l'utilisation d'un site unique d'enzyme de restriction pour l'insertion, il peut être plus efficace pour déphosphoryler les extrémités du vecteur digéré et phosphoryler les extrémités des oligonucléotides recuits.
    6. Transformer l'ADN ligaturé dans E. coli en utilisant le procédé de choc thermique 34.
      NOTE: Plasmides codant pour les génomes viraux sont généralement de grande taille, donc en utilisant des cellules compétentes optimisées pour l'absorption de grandes constructions d'ADN peuvent augmenter l'efficacité de transformation.
    7. On purifie l' ADN plasmidique à partir de colonies individuelles en utilisant un kit de purification disponible dans le commerce 35. Identifier un clone approprié avec l'élément de réponse microRNA dans l'orientation correcte (figure 2) , par séquençage de la région d'insertion 36.

2. Secourir microRNA ciblées Picornavirus from ADN plasmidique

  1. Picornavirus sauvetage microARN ciblée dans une lignée cellulaire permissive pour la réplication du virus qui ne l'exprime pas microARN (s) idoine. Ce protocole utilise des cellules H1-HeLa parce qu'ils n'expriment pas miR-142, miR-124, ou miR-125, mais il est pas nécessaire d'utiliser des cellules H1-HeLa pour le sauvetage.
    ATTENTION: Toutes les lignes directrices pour la manipulation et l'élimination des agents infectieux doivent être respectées en conséquence.
    1. Plaque de cellules H1-HeLa dans une plaque à 6 puits de telle sorte qu'ils sont ~ 80% de confluence au moment de la transfection (24 h après l'ensemencement). cellules de la plaque dans 2 ml par puits de DMEM supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 10%.
    2. Chauffer le réactif de transfection à la température ambiante. Combinez 250 médias uL sans sérum, 2,5 pg de plasmide ADN codant pour le génome de microRNA ciblée, et 7,5 pi de réactif de transfection dans un tube à centrifuger stérile et pipette doucement pour mélanger. Incuber le mélange à température ambiante pendant 15 à 30 min.
    3. Aspirer lemédias à partir des cellules ensemencées et ajouter 2 mL de milieu complet frais.
    4. Ajouter le mélange de transfection ensemble de l'étape 2.1.2 à un puits de la goutte à goutte plaque à 6 puits. Ajouter chaque goutte à une autre zone du puits.
    5. Incuber les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que des effets cytopathiques (CPE) ou de protéines rapporteurs sont détectables (~ 24 à 72 heures).
  2. La récolte et le passage du virus récupéré sur des cellules fraîches.
    1. les cellules de plaque dans une plaque à 6 puits de telle sorte qu'elles sont confluentes à 80-90% au moment de l'infection (24 heures après l'ensemencement).
      REMARQUE: l'échelle vers le haut ou vers le bas en fonction de la quantité de virus nécessaire pour toutes les expériences ultérieures.
    2. Récolter chaque puits de secours en raclant les cellules dans le surnageant en utilisant un grattoir de cellules en caoutchouc ou spatule en caoutchouc. faites glisser doucement le racleur à travers le fond du puits. Transférer les cellules et le surnageant dans un tube de stockage cryogénique.
    3. Congélation / décongélation des échantillons deux fois, puis sédimenter les débris cellulaires parcentrifuger à 1200 xg pendant 5 min à 4 ° C.
    4. Filtrer le surnageant clarifié deux fois en utilisant 0,2 um filtres de seringue. Le surnageant filtré contenant de sauvetage du virus.
      REMARQUE: la taille des pores du filtre peut varier en fonction de la taille des particules de virus et peut ne pas être applicable à de grands virus.
    5. Aspirer le milieu des cellules étalées, laver une fois avec des milieux sans sérum et ajouter 1 ml de milieu sans sérum frais à chaque puits.
    6. Ajouter 50 ul par puits de surnageant filtré de sauvetage et balancer doucement la plaque pour répartir uniformément le virus.
    7. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 2 h et les médias alors aspirés de chaque puits pour éliminer le virus non constituée en société.
    8. Ajouter 1,5-2 ml de milieu complet frais par puits et incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les protéines de CPE ou rapporteurs sont apparents (~ 24-48 h).
    9. Répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.4. Filtré surnageant de secours contient stock de virus. stocks de virus de magasin à usage unique aliquotes dans des tubes de stockage cryogénique à -80 °C.

3. Secourir Virus microRNA ciblée de transcrits in vitro des ARN transcrits

  1. Générer des transcrits d'ARN à partir d'ADN plasmidique codant pour le génome viral microRNA ciblée au moyen d'un promoteur en amont.
    NOTE: Les pratiques standard pour créer et maintenir un environnement sans nucléase doivent être utilisés pour toutes les étapes ultérieures.
  2. Linéariser l'ADN plasmidique en utilisant un site d'enzyme de restriction en aval de la transcription. Combiner l' ADN de plasmide 5 pg, 1 x tampon concentration finale d'enzyme, 3 ul d' enzyme de restriction et porter à 50 ul avec du H 2 O. On incube la réaction à 37 ° C pendant 3 h.
  3. Ajouter 1/20 ème volume de 0,5 M EDTA, 1/10 ème volume de 5 M NH 4 acétate et 2 volumes d'éthanol à 100% à la réaction digéré et mélanger. Incuber à -20 ° C pendant 1 h jusqu'à la nuit.
  4. Pellet l'ADN précipité pendant 10 min à 17 000 xg à 4 ° C. Verser le supernatant, remettre en suspension le culot dans 500 ul d'éthanol froid à 70% et un culot l'ADN par centrifugation à 17 000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
  5. Décanter le surnageant et on centrifuge à nouveau pendant 30 sec. Retirer le surnageant résiduel avec une pipette et air-sécher la pastille. Remettre en suspension la pastille d'ADN dans stérile sans nucléase H 2 O à une concentration de 0,5 à 1 ug / ul.
  6. Décongeler les réactifs in vitro de transcription dans à la température ambiante et placez les ribonucléotides sur la glace (enzymes dans le glycérol ne gèlent pas et doivent aller directement sur la glace). Maintenir le tampon de réaction à la température ambiante.
  7. Assembler la réaction de transcription dans un tube de PCR en combinant 2 ul chacun d'ATP, CTP, GTP et des solutions UTP, 2 pi 10 x tampon de réaction, 1 pg d'ADN linéarisé, 2 ul de l'enzyme, et amener à un volume final de 20 pi avec de la nuclease H 2 O. -free
  8. Laisser incuber la réaction à 37 ° C pendant 2 heures.
  9. Purifier les transcrits d'ARN.
    NOTE: Avant de commencer, préparer une solution de lavage avec de l'éthanol comme solution d'élution dirigée et préchauffer à 95 ° C pour l'étape d'élution.
    1. Amener la réaction de transcription à 100 ul avec la solution d'élution (non préchauffé). Ajouter 350 pi de concentré de solution de liaison et de 250 ul d'éthanol à 100% à la réaction et mélanger.
    2. Transférer l'échantillon dans une cartouche filtrante insérée dans un tube de collecte et centrifuger pendant 1 min à 12 000 x g. Jeter l'écoulement.
    3. Ajouter 500 pi de solution de lavage à la cartouche filtrante et centrifuger pendant 1 min à 12 000 x g. Jeter l'effluent. Répétez cette étape de lavage une fois de plus. Jeter l'effluent. Centrifuger pendant 1 min à 12,0000 xg pour éliminer l'éthanol résiduel.
    4. Transférer la cartouche de filtre à un tube collecteur et ajouter 50 ul de la solution d'élution préchauffé à la cartouche filtrante. Centrifuger 1 min à 12000 x g. Répéter cette étape d'élution, pour un volume total de 100 pi d'eluant suiteaining transcrits d'ARN purifié. Jeter le filtre-cartouche.
  10. Déterminer la concentration d'ARN dans l'éluant en mesurant l'absorbance de l'échantillon à 260 et 280 nm et en utilisant la loi de Beer-Lambert.
  11. Évaluer l'intégrité de l'ARN en utilisant un gel d' ARN électrophorèse 37. Voir Figure 3 pour des exemples de bonnes et mauvaises intégrité de l' ARN. ARN doit être aliquote dans des tubes à usage unique et stocké à -80 ° C pour maintenir l'intégrité.
  12. transfection réactifs chauds à la température ambiante. Combinez 250 médias ul sans sérum, 2,5 pg de transcrits d'ARN purifiés, 5 pi de solution d'amplification, et 5 pi de réactif de transfection dans un tube à centrifuger stérile et pipette doucement pour mélanger. Incuber le mélange à température ambiante pendant 2-5 min.
  13. Plaque de cellules H1-HeLa dans une plaque à 6 puits de telle sorte qu'ils sont ~ 80% de confluence au moment de la transfection (24 h après l'ensemencement). cellules de la plaque dans 2 ml par puits de DMEM additionné de 10% fetsérum bovin al.
  14. Aspirer les médias des cellules étalées et ajouter 2 ml de milieu complet frais.
  15. Ajouter le mélange de transfection ensemble de l'étape 3.12 à un puits de la goutte à goutte plaque à 6 puits. Ajouter chaque goutte à une autre zone du puits.
  16. Incuber les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que des effets cytopathiques (CPE) ou de protéines rapporteurs sont détectables (~ 24 à 72 heures).
  17. Continuer le sauvetage du virus de la microRNA ciblée comme décrit dans les étapes 2.2 à 2.2.9.

4. Titrer Stocks de virus par calcul Tissue-culture de 50% la dose infectieuse (DICT 50)

  1. Cellules Plate H1-HeLa dans une plaque à 96 puits à 10 4 cellules par puits dans DMEM supplémenté avec du sérum de veau fœtal à 10%. Incuber les cellules à 37 ° C pendant une nuit.
    REMARQUE: Titrer virus dans les cellules permissives pour la réplication du virus qui ne se traduit pas microARN parentes.
  2. Faire 10 fois des dilutions en série de virus chacune dans un volume total de 1 ml de exempt de sérummédias.
    REMARQUE: Utiliser des dilutions inférieures si une plus grande précision est requise.
    REMARQUE: Modifier conseils après chaque dilution pour éviter une surestimation du titre que le virus peut coller des conseils.
  3. Astuce plaque à 96 puits pour les médias de côté et aspirée à partir de cellules HeLa plaqué. Ajouter 100 ul de chaque dilution de virus par puits à 8 puits de plaque à 96 puits (1 ligne par dilution). Ajouter 100 pi de milieu sans sérum sans virus à la ligne 1 et ligne 12 sur la plaque pour les contrôles.
    NOTE: Toujours aspirer et ajouter des médias à des puits en touchant la pointe à l'autre de bien pour empêcher le détachement des cellules.
  4. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 2 heures. plaque Astuce sur le côté et aspirer les médias des puits.
    REMARQUE: Modifier conseils entre chaque rangée de dilution.
  5. Ajouter 100 ul de milieu complet par puits. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 72 heures.
  6. Visualisez les puits sous un microscope et marquer chaque puits positif ou négatif pour CPE.
  7. Calculer chaque titre viral à l'équation suivante: Log 10 (DICT 50 / ml) = L + D (S-0.5) + log 10 (1 / V). L est le logarithme négatif 10 de dilution de virus le plus concentré testé dans lequel tous les puits sont positifs. D est le log 10 du facteur de dilution. S est la somme des proportions individuelles (pi). pi est la proportion calculée d'une dilution individuelle (quantité de puits positifs / nombre total de puits par dilution. V est le volume de l'inoculum (ml / puits).

figure-protocol-1
Tableau 1: Quantification des particules virales infectieuses en calculant la TCID50. Les résultats représentatifs à partir de cellules infectées par une série de dilutions de dix fois d'un stock de virus. "L" équivaut à 4 parce que la dernière dilution où tous les puits sont positifs pour CPE est de 10 -4. "D" est le journal 10 des dilutions 10 depuis 10 foisont été utilisés et il est donc égal à 1. «S» est la somme des proportions individuelles. Dans cet exemple, les proportions individuelles sont 1,0, 0,875, 0,375, 0,125 et 0. La somme de ces derniers (S) est 2,375. "V" est le volume en ml de l'inoculum utilisé pour infecter des cellules initialement.

5. Évaluer l'efficacité microARN-ciblage: Cinétique de croissance unique étape

  1. Les commandes de cet essai comprennent des cellules pseudo-infectées, le virus non modifié et le virus contenant un élément de réponse non-ciblé ou non fonctionnel.
  2. Plaque de cellules H1-HeLa pour une expérience de décours temporel dans les 12 puits des plaques de culture de tissu de telle sorte qu'elles sont confluentes à 80-90% au moment de l'infection (24 heures après l'ensemencement). cellules de la plaque dans du DMEM supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 10% à 1 ml par puits.
    NOTE: Nous vous recommandons de plaquer une plaque séparée pour chaque point de temps. Ce protocole utilise 7 points de temps différents pour un virus avec un cycle de replication de 8 à 12 heures. cellules H1-HeLa ne sont pas tenus d'effectuer cette uneéssayé. Cet essai doit être effectué dans des cellules permissives qui ne manifestent pas les micro-ARN ciblés. Ce dosage peut également être effectuée dans des cellules exprimant les micro-ARN apparentés afin d'évaluer la cinétique de croissance sous une pression sélective.
  3. Aspirer le milieu des puits. Laver les puits en ajoutant 0,5 ml de milieu sans sérum à chaque puits, agiter la plaque, et les médias d'aspiration des puits. Ajouter 0,5 ml de milieu sans sérum frais à chaque puits.
  4. Infect chaque puits à une multiplicité d'infection élevé (MOI; nombre de particules infectieuses par cellule) pour assurer que toutes les cellules sont infectées. Ce protocole utilise une MOI de 3.
    1. Diluer les stocks de virus dans le milieu sans sérum à une concentration de MOI = 3 pour 100 ul. Ajouter 100 ul de dilution de virus chacun à sept puits différents et incuber à 37 ° C pendant 2 h.
    2. Aspirer les médias de tous les puits et laver deux fois en ajoutant 0,5 ml de milieu complet par puits, balançant doucement, puis aspirer.
  5. Ajouter 1 mL de cmédias emplissez à chaque puits et incuber à 37 ° C jusqu'à ce point de temps désiré.
  6. Prélever des échantillons pour le titrage du virus au post-infection 2, 4, 6, 8, 10, 24 et 48 h (1 puits par point de temps). Transférer 700 ul des médias dans le puits d'un tube de stockage cryogénique. Grattez les cellules dans le surnageant restant en déplaçant doucement un racloir en caoutchouc sur l'ensemble du bien. Transférer le mélange de cellules / surnageant dans le tube correspondant de stockage cryogénique contenant 700 ul de surnageant.
    REMARQUE: Assurez-vous de ne pas éclabousser surnageant d'un puits dans un autre au cours de grattage résultant dans des échantillons contaminés. Le transfert des 700 pi avant raclage permettra de minimiser les éclaboussures.
  7. Placer les échantillons à -80 ° C jusqu'à ce que tous les échantillons soient collectés.
  8. Geler / dégeler les échantillons trois fois et éliminer les débris cellulaires par centrifugation les échantillons à 1200 g pendant 5 min à 4 ° C.
  9. Titrer le virus tel que décrit dans la section 4 et de comparer la cinétique de croissance sur time.

6. Évaluer microARN ciblant Spécificité: Imite microRNA synthétique Virus répartition Assay Utilisation

NOTE: L'utilisation d'un microARN mimétique synthétique est réalisée pour montrer la spécificité du microARN: interaction microRNA-cible.

  1. Inclure la transfection simulée, microRNA témoins négatifs imitent et microRNA expérimentales imitent seules commandes pour chaque test pour évaluer la toxicité de microRNA-médiée. Il est également idéal pour inclure un contrôle positif (ie gène ou génome microRNA ciblée) comme la faible efficacité de transfection imite microARN peut entraîner des faux négatifs.
  2. Plaque de cellules H1-HeLa dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits de telle sorte qu'elles sont confluentes à 80-90% au moment de la transfection (24 h après l'ensemencement). cellules de la plaque dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin à 0,1 ml par puits.
    REMARQUE: Effectuez ce test dans les cellules permissives pour la réplication virale qui n'expriment pas les microARN parentes.
  3. e chaude transfection réactifs à température ambiante. Combiner les médias sans sérum 9 pi, 200 nM concentration finale par puits de microRNA Stock mimique, 0,18 ul de réactif d'amplification, 0,18 ul de réactif de transfection et mélanger. Incuber le mélange à température ambiante pendant 2-5 min.
    NOTE: Les volumes indiqués sont par bien. Il est recommandé un mélange maître être assemblé pour la transfection de tous les puits pour maintenir la cohérence et de minimiser les erreurs de pipetage. La concentration optimale des micro-ARN mimétique peut varier. Consulter les instructions du fabricant accompagnant le microARN miment pour une concentration de départ raisonnable. En général, cela se situera entre 5-200 concentrations finales nM.
  4. Aspirer les médias des puits et ajouter 92 ul de milieu complet frais.
    NOTE: S'il y a un nombre important d'échantillons, effectuer cette étape avant d'assembler la solution de transfection et de stocker la plaque à 37 ° C jusqu'au moment.
  5. Ajouter la totalité du mélange de transfection in étape 6.3 aux cellules goutte à goutte.
  6. Incuber à 37 ° C pendant 6 h.
  7. Infect chaque puits à un faible MOI pour assurer un faible pourcentage de cellules sont infectées pour permettre une analyse de la propagation du virus. Ce protocole utilise une MOI de 0,2.
    1. Diluer les stocks de virus dans le milieu sans sérum à une concentration de MOI = 0,2 pour 100 ul. Retirez le support des puits et ajouter 100 pi de dilution de virus par puits.
    2. Incuber à 37 ° C pendant 2 h.
  8. Aspirer le milieu de chaque puits et ajouter 100 pi de milieu complet frais.
  9. Incuber à 37 ° C pendant 20-22 h.
  10. Déterminer le titrage du virus dans les surnageants.
    1. Recueillir le surnageant de chaque puits et le remplacer par 100 ul de milieu complet frais.
      Remarque: Si l'on utilise des cellules en suspension, remettre en suspension le culot de cellules provenant de l'étape suivante dans 100 ul de milieu complet frais et revenir à puits échantillon pour analyse de la viabilité.
    2. Retirer celludébris lar à partir des surnageants collectés par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
    3. Transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube et titrez virus infectieux sur les cellules permissives qui n'expriment pas les microARN parentes comme décrit dans la section 4.
      REMARQUE: Conservez tous les échantillons sur la glace pour empêcher la perte de l'infectivité.
  11. Déterminer la viabilité des cellules.
    1. Ajouter 10 ul de MTT (bromure de 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-diphényltétrazolium) réactif par puits.
    2. Incuber à 37 ° C pendant 2-4 h jusqu'à ce précipité violet est visible.
    3. Ajouter 100 ul de réactif de détergent.
    4. Incuber à température ambiante dans l'obscurité pendant 2 h.
    5. Lire l'absorbance de tous les puits à 570 nm.
      REMARQUE: Normaliser tous les échantillons pour se moquer de cellules transfectées pour la comparaison de la viabilité pour cent des cellules.

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Résultats

Le tableau 1 représente les résultats typiques d'une analyse de titrage pour un picornavirus et décrit comment calculer la dose infectieuse de culture tissulaire à 50%. Une représentation schématique du concept global de la réglementation sur la base microRNA-du tropisme viral décrit dans ce manuscrit est illustré à la figure 1. L'orientation de microARN à l' élément de réponse au cours des interactions intracellulaires, une bonne conception ...

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Discussion

La conception, la composition et la localisation des éléments de réponse microARN dans le génome viral dicteront ciblant l'efficacité et la spécificité. Optimisation de ceux-ci, il faudra essais et erreurs. Cependant, la conception rationnelle basée sur l' analyse structurelle de l' ARN et des études antérieures de la réplication virale et microARN signatures aides à la mise en œuvre de cette technique avec l' optimisation minimale 10, 11,

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Al et Mary Agnes McQuinn, la Fondation Richard M. Schulze et une subvention de secours des NIH de la Mayo Clinic ont financé les travaux représentatifs décrits ici.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Encodage RE OligonucléotidesIDTPAGE-PurifiedUltramer Sequence Designed by Investigator
Oligonucléotides codant un site de restriction uniqueSéquence IDT25nMDesigned by Investigator
Expand High Fidelity PCR KitSigma Aldrich11732641001De nombreux autres kits de PCR haute fidélité Polymerase Polymerase disponibles
T4 DNA LigaseSystem NEBM0202S
MEGAscript KitThermoFisher ScientificAM1333
MEGAclear KitThermoFisher ScientificAM1908
0,5 M EDTAThermoFisher ScientificAM9260Gsans RNase
5 M NH4 AcétateThermoFisher ScientificN/ALivré en MEGAclear
Kit EthanolThermoFisher ScientificBP2818100
Eau sans nucléasesFisher ScientificAM9938
TransIT-2020 Réactif de transfectionMirusMIR 5404
TransIT-mRNA Réactif de transfectionMirusMIR 2225
0.2 &mu ; m filtre seringueMilliporeSLGP033RS
2 ml Tubes à bouchon à visSarstedt72.694.005
Racleurs cellulairesFisher Scientific08-100-241
MicroRNA ImiteDharmaconVaried
MTT Essai de prolifération cellulaireATCC30-1010K
Efficacité de sous-clonage DH5&alpha ; Cellules compétentesThermoFisher Scientific18265017
vecteurs pBlueScript IIAgilent TechnologiesVariable (par exemple 212205)Il existe différents plasmides avec des promoteurs T7 ou T3 et des sites de clonage variables pour permettre le clonage et la transcription de l’ARN.

Références

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