Vasodilatation des vaisseaux isolés et l&#39;isolement de la matrice extracellulaire de souris Tight-peau

Dorothee Weihrauch; John G. Krolikowski; Deron W. Jones; Tahniyath Zaman; Omoshalewa Bamkole; Janine Struve; Paul S. Pagel; Nicole L. Lohr; Kirkwood A. Pritchard, Jr.

doi:10.3791/55036

Article de méthode

Vasodilatation des vaisseaux isolés et l'isolement de la matrice extracellulaire de souris Tight-peau

DOI :

10.3791/55036

⸱

24 mars 2017

Dorothee Weihrauch¹ , John G. Krolikowski¹^,² , Deron W. Jones³ , Tahniyath Zaman³ , Omoshalewa Bamkole¹ , Janine Struve⁴ , Paul S. Pagel⁵ , Nicole L. Lohr⁶ , Kirkwood A. Pritchard, Jr.³

¹Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, ²Clement J. Zablocki Veterans Affairs Medical Center, ³Department of Surgery, Division of Pediatric Surgery, Children's Research Institute, ⁴Department of Orthopedic Surgery, Medical College of Wisconsin, ⁵Deptarment of Anesthesiology, Clement J Zblocki Veteran Affairs Medical Center, ⁶Department of Medicine, Division of Cardiology, Medical College of Wisconsin

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons l’isolement de la matrice extracellulaire cardiaque chez des souris témoins C57Bl/6J, des souris à peau serrée et des souris à peau serrée traitées avec le peptide inhibiteur IRF5. Nous décrivons également les études de vasodilatation sur les vaisseaux isolés de C57Bl/6J, de souris à peau serrée et de souris à peau serrée traitées avec le peptide inhibiteur d’IRF5.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le facteur régulateur de l’interféron 5 (IRF5) est crucial pour que les cellules déterminent si elles répondent de manière pro-inflammatoire ou anti-inflammatoire. La capacité d’IRF5 à faire passer les cellules d’une voie à une autre est très attrayante en tant que cible thérapeutique. Nous avons conçu un peptide leurre IRF5D avec un logiciel de modélisation moléculaire pour concevoir de petites molécules et des peptides.

IRF5D a inhibé IRF5, réduit les altérations de la matrice extracellulaire et amélioré la vasodilatation endothéliale chez la souris à peau serrée (Tsk/+). Le K_d d’IRF5D pour IRF5 recombinant est de 3,72 ± 0,74 x ^10-6M, tel que déterminé par des expériences de liaison à l’aide d’expériences d’interférométrie de biocouche. La prolifération et l’apoptose des cellules endothéliales (CE) étaient inchangées à l’aide de concentrations croissantes d’IRF5D (0 à 100 μg/mL, 24 h). Des souris Tsk/+ ont été traitées par IRF5D (1 mg/kg/j par voie sous-cutanée, 21 j). Les expressions d’IRF5 et d’ICAM ont diminué après le traitement par IRF5D. La fonction endothéliale a été améliorée, comme l’a évalué la vasodilatation des artères faciales chez les souris Tsk/+ traitées avec IRF5D par rapport aux souris Tsk/+ sans traitement IRF5D. En tant que facteur de transcription, IRF5 se déplace du cytosol vers le noyau. La translocation a été évaluée par immunohistochimie sur des myocytes cardiaques cultivés sur les différentes matrices extracellulaires cardiaques. Le traitement IRF5D de la souris Tsk/+ a entraîné une réduction du nombre de noyaux positifs à IRF5 par rapport aux animaux sans traitement IRF5D (50 μg/mL, 24 h). Ces résultats démontrent le rôle important que joue IRF5 dans l’inflammation et la fibrose chez les souris Tsk/+.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La régulation de la croissance cellulaire et les réponses immunitaires de mort cellulaire est essentielle pour le rôle de la famille des facteurs de transcription de facteurs de régulation de l'interféron. IRF5 est soulignée comme étant cruciale pour la régulation des réponses immunitaires entre le type 1, une réponse inflammatoire et la promotion de type 2, une réparation tissulaire réponse immunitaire ciblage. IRF5 est la clé ¹ dans le cancer, l' auto - immunité et ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^5.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Institutional Animal Care et utilisation Comité (Protocole: AUA # 1517). Toute recherche impliquant des souris a été réalisée en conformité avec la politique du PHS.

1. Conception de Decoy Peptide

Trouver la structure 3D de la IRF5 et baser la conception sur elle. Concevoir un 17 mer, appelé IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), où aspartate (D) est remplacé par la serine (S) pour imiter la phosphorylation dans IRF5 à 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). An....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les résultats ont démontré à la figure 1 montrent comment concevoir un peptide. La figure 1, en haut à gauche montre la zone (entre les 2 flèches jaunes, les acides aminés (aa) 425-436) dans IRF5 qui est phosphorylée par un certain nombre de kinases. Figure 1, en haut à droite, montre un ovale jaune où domaine phosphorylée de IRF5 lie. La structure dimérique de 3DSH a été mis en rotation pour observer une fente ou une vallée à la gauche .......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'objectif était de concevoir un inhibiteur de IRF5 pour élucider le rôle de IRF5 sur l'inflammation, la fibrose et la fonction vasculaire dans le cœur des Tsk / + souris. Les conclusions sont que IRF5D n'a pas induit la prolifération ou l'apoptose. En outre, l'inflammation a été réduite et la fonction vasculaire améliorée. Ces données suggèrent que IRF5 joue un rôle mécanistique important dans le développement de l'inflammation et de la fibrose dans le cœur de souris + / Tsk, et qu'il a le p.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les subventions NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) et HL-102836 (KAP) et Cimphoni Life Sciences (partie du salaire de DW). Les auteurs remercient Meghann Sytsma pour l’édition du manuscrit.

....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
; Triton X 100	Sigma Aldrich	X100- 100ml
Alexa 488-labellisé chèvre anti-souris Anticorps IgG ;	Thermo Fisher	A11001
Bardford réactif	Thermo Fisher	23200	Pierce ;
Biocapteurs	Forte-Bio	MR18-0009
CD64 (H-250)	Santa Cruz Biotechnologies	sc-15364
CellEvent Caspase-3/7 Substrat	Thermo Fisher/Life Technologies	C10427
CellTiter AQueous One Solution Kit de dosage de la prolifération cellulaire	Promega	G3580	Promega
DAPI (4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole)	Thermo Fisher	D-1306	dilution 1:1 000 dans PBS
âne anti rat Alexa 488	Thermo Fisher	A-21208	dilution 1:1 000 dans PBS
ECL plus	GE healthcare/Amersham	RPN2133	Après beaucoup d’essais et d’erreurs, nous sommes revenus à celui-ci
Microscope Eclipse TE 200-U avec logiciel
chèvre anti lapin Alexa 488	Thermo Fisher	A-11008	Dilution de 1:1 000 dans le PBS
HRP ; anti-chèvre	Santa Cruz Biotechnologies	sc-516086	!:10 000 dilution dans l’anti-souris TBS
HRP	Donkey Santa Cruz Biotechnologies	sc-2315	Dilution de 1:10 000 dans l’anticorps TBS
ICAM-1	Santa Cruz Biotechnologies	sc-1511	Dilution de 1:200 dans l’anticorps PBS
IRF5 (H56)	Santa Cruz Biotechnologies	sc-98651
Lecteur de microplaques Elx800	Biotek
NIMP marqueur de neutrophiles	Santa Cruz Biotechnologies	sc-133821	Dilution 1:200 dans l’octet PBS
RED	Forte Bio		liaison protéine-protéine
Conception peptidique ; Logiciel Medit SA	RCSB.org
Synthèse de protéines IRF5 recombinante	TopGene Technologies		Expression des protéines, service de synthèse
dodécylphosphate de sodium	Sigma Aldrich	436143	détergent
Kétamine	Pharmacie		Substance contrôlée de l’annexe III, précision requise ;
Xylazine	MedVet
3.5X-45X Stéréomicroscope à zoom de dissection trinoculaire avec lumières LED à col de cygne	Am Scope	SKU : SM-1TSX-L6W
Colonnes de dessalage Zeba	Thermofisher	2161515
Endothélial Basal Media EBM Bullet kit	Lonza	CC-3124	contient des suppléments de croissance
VIA-100K	; Boeckeler Instruments
4 - 15 % TGX gel	Bio-Rad	5671081
logiciel MedSuMo	Medit, Palaiseau, France
Laemmli Buffer	BioRad

de balayage laser EZ C1 Nikon

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).
Dideberg, V., et al.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Peptide inhibiteur d IRF5 dissection de l art re fascialis isolation de la MEC cardiaque mesure de la vasodilatation interf rom trie de couche biologique immunohistochimie dosage de Bradford

Vasodilatation des vaisseaux isolés et l'isolement de la matrice extracellulaire de souris Tight-peau

Dans cet article

Résumé

Résumé

Introduction

Protocole

Résultats

Discussion

Déclarations de divulgation

Remerciements

Matériaux

Références

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Articles connexes