Dérivation des cultures leptoméninge explants de Postmortem humaines donateurs cerveau

Résumé

Le protocole de culture leptoméninge explant de post-mortem du cerveau humain est un moyen techniquement robuste et simple pour obtenir des fibroblastes méningées fibronectine positifs dans les 6-8 semaines et cryoconservation environ 20-30000000 cellules.

Résumé

Même si des progrès considérables ont été accomplis dans la caractérisation clinique de la maladie de Parkinson, de nombreuses études indiquent que le diagnostic de la maladie de Parkinson n'a pas pathologiquement confirmé dans jusqu'à 25% de la maladie de Parkinson diagnostiquée cliniquement. Par conséquent, les tissus prélevés chez des patients cliniquement diagnostiqués avec la maladie de Parkinson idiopathique peut avoir un taux élevé d'erreur de diagnostic; par conséquent , des études in vitro à partir de ces tissus pour étudier la maladie de Parkinson comme un modèle pré - clinique peut devenir inutile.

En recueillant leptoméninge humains post - mortem avec un diagnostic neuropathologique confirmé de la maladie de Parkinson et caractérisé par la perte de cellules nigro et inclusions protéiques intracellulaires appelées corps de Lewy, on peut être certain que le parkinsonisme cliniquement observé est pas causée par un autre processus pathologique sous - jacent (par exemple , la tumeur, l' artériosclérose).

Ce protocole présents la dissection et la préparation des leptoméninge humains post-mortem pour la dérivation d'une culture de fibroblastes méningée. Cette procédure est robuste et a un taux de réussite élevé. Le défi de la culture est la stérilité que l'acquisition du cerveau est généralement pas réalisée dans des conditions stériles. Par conséquent, il est important de compléter le milieu de culture avec un cocktail de pénicilline, streptomycine et amphotéricine B.

La dérivation des fibroblastes méningées des cas d' autopsie confirmés de la maladie de Parkinson est la base pour la modélisation in vitro de la maladie de Parkinson. fibroblastes méningées apparaissent 3-9 jours après la préparation des échantillons et environ 20-30 millions de cellules peuvent être cryoconservés dans 6-8 semaines. La culture de fibroblastes méningée est homogène et les cellules expriment la fibronectine, un marqueur couramment utilisé pour identifier les méninges.

Introduction

Méninges se composent de trois membranes qui protègent le cerveau: la dure-mère-mère, arachnoïde et la pie. Plus récemment, il a été reconnu que les méninges jouent également un rôle important dans le développement du cerveau et du cerveau homéostasie ^1. Méninges sont dérivées de cellules mésenchymateuses et dérivées de la crête neurale et de façon intéressante, il a été démontré que les cellules souches résidant dans les méninges peuvent donner naissance à des neurones in vitro et in vivo après transplantation ^{2, 3, 4.} Les cultures ....

Protocole

L'enregistrement cerveau don comprend la documentation par le déclarant de leur intention de faire un don. L'autorisation d'autopsie pour la récupération des tissus est fournie par le plus proche parent dans la mesure permise par la loi. Les études de recherche à l'aide de spécimens d'autopsie recueillies sont examinées par le comité d'examen institutionnel (IRB) pour assurer la conformité avec Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) règlements.

REMARQUE: Les échantillons sont collectés par leptoméninge le dissecteur cerveau ou neuropathologue au cours d'une dissection du cerveau et sont sto....

Résultats

Lorsque le protocole de traitement de leptoméninge a réussi, l'excroissance des fibroblastes méningés est d'abord observé trois à neuf jours après la dissection, bien que cela peut dépendre de la durée de l'intervalle post-mortem du cerveau. La figure 1 montre des cultures de fibroblastes méningées de quatre donneurs différents. La figure 1A montre une pièce tenue par une lamelle de verre (diagonale sombre) et fibroblaste excroissance autour .......

Discussion

Ce protocole décrit un protocole simple et robuste pour dériver une culture de fibroblastes méningée de leptoméninge post-mortem humains recueillies conjointement avec un don de cerveau. Il y a très peu de descriptions de protocoles pour dériver des cultures de cellules de matériel humain post-mortem. Deux études décrivent des cultures de fibroblastes ^{7, 8,} peau dérivé ^9, une étude décrit les échantillons ¹⁰

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Corning Boîtes de Pétri	Fisher Scientific	351029
Nunc Plaque à 6 puits	Fisher Scientific	14-832-11
Couvercles de 15 mm	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
Scalpels, lame stérile, n° 15	Miltex	4-415
Pince à pointe de précision incurvée	Fisher Scientific	16-100-122
Pipettes sérologiques	Fisher Scientific	13-678-11E
Pipettes Pasteur	Fisher Scientific	22-230490
Gelatin	Sigma	G1890-100G
Tampon phosphate Saline	Fisher Scientific	SH30264.02
Corning 500 mL Unité de filtration	Fisher Scientific	430770	Combiner les composants du média et filtre.
Flacons traités pour la culture cellulaire Nunc avec bouchons filtrants, T175 cm2  ;	Thermo Scientific	178883
Nom	Société	Numéro de catalogue	Comments
>Growth Media
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclone FBS	Fisher Scientific	SH30910.03
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)	Thermo Fisher	11140-050
Supplément GlutaMAX (100x)	Thermo Fisher	35050-061
Pyruvate de sodium (100 mM)	Thermo Fisher	11360-070
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122
Amphotéricine B (solution jaune/250 µ ; g/mL)	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Coloration à la fibronectine
8 lames de chambre de puits  ;	Fisher Scientific	1256518
20 % de paraformaldéhyde  ;	Microscopie électronique Sciences	15713
Triton X-100  ;	Sigma	T8787
100 % Glycérol  ;	BioRad	9455
Sérum de chèvre 100 % normal  ;	Fisher Scientific	101098-382
Anticorps anti-Fibronectine [F1]	Abcam	ab32419	Dilution 1:300 dans une solution bloquante
Anti-SERPINH1	Sigma	S5950-200ul	Dilution 1:250 dans une solution bloquante
Anti-SOX2	Millipore	MAB4343	dilution 1:100 dans une solution bloquante
Anti-Nestin	Millipore	MAB5326	1:200 dilution dans une solution bloquante
Anti-TUJ1	Covance	MMS-435P	dilution 1:1 000 dans une solution bloquante
Alexa Fluor 488 anti-lapin	Thermo Fisher	A11029	dilution 1:400 dans une solution bloquante ; (canal vert ; Ex/EM2 495/519 nm)  ;
Alexa Fluor 555 anti-souris	Thermo Fisher	A21424	dilution 1:400 dans une solution bloquante ; (canal rouge ; Ex/Em2 590/617 nm)  ;
Hoechst 33342 coloration	Thermo Fisher	H3570	diluer à une concentration finale de 1,0 &mu ; g/mL ; (chaîne bleue ; Ex/Em2 358/461 nm)
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