Article de méthode

la culture de Caenorhabditis elegans En trois dimensions dans le laboratoire

DOI :

10.3791/55048

⸱

12 décembre 2016

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons une méthode simple pour construire 3D systèmes de culture de nématodes appelés NGT-3D et NGB-3D. Ceux - ci peuvent être utilisées pour étudier le nématode fitness et des comportements dans des habitats qui sont plus semblables à Caenorhabditis elegans naturelles habitats que les laboratoires C. plaques de culture elegans 2D standard.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’utilisation d’organismes modèles génétiques tels que Caenorhabditis elegans a conduit à des découvertes fondamentales en biologie au cours des cinq dernières décennies. La plupart de ce que nous savons sur C. elegans se limite à la culture en laboratoire des nématodes qui ne reflètent pas nécessairement les environnements qu’ils habitent normalement dans la nature. La culture de C. elegans dans un habitat 3D plus similaire à la matrice 3D que les vers rencontrent dans les fruits pourris et le compost végétal dans la nature pourrait révéler de nouveaux phénotypes et comportements non observés en 2D. De plus, les expériences en 3D peuvent aborder la pertinence des phénotypes que nous observons en 2D pour le ver dans la nature. Ici, une nouvelle méthode dans laquelle C. elegans grandit et se reproduit normalement en trois dimensions est présentée. La culture de C. elegans dans le tube de croissance des nématodes 3D (NGT-3D) peut nous permettre de mesurer la capacité de reproduction des souches de C. elegans ou de différentes conditions dans un environnement 3D. Nous présentons également une nouvelle méthode, appelée Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), pour cultiver C. elegans en 3D à des fins d’analyse microscopique. Ces méthodes permettent aux scientifiques d’étudier la biologie de C. elegans dans des conditions qui reflètent davantage les environnements qu’ils rencontrent dans la nature. Ceux-ci peuvent nous aider à comprendre la pertinence évolutive sous-jacente de la physiologie et du comportement de C. elegans que nous observons en laboratoire.

Introduction

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L’étude en laboratoire du nématode Caenorhabditis elegans a conduit à des découvertes fondamentales dans le domaine de la biologie au cours des cinq dernières décennies1. C. elegans a été le premier organisme multicellulaire à avoir son génome séquencé en 19982, et il a été inestimable pour comprendre les contributions des gènes individuels au développement, à la physiologie et au comportement d’un organisme entier. Les scientifiques cherchent maintenant à mieux comprendre comment ces gènes peuvent contribuer à la survie et à la capacité de reproduction des organismes dans leur environnement naturel, en posant des questions sur l’écologie et l’évolution aux niveaux génétiques3 à 5.

C. elegans peut une fois de plus fournir un excellent système pour répondre à ces questions. Cependant, on sait peu de choses sur la biologie de C. elegans dans les habitats naturels des nématodes, et il n’existe actuellement aucune méthode pour simuler les conditions naturelles contrôlées de C. elegans en laboratoire. En laboratoire, C. elegans est cultivé à la surface de plaques de gélose ensemencées de bactéries E. coli 6. Dans la nature, cependant, C. elegans et les nématodes apparentés peuvent être trouvés peuplant dans les sols du monde entier, mais on les trouve spécifiquement prospères dans les fruits en décomposition et la matière végétale7,8. Ces environnements complexes tridimensionnels (3D) sont très différents des environnements 2D simples auxquels les vers sont exposés en laboratoire.

Pour commencer à répondre aux questions sur la biologie des nématodes dans un cadre 3D plus naturel, nous avons conçu un habitat 3D pour la culture en laboratoire des nématodes que nous avons appelé Nematode Growth Tube 3D ou NGT-3D en abrégé9. L’objectif était de concevoir un système de croissance 3D qui permette une croissance, un développement et une fertilité comparables aux plaques standard 2D de milieux de croissance des nématodes (NGM)10. Ce système soutient la croissance des bactéries et des nématodes tout au long de leur cycle de vie en 3D, permet aux vers de se déplacer et de se comporter librement en trois dimensions, et est facile et peu coûteux à fabriquer et à utiliser.

Dans l’étude actuelle, nous proposons une méthode étape par étape pour fabriquer NGT-3D et évaluer le développement et la fertilité des vers. En plus d’évaluer la fitness des vers en 3D, nous avons cherché à imager, filmer et évaluer le comportement et la physiologie des vers en culture 3D. Ainsi, en plus de NGT-3D, nous présentons ici une méthode alternative appelée Nematode Growth Bottle 3D ou NGB-3D, pour l’imagerie microscopique de C. elegans lors de la culture 3D. Cela sera particulièrement important pour l’étude des comportements connus identifiés en 2D, et l’identification de nouveaux comportements uniques à la culture 3D.

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Protocole

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1. Préparer des solutions pour NGT-3D et NGB-3D

  1. Préparer les solutions stériles suivantes: 1 L de solution 0,1454 M de NaCl, 1 L de 1 M CaCl 2, 1 L de 1 M MgSO 4, Lysogénie Broth (LB), 1 L de 1 M KPO 4 tampon (108,3 g de KH 2 PO 4 et 35,6 g de K 2 HPO 4 et H 2 O compléter à 1 L). Production de NGM utilisant ces solutions peuvent être trouvées dans un précédent protocole 10.
  2. Solutions autoclave à 121 ° C, 15 min.
  3. Préparer 50 ml d'une / ml de solution stérile, 5 mg de cholestérol. Dans un tube conique de 50 ml, mélanger 0,25 g de cholestérol et de 50 ml de 99,99% d'éthanol et bien mélanger. Ne pas autoclaver. Stériliser la solution de cholestérol à l'aide d'une seringue de 50 ml avec un filtre à seringue de 0,45 um. Cela permettra également de supprimer tout le cholestérol non dissous.
  4. (Facultatif) Préparer 10 ml d'une 150 mM de 2'-désoxy-5-fluorouridine (FUdR) stock. Dans un tube conique de 15 ml, mélanger 0,3693 gde FUdR et 10 ml d'eau distillée. Bien agiter.

2. Préparer les bactéries de la culture pour NGT-3D et NGB-3D

  1. Inoculer 10 ml LB bouillon avec des bactéries. Les bactéries standards utilisés pour C. elegans alimentation est la souche E. coli OP50.
  2. La culture d'inoculation bactérienne à 37 ° C dans un incubateur avec agitation pendant une nuit.
  3. Dans la préparation d'une dilution en série, aliquotes de 9 ml de la solution de NaCl dans 15 ml tubes coniques stériles. Par exemple, aliquote 9 ml dans un total de 7 tubes pour obtenir une dilution de la souche 10 -7 OP50 E. coli.
  4. À l'aide d'une pipette stérile 1000 ul, pipette 1 ml de la culture bactérienne ou d'une culture bactérienne diluée dans le nouveau tube stérile avec 9 ml de solution de NaCl et bien vortexer le mélange de 10 ml. Répétez jusqu'à ce que la dilution bactérienne désirée soit atteinte.
    REMARQUE: La dilution bactérienne souhaitée dépend du type et de l'état des bactéries, ainsi que les conditions expérimentales précises.Par exemple, un 10 -6 - 10 -8 dilution de la souche OP50 de E. coli a été suffisante pour produire à partir de 1 - 200 colonies bactériennes par 6,5 ml Tube NGT-3D. Worms fiable développé et reproduit normalement lorsque le nombre de colonies était de plus de 60, qui a eu lieu à une dilution de 10 -6 à 10 -7. Pour NGB-3D, utiliser une dilution de 10 -8.

3. Faire NGT-3D et NGB-3D (200 ml)

  1. Après la préparation de la culture bactérienne, mélanger 0,6 g de NaCl, 1 g de granulé de la gélose et la peptone 0,5 g dans un flacon de 500 ml. Insérez une barre d'agitation magnétique dans le ballon.
  2. Ajouter 195 ml d'eau distillée et couvrir la bouche de la fiole avec une feuille d'aluminium.
  3. Autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
  4. Placer le ballon autoclavé chaud sur une plaque d'agitation, et agiter à une vitesse modérée pendant au moins 2 h. Refroidir le ballon à 40 ° C. Assurez-vous de refroidir suffisamment en continuant d'ici à des températures élevées peut conduire à opacification de l'agar fini.Cependant, des températures plus basses peuvent conduire à un durcissement prématuré de la gélose.
    1. (Facultatif) Pour accélérer le processus de refroidissement, placer le ballon dans un 40 ° C bain d'eau 15 min avant de le placer sur une plaque d'agitation.
  5. Lorsque la température du milieu gélose atteint 40 ° C, ajouter 200 pi de 1 M CaCl2, 200 ul de 5 mg / ml de solution de cholestérol, 200 pi de 1 M MgSÛ4 et 5 ml de 1 M KPO 4 tampon que la solution continue d'agiter à des concentrations finales de 1 mM de CaCl2, 5 ug / ml de cholestérol, 1 mM de MgSO 4, 1 mM KPO 4.
    1. (Facultatif) Pour l' essai de durée de vie NGT-3D ajouter 80 ul de mM FUdR 150 à une concentration finale de 120 uM 12.
  6. Ajouter 6 ml des 10 ml de culture bactérienne diluée à l'étape 2.4 dans le ballon directement.
    1. (Facultatif) Pour NGT-3D, retirez 6 ml de milieu agar avant l'étape 3.6 et le garder au chaud séparément. Ce média sera utilisé pour les bactéries librescouche supérieure.
  7. En utilisant des procédures stériles, distribuer les médias dans une chambre de culture stérile. Assurez-vous que le couvercle de la chambre se ferme hermétiquement.
    1. (Facultatif) Pour éviter des colonies bactériennes de se former à la surface supérieure de la gélose, faire une couche de bactéries libres-média agar de l'étape 3.6.1 sur le dessus avant que les médias de l'étape 3.7 durcit complètement. Cela va créer une zone exempte de bactéries dans le haut de la NGT-3D.
    2. Pour NGT-3D, versez 6,5 ml de milieu dans les 8 ml claires tubes à essai en plastique pour faire une couche de gélose bactéries, et distribuer soigneusement 200 pi des médias exempt de bactéries sur le dessus du support semi-durci 3D pour faire une aux bactéries mince couche libre sur le dessus.
    3. Pour NGB-3D, versez 65 ml de milieu dans les 25 cm 2 plastique transparent flacon de culture cellulaire. Ce montant doit remplir le corps de la 25 cm 2 de culture cellulaire bouteille.
  8. Laissez chambres verticalement à la température ambiante pendant une semaine pour permettre des colonies bactériennes de croîtred'une taille considérable d'au moins 1 mm de diamètre.
    1. (Facultatif) Pour l'essai de durée de vie dans NGT-3D, les chambres de couverture avec une feuille d'aluminium pour empêcher la dégradation de la lumière de FUdR.

4. Mesurer Fitness de la population de Ver sur NGT-3D (Brood relative Taille Assay)

  1. Choisissez un ver de stade L4 en utilisant un fil de platine sélectionner et transfert sur une plaque NGM exempt de bactéries. Laisser un ver de se déplacer librement autour pendant quelques minutes pour éliminer les bactéries attachées à son corps.
  2. Répétez l'étape 4.1 et assurez-vous que le ver est exempt de bactéries. En règle générale, deux répétitions de 4,1 suffisent.
  3. Placez délicatement le ver propre sur la surface du support 3D avec un pic de fil de platine. Le ver devrait finalement entrer dans l'agar dans la matrice d'agar 3D.
  4. Fermez le couvercle permettant lâche un peu d'air d'entrer dans le tube, mais empêchant le séchage du milieu agar.
  5. Incuber pendant 96 heures à 20 ° C.
  6. Après 4 jours, fermez le couvercle hermétiquement et placer lechambre de culture NGT-3D dans un bain d'eau C 88 ° pour faire fondre l'agar-agar. La chaleur tue les vers mais leurs corps restent intacts.
    NOTE: L'utilisation de 8 ml tubes pour NGT-3D, 20 - 30 minutes d'incubation est généralement suffisant.
  7. En utilisant une pipette en verre, transférer les médias fondus sur un plat en plastique de Pétri de 9 cm. pipettes en plastique ne sont pas informés, que les vers peuvent souvent tenir à eux.
  8. En utilisant un microscope à dissection transmission stéréo, compter le nombre de vers à la L3, L4 et stades adultes. Ne pas compter les vers qui sont stade L2 et les plus jeunes, les générations F1 et F2 peuvent être confondus ici. Ainsi, cette analyse est une analyse de la taille des couvées par rapport au lieu d'un dosage de la taille totale du couvain.

5. image et enregistrement Worm Comportement sur NGB-3D

  1. Choisissez un ver de stade L4 en utilisant un fil de platine sélectionner et éliminer toutes les bactéries collées à la surface par le transfert à une plaque NGM exempt de bactéries et de lui permettre de se déplacer librement pendant quelques minutes.
  2. Répétez l'étape 5.1 pour vous assurer que le worm est exempt de bactéries.
  3. Placez délicatement le ver propre sur le centre de la surface de la gélose de la NGB-3D à proximité du col de la bouteille avec un pic de fil de platine. Le ver devrait finalement entrer dans l'agar dans la matrice d'agar 3D.
  4. Fermez le couvercle permettant lâche un peu d'air d'entrer dans le tube, tout en empêchant le séchage du milieu agar.
  5. Image ou enregistrer le ver sous un microscope binoculaire transmission stéréo. Réglez la mise au point que le ver se déplace à travers la matrice 3D.

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Résultats

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La construction de NGT-3D est un protocole simple et direct qui se traduit par un tube d'essai d' agar-rempli avec de petites colonies bactériennes espacées tout au long de l'agar - agar (figure 1A). Les vers peuvent se déplacer librement à travers la matrice d'agar, la recherche et la consommation des colonies bactériennes. Pour vérifier si C. elegans peuvent se reproduire et se développer normalement dans NGT-3D, nous avons comparé la fertilité et le développe...

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Discussion

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La culture en laboratoire de C. elegans en utilisant les plaques de milieu de croissance des nématodes classiques était cruciale pour les centaines de découvertes importantes que la recherche en C. elegans a fourni. Ici, nous présentons de nouvelles méthodes pour cultiver C. elegans dans un environnement qui reflète plus fidèlement leurs habitats naturels en trois dimensions. Bien que d' autres méthodes ont été utilisées pour observer C. elegans 13 en 3D, ceci est le pr...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par un nouveau chercheur Grant [2014R1A1A1005553] de la National Research Foundation de Corée (NRF) à JIL; et un futur chef de l'Université Yonsei Défi Grant [2015-22-0133] pour JIL

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
LB bouillon, Miller (Luria-Bertani)Difco224620
Chlorure de sodiumDAEJUNG7548-440058.44 MW
Agar, granuléDifco214530
PeptoneBacto211677
Chlorure de calcium, dihydratéBio BasicCD00502*H2O ; 147.02 MW
CholestérolBio BasicCD0122386.67 MW
Alcool éthyliqueB& JRP090-199,99 %; 46,07 MW
Sulfate de magnésium anhydreBio BasicMN1988120,37 MW
Phosphate de potassium monobasique anhydreBio BasicPB0445136,09 MW
2'-désoxy-5-fluorouridineTokyo Industrie chimiqueD2235246,19 MW
Phosphate de potassium dibasique anhydreBio BasicPB0447174,18 MW
Tubes à essai polyvalentsStockwell ScientificST.8570ml
Bouchons pour tubes à essaiStockwell ScientificST.8575
Flacon de culture cellulaireSPL Lifescience7012525 cm2
Research StéréomicroscopeNikonSMZ18
Tête de caméra couleur haute définitionNikonDS-Fi2
Unité de commande basée sur PCNikonDS-U3
NIS-Elements Recherche fondamentale, Logiciel d’imagerie microscopeNikonMQS32000
8

Références

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Mots-clés

Culture de C elegansCroissance 3D des n matodesM thode NGT 3DM thode NGB 3DTube de croissance des n matodesFlacon de croissance des n matodesSolution de cholest rol st rileProtocole de dilution en s rieCroissance de colonies bact riennesTaille relative de la port e

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