Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Nano-Ligand Arrays cluster dans un pris en charge Lipid bicouches

6.6K vues

⸱

DOI :

10.3791/55060

⸱

23 avril 2017

 ,  ,  ,  , 
1Aix-Marseille Université, CNRS, UMR 7325, CINaM, 2State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science of Jiangnan University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour fonctionnaliser verre avec des taches de protéines nanométriques entourées par une bicouche lipidique fluide. Ces substrats sont compatibles avec la microscopie optique de pointe et devraient servir de plate-forme pour les études d'adhésion cellulaire et la migration.

Résumé

À l'heure actuelle, il y a un intérêt considérable dans la création de réseaux ordonnés d'îlots de protéines adhésives dans une mer de surface passivée pour les études biologiques cellulaires. Au cours des dernières années, il est devenu de plus en plus clair que les cellules vivantes répondent, non seulement à la nature biochimique des molécules qui leur sont présentées, mais aussi à la façon dont ces molécules sont présentées. Création de micro-motifs de protéines est donc maintenant la norme dans de nombreux laboratoires de biologie; nano-modèles sont également plus accessibles. Cependant, dans le contexte des interactions cellule-cellule, il est nécessaire de modèle non seulement des protéines, mais aussi des bicouches lipidiques. Un tel double patterning proteo-est jusqu'à présent lipidique pas été facilement accessible. Nous vous proposons une technique facile pour créer des protéines nano-points pris en charge sur le verre et de proposer une méthode pour remblayer l'espace inter-points avec une bicouche lipidique pris en charge (SLB). De photo-blanchiment de lipides fluorescents traceur inclus dans le SLB, nous démontrons que la double couche présente beaucoup en plane fluidité. Fonctionnaliser les points de protéines avec des groupes fluorescents permet d'imager eux et de montrer qu'ils sont ordonnés dans un réseau hexagonal régulier. La taille de point typique est d'environ 800 nm et l'espacement montré ici est de 2 microns. Ces substrats sont censés servir de plates-formes utiles pour l'adhésion cellulaire, la migration et les études mécano-détection.

Introduction

L'adhésion cellulaire a lieu par l'intermédiaire des molécules d'adhésion de cellules spécialisées (CAMs), des protéines présentes sur la membrane cellulaire qui sont capables de se lier à leur homologue sur la matrice extra-cellulaire ou sur une autre cellule. Sur les cellules adhérées, la plupart des molécules d'adhésion , y compris l'intégrine ubiquitaire et cadhérine, se trouvent sous la forme de groupes 1. L'interaction des lymphocytes T (cellules T) avec des cellules présentant l'antigène (APC) fournit une illustration particulièrement frappante de l'importance des amas de récepteurs formés à l'interface entre les deux cellules - souvent appelé une synapse immunologique. Lors de la formation du premier contact avec les APC, les récepteurs des cellules T (TCR) sur la surface de la forme de cellules T microns grappes d'échelle qui servent de plates - formes de signalisation 2, 3, 4, et sont finalement centralisé pour former un cluster supramoléculaire centrale plus grande (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. Récemment, il a été montré que, du côté APC, les ligands de TCR sont également regroupés 8.

Dans le contexte de l' interaction des cellules T-APC, le déploiement de systèmes hybrides, où l'APC est imitée par une surface artificielle fonctionnalisés avec des protéines pertinentes, a considérablement fait progresser notre compréhension de l'interface synaptique 2, 3, 4, 5, 6, 7 . Dans ce contexte, il est très utile pour concevoir des surfaces APC mimétiques qui capturent un ou plusieurs aspects de la cellule cible. Par exemple, si les ligands sont greffés sur bicouches lipidiques pris en charge, ils peuvent diffuser dans le plan de la double couche, imiter la situation sur la surface APC et en même temps permettre la formation ducSMAC 6, 7. De même, les clusters sur l'APC ont été mimé par la création d' îlots de ligands dans une mer de polymères 9, 10, 11, 12, 13, 14. Cependant, ces deux caractéristiques ont jusqu'à présent pas été combinées.

Nous décrivons ici une nouvelle technique pour créer des nano-points de l'anti-CD3 (un anticorps qui cible le complexe TCR) entouré par une bicouche lipidique avec des lipides diffusants. La bicouche est déposé à l' aide de Langmuir-Blodgett / technique de Langmuir-Schaefer 7, 15, 16 et , si on le souhaite, peut être fonctionnalisé avec une protéine spécifique - par exemple, le ligand de l'intégrine de la cellule T (appelé ICAM - 1). De plus, les points de protéine anti-CD3 COUld être remplacé par un autre anticorps ou CAM. Alors que nous avons choisi les protéines pour une utilisation future en tant que plate-forme pour les études d'adhésion des cellules T, la stratégie ici détaillée peut être adaptée pour toute protéine et même l'ADN.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. diapositives Cover-verre Nettoyage et Chambres d'observation

  1. Disposer les lames de couvre-objet sur un plateau-diapositive multiple constituée d'un matériau inerte tel que polytétrafluoroéthylène (PTFE).
  2. Immerger le plateau avec les diapositives et la chambre d'observation dans une solution d'agent tensio-actif (un produit recommandé pour le nettoyage des cuvettes de quartz est approprié).
  3. En utilisant un bain à ultrasons, ultra-sonication dans la solution d'agent tensio-actif pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C).
  4. Rincer 5 fois avec de l'eau ultrapure (18,2 MΩ.cm, 0.059 uS / cm).
  5. Ultra-sonication dans une solution d'agent tensio-actif pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C).
  6. Rincer 10 fois avec de l'eau ultra pure.
  7. Répétez les étapes 1,5 et 1,6 fois.
  8. Magasin dans l'eau à température ambiante (entre 20 et 30 ° C) pendant jusqu'à une semaine.

2. Fabrication de protéines Nano-points

  1. Le dépôt de perles
    1. Deposit la suspension de billes de silice (2% v / v, 70 uL) goutte à goutte sur un couvercle coulissant (24 x 24 mm, épaisseur 170 um) maintenus à une inclinaison de 15 degrés.
    2. Laissez la suspension répandre pendant environ 1 min tout en feuilletant le verre de 90 ° tous les 15 s.
    3. Laisser le liquide à évaporer dans les conditions ambiantes.
    4. Conserver dans un verre propre ou une chambre de PTFE dans les conditions ambiantes pendant 2 jours.
  2. Dépôt d'aluminium
    1. Placer les lames (préparé dans la section 2.1) à l' intérieur d' une fréquence radio (RF) l' équipement de pulvérisation cathodique à magnétron 8, sur une table rotative à une distance d'environ 105 mm à partir d'aluminium (99%): silicium (1%) cible.
    2. Pomper la chambre de dépôt à 2,6 x 10 -4 Pa à l' aide d' une pompe turbo-moléculaire. Cette étape est importante pour l'élimination des impuretés gazeuses possibles.
    3. L'introduction d'air pur argon (5N, 99,999%) avec un flux de 10 sccm sous une pression de 0,8 Pa (6,6 mTorr).
      Remarque: le flux d'argon entrant est contrôlée par un contrôleur de débit massique et de la pression de processus est surveillé à l'aide d'un manomètre. Le flux de gaz d'argon est continue et est commandé par un équilibre entre l'entrée et l'ouverture des vannes de sortie.
    4. Allumez le générateur de puissance RF.
      REMARQUE: Ici, une gamme typique de 400-600 W puissance radiofréquence à la fréquence 13,56 MHz a été utilisé. Le générateur RF est utilisé avec un réseau d'adaptation à un mode de couplage plasma capacitif. La puissance réfléchie est contrôlée et réduite au minimum en utilisant l'adaptation de réseau.
    5. Après que le plasma est stabilisé par pulvérisation pendant 2 minutes en gardant l'obturateur fermé pour éliminer les impuretés à partir de la surface de la cible.
    6. Ouvrir l'obturateur et permettre à la pulvérisation cathodique se poursuivre pendant 60 min à déposer l'aluminium sur la lame de verre à une épaisseur de 200 nm.
    7. Couper le flux d'argon, fermer la vanne pour isoler la pompe turbomoléculaire à partir de la chambre de dépôt et de ventilation de la chambre avec n propreitrogen pour obtenir la pression ambiante. Récupérer les lames recouvertes d'aluminium. Stocker jusqu'à un mois dans un verre propre et hermétique ou une boîte PTFE dans des conditions ambiantes.
  3. dépôt en phase vapeur d'organosilane
    1. Immerger la lame revêtue d'aluminium préparé dans l'étape 2.2.6 dans l'eau ultra-pure à la température ambiante et ultra-sonication pendant 30 s dans un bain à ultrasons (50 W, 50/60 Hz, entre 20 et 30 ° C).
    2. Dépôt de 0,5 ml de (3-aminopropyl) -triéthoxysilane (APTES) au fond d'un dessiccateur.
      ATTENTION: APTES est un organosilane, qui s'évapore facilement et est toxique. APTES doivent être manipulés que sous une hotte à flux et avec des gants.
    3. Placer les lames de verre (préparé en 2.3.1) sur une grille en céramique et place à l'intérieur du dessiccateur.
    4. Connecter le dessiccateur à une pompe à membrane et de fonctionner à la puissance maximale pendant 30 min pour produire un vide faible.
    5. Fermez la vanne du dessicateur et éteindre la pompe.
    6. Chauffer le dessicateurà environ 50 ° C pendant 1 h.
    7. Ouvrez le dessicateur et recueillir les diapositives.
    8. Transfert à un autre dessicateur propre pour le stockage jusqu'à 48 h à la température ambiante (20 à 30 ° C).
  4. Le dépôt de la première couche de protéine - sérum-albumine bovine marquée à la biotine (BSA-biotine)
    1. Placez l'une des lames préparées à la section 2.3 sur un support en PTFE.
    2. Dépôt de 1 ml de 25 pg / ml de BSA-biotine dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laisser pendant 30 min à température ambiante (20 à 30 ° C).
    3. Rincer 10 fois avec du PBS. Stocker l'échantillon pendant 24 h à 4 ° C à une distance de la source lumineuse.
  5. Retrait du masque en aluminium
    1. Incuber les lames dans une solution de NaOH dans du PBS (préparé par addition goutte à goutte de NaOH 1 M à environ 100 mL de PBS pour obtenir pH≈12) à la température ambiante pendant une nuit (entre 20 et 30 ° C).
      MISE EN GARDE. NaOH est corrosif et doit être manipulée avec des gants.
    2. Rincer10 fois dans l'eau ultra pure.

3. Dépôt de prise en charge lipidique en deux couches (SLB)

  1. Nettoyage de la cuvette de Langmuir
    1. Retirer l'eau dans l'enceinte de PTFE de la cuve de Langmuir en utilisant une pompe.
    2. Nettoyer avec une serviette jetable non-tissé non pelucheux trempé dans du chloroforme.
      MISE EN GARDE. Le chloroforme est toxique et doit être manipulé dans une zone bien ventilée, avec un masque (ou un sous-hotte à flux) et avec des gants appropriés.
    3. Nettoyer 4 fois avec de l'eau ultrapure tiède (40 à 50 ° C).
    4. Nettoyer au moins 6 fois avec de l'eau froide ultrapure.
  2. Le dépôt de la première couche lipidique
    1. Placez les plateaux de PTFE dans l'enceinte de PTFE de la cuve de Langmuir puis le remplir avec de l'eau ultrapure.
    2. Utiliser le logiciel de commande de l'appareil de Langmuir pour régler la pression mesurée à 0 mN / m.
    3. Utiliser une seringue en verre étanche au gaz / métal à déposer 30 ul d'une solution de lipides de 1 mg / mL (1, 2-dioleoyl- sn - glycéro-3-phosphocholine (DOPC) dans du chloroforme) sur la surface de l'eau. Le chloroforme et évapore les molécules lipidiques se forment spontanément une monocouche.
    4. Utiliser le logiciel de commande pour comprimer la monocouche lipidique par la fermeture de la barrière de PTFE jusqu'à la pression désirée (27 mN / m pour DOPC) est atteinte.
    5. Utiliser le logiciel de commande pour tremper la lame de verre préparée dans la section 2.5.2 dans l'enceinte PTFE à l'aide d'une pince motorisée.
    6. Maintenir la glissière, dans la pince, perpendiculairement à l'interface air-eau. Utiliser le logiciel de commande pour le porter lentement (15 mm / min) à travers l'interface, tout en maintenant une pression constante à 27 mN / m.
    7. Placer dans un environnement sec soit pour une utilisation immédiate ou pour le stockage jusqu'à 24 h à température ambiante (entre 20 et 30 ° C).
  3. Le dépôt de la seconde couche lipidique
    1. Maintenir la pression de surface dans la cuve de Langmuir à la valeur désirée de 27 mN / m. Compresser en utilisant laun logiciel de commande de l'appareil de Langmuir et / ou ajouter une petite quantité de lipides pour obtenir la pression souhaitée.
    2. Placer les lames de verre portant la monocouche lipidique, préparé dans la section 3.2.6, horizontalement sur la surface de l'eau. Assurez-vous que chaque lame est flottant au-dessus d'un plateau de PTFE.
    3. Appuyez sur les lames de verre vers le bas, une lame à la fois, dans son bac de PTFE correspondant en utilisant des pinces en PTFE ou en métal de telle sorte qu'ils sont immergés dans l'eau. Évitez d'incliner les diapositives tout en poussant.
    4. Utiliser des pinces en PTFE ou en métal pour transférer les plateaux de PTFE contenant les lames dans un cristallisoir rempli d'eau ultrapure faire en sorte que les lames ne sont pas exposés à l'air.
    5. Utiliser des pinces en PTFE ou en métal pour transférer, tout en travaillant sous l'eau, une lame de verre revêtue de deux couches dans une chambre d'observation.
      REMARQUE: La chambre d'observation est placée sous l'eau à l'intérieur du cristalliseur. La chambre d'observation est fait sur mesure et se compose d'une bague de PTFE avec un joint en caoutchoucd boîtiers en acier, qui peuvent être assemblés sous l'eau pour faire une chambre étanche à l'eau dont la surface inférieure est réalisée à partir de la lame de verre préalablement revêtu avec la bicouche lipidique.
    6. Fermez la chambre tout en continuant à travailler sous l'eau et veiller à ce que environ 1 ml d'eau est piégé dans la chambre.
    7. Prendre la chambre assemblé hors de l'eau. Assurez-vous que ce soit et sans fuite étanche à l'eau.
    8. Remplacer les 1 ml d'eau présente ultrapure dans la chambre d'observation avec du PBS en ajoutant et en enlevant 500 ul de PBS 10 fois. Assurez-vous que la chambre est jamais dépourvue de liquide.
  4. étape de blocage SLB
    1. Introduire 100 ug / ml d'albumine de sérum bovin (BSA) dans la chambre d'observation contenant la lame préparée dans la section 3.3.6 et incuber pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C).
    2. Rincer la bicouche en supprimant et en ajoutant 500 ul de PBS 10 fois. La bicouche peut être conservé 24 h à 4 ° C.

4. fonctionnalisation avec Ligands

  1. Ajouter fluorescent ou non fluorescent neutravidine (NAV, une version de l'avidine déglycosylée pas chargée à un pH de 7) à 2 ug / mL dans la chambre contenant le coulisseau préparé dans la section 3.4.2 pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C).
  2. Rincer en ajoutant et en supprimant 500 ul de PBS 10 fois.
  3. Ajouter anti-CD3 biotinylé à 2 ug / mL à la chambre contenant le coulisseau préparé dans la section 3.4.2. Pour une double fonctionnalisation du SLB et les points, ajoutez Fc-ICAM1 marqueur His à 5 ug / ml (lipides ici, la double couche est faite de DOPC + 1% d'acide nitrilotriacétique (NTA)). Laisser reposer pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C).
  4. Rincer en ajoutant et en supprimant 500 ul de PBS 10 fois
  5. Remplacer le PBS avec du milieu cellulaire (PBS + BSA à 0,1%) en ajoutant et en enlevant 500 ul du milieu cellulaire 10 fois.
  6. Laisser 200 pi de milieu cellulaire dans la chamber avec le coulisseau.
  7. Placer la chambre pendant 10 min à 37 ° C avant d'ajouter les cellules.

5. Le dépôt de cellules (voir la référence 7 pour les détails)

  1. déposer délicatement 400 ul de la suspension de cellules dans la chambre. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° C.
  2. Fixer la cellule avec 2% de paraformaldehyde (PFA) pendant 15 min à 37 ° C. Remplacer le PFA avec du PBS par élimination répétée et addition de 500 ul de PBS.

6. Observation

  1. Proteo-lipidique motif de Nano et la fluidité SLB
    1. Utiliser un microscope à fluorescence à l' image du motif de protéine en mode épifluorescence en utilisant une longueur d' onde d'illumination appropriée (639 nm) et cubes de filtre (par exemple ici, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 +688).
      NOTE: L'intensité du signal peut être quantifiée pour estimer la quantité de protéine à l'intérieur et à l'extérieur du point. Utiliser une longueur d'onde d'illumination appropriée (330 nm) et fcube ilter à l'image de la double couche (BP 365/12, FT 395, 397 LP), qui apparaît lumineux avec des trous noirs.
    2. Utiliser une technique de blanchiment photographique continu (CPB) 13, 15 pour mesurer la constante de diffusion des lipides de traceur dans la bicouche. Cette observation est de préférence faite juste après le dépôt SLB.
      Remarque: Afin de quantifier la constante de diffusion, deux paramètres sont mesurés pendant le processus de CPB: le temps de blanchiment spécifique du colorant (tendue) et la longueur de décroissance du profil de fluorescence du halo formé autour de la zone blanchie (Taud). La première est obtenue en traçant l'évolution temporelle de l'intensité de fluorescence au centre du champ lumineux au cours du processus CPB. La seconde est obtenue en traçant le profil d'intensité au niveau du bord de la zone éclairée (moyenne sur 12 lignes et 5 images après l'état d'équilibre est atteint). Les courbes sont montées pour obtenir et Taut taud. La constante de diffusion est donnée par tauD 2 / tendu (D = figure-protocol-1 ).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Les images de fluorescence ont été analysés pour mesurer l'espacement et la taille des points. Espacement typique a été trouvé que 1 900 ± 80 nm et typiquement la taille des points est de 600 ± 100 nm (figure 1g). L'espacement est défini par la taille des billes utilisées pour le masque. Le point de taille est fixé par le bourrelet de taille, ainsi que des conditions de dépôt. Le SLB est déposé uniquement autour des points de protéines et pas sur eux (fig...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les étapes critiques dans le protocole décrit ci-dessus sont liées à la formation des points de nano-protéines ou de l'arrière-remplissage de l'espace autour des points par une bicouche lipidique supportée. La première étape critique par rapport à des points de nano-protéine est la préparation du bourrelet masque. Le nettoyage du couvercle de glissière est critique. Les lames doivent être soit nettoyée avec une solution de détergent qui est recommandé pour le nettoyage des cuvettes en quartz, ou avec un plasma d...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous remercions Laurent Limozin, Pierre Dillard et Astrid Wahl pour poursuivre des discussions fructueuses sur les applications cellulaires. Nous remercions également Frederic Bedu de l'installation PLANETE de salle blanche pour son aide avec les observations SEM. Ce travail a été financé en partie par le Conseil européen de la recherche par subvention n ° 307104 FP / 2007-2013 / ERC.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lamelles en verreAssistent, Karl Hecht KG  ;
Chambre d’observationde
(Hellmanex)Hella Analytics9-307-011-4-507
Ultra-sonicateurThermoFisher
DessiccateurLabbox
Cristalliseur  ;Shott
NeutravidineThermo Fischer Scientifique84607
PBS  ;Sigma-aldrichP3813
Eau MQ  ;ELGA, Veolia France
Perles de siliceCorpuscular Inc147114-10
APTESSigma-aldrichA3648
BSA-BiotineSigma-aldrichA8549
DOPCAvanti Polar Lipids850375C
Dansyl-PEAvanti Polar Lipids810330C
ChloroformeSeringueau gaz 650471
  ;Dominique Dustcher , France74453
Balance de filmNIMAMedium
MicroscopeZeiss, AllemagneSystème
Cible en aluminium  ;Kurt J. Lesker Compagny, États-Unis
Système de pulvérisation cathodique magnétron radiofréquence ; me  ;Outil SMC 600 modifié par ALCATEL, France
Concentré tensioactif alcalin fait maison étanche Sigma-aldrichTIRF-III

Références

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
  2. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  3. Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
  4. Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
  7. Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
  8. Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
  9. Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
  10. Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
  11. Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
  12. Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
  13. Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
  14. Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
  15. Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
  16. Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
  17. Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
  18. Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
  19. Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
  20. Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
  21. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  22. Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
  23. Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
  24. Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
  25. Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398(2012).
  26. Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Explorer plus d’articles

Nano-agrégats de protéinesréseaux de ligandstechnique du masque à billesdépôt d'aluminiumfonctionnalisation à l'APTESrevêtement de BSA-biotinemicroscopie TIRFmicroscopie RICMfluidité de la bicouche lipidique
Nano-Ligand Arrays cluster dans un pris en charge Lipid bicouches
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.