Article de méthode

Analyse Effets bénéfiques des suppléments nutritionnels sur les fonctions épithéliales intestinales barrière Pendant Experimental Colite

DOI :

10.3791/55095

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5 janvier 2017

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1Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 2Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 3Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

Dans cet article

Résumé

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Les traitements actuels des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) visent à soulager les symptômes de la maladie, mais peuvent entraîner des effets secondaires graves. Ainsi, les stratégies alternatives sont à l'étude dans les modèles de colite animales. Ici, nous expliquons comment les effets bénéfiques de compléments alimentaires sur les signes cliniques MII sont analysés dans un tel modèle de colite.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI), y compris la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des troubles chroniques récidivantes de l'intestin. Ils causent des problèmes graves, tels que des crampes abdominales, une diarrhée sanglante, et la perte de poids, chez les personnes touchées. Malheureusement, il n'y a pas encore de traitement, et les traitements ne visent à soulager les symptômes. Les traitements actuels comprennent des médicaments anti-inflammatoires et immunosuppresseurs qui peuvent provoquer des effets secondaires graves. Ceci justifie la recherche d'autres options de traitement, tels que les suppléments nutritionnels, qui ne causent pas d'effets secondaires. Avant leur application dans des études cliniques, de tels composés doivent être rigoureusement testés pour l'efficacité et la sécurité dans les modèles animaux. Un modèle expérimental fiable est le sulfate de dextrane sodique (DSS), le modèle de colite chez des souris, qui reproduit un grand nombre de signes cliniques de la rectocolite hémorragique chez l'homme. Nous avons récemment appliqué ce modèle pour tester les effets bénéfiques d'un supplément nutritionnel contenantles vitamines C et E, L-arginine, et les acides gras poly-insaturés © 3 (PUFA). Nous avons analysé les différents paramètres de la maladie et a constaté que ce supplément a été en mesure d'améliorer la formation de l'œdème, des lésions tissulaires, l'infiltration leucocytaire, le stress oxydatif, et la production de cytokines pro-inflammatoires, conduisant à une amélioration globale de l'indice d'activité de la maladie. Dans cet article, nous expliquons en détail l'application correcte des suppléments nutritionnels en utilisant le modèle de la colite DSS C57BL / 6 souris, ainsi que la façon dont les paramètres de la maladie tels que l'histologie, le stress oxydatif et l'inflammation sont évalués. L'analyse des effets bénéfiques de différents compléments alimentaires peut alors éventuellement ouvrir de nouvelles voies pour le développement de stratégies alternatives de traitement qui atténuent les symptômes de MII et / ou qui prolongent les phases de rémission sans provoquer d'effets secondaires graves.

Introduction

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Colite est une maladie inflammatoire du côlon qui peut causer de la diarrhée et des douleurs abdominales. Rectocolite peut être aiguë, en réponse à une infection ou à un stress, ou il peut se développer une maladie chronique, telle que la colite ulcéreuse (CU), qui appartient au groupe des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Bien que les signes cliniques de l' UC ont été bien décrits, la pathogenèse est encore mal comprise 1. Il est admis parmi les experts que les communications unifiées est une maladie multifactorielle, avec des mutations génétiques et des réponses immunitaires aberrantes qui jouent un rôle majeur 2. Cependant, les facteurs environnementaux, tels que le style de vie et la nutrition, contribuent également au développement de la maladie et la progression 3.

Malheureusement, l'IBD est pas curable, mais il y a beaucoup d'options de traitement qui visent à atténuer les symptômes cliniques. Les traitements actuels comprennent des médicaments anti-inflammatoires, tels que la sulfasalazine et les corticostéroïdes; les immunosuppresseurs, tels que azathioprine; des anticorps monoclonaux qui capturent les cytokines pro-inflammatoires telles que le facteur onconécrosant-α (TNF-α) ou des molécules d'adhésion de blocs, telles que les intégrines, afin de réduire le recrutement leucocytaire excessif; et les inhibiteurs ciblant les kinases qui déclenchent des voies pro-inflammatoires, telles que la kinase Janus (JAK) 4. Pas tous les patients répondent à tous les traitements, de sorte que les stratégies thérapeutiques doivent être individualisées 5. En outre, la plupart de ces médicaments thérapeutiques interférer avec le métabolisme et les réponses immunitaires, ce qui provoque souvent des effets secondaires graves. Pour cette raison, les options de traitement alternatives ont été étudiées.

Les traitements alternatifs comprennent les probiotiques et les suppléments nutritionnels, qui ont été appliquées dans des modèles animaux et des essais cliniques avec des niveaux variables de succès 6,7. Nous avons récemment découvert que l'application de différents suppléments nutritionnels uniques, tels que les vitamines antioxydantes ou les acides gras ω3-poly-insaturés (PENM), est inférieure à l'application d'une combinaison de tels suppléments pour soulager les symptômes de colite et de maladies cardiovasculaires 8,9. Ces études ont été réalisées chez la souris, de sorte que les études cliniques doivent être effectuées chez les humains afin de déterminer si ces résultats seront également applicables à l'homme. Avant les études cliniques sont lancées, l'efficacité et la sécurité des nouvelles options de traitement doivent être évalués dans des modèles animaux.

Pour les MII, le (DSS) modèle du sulfate de dextran de sodium a été largement utilisé pour étudier les mécanismes de développement de la maladie et les effets bénéfiques des médicaments et des suppléments nutritionnels 6,10. Dans la plupart des études, seule une maladie aiguë au cours d'une période de sept jours est induite; néanmoins, les signes cliniques observés chez ces animaux ressemblent étroitement à celles observées chez les patients MICI (c. -à- diarrhée sanglante, la perte de poids, dysfonction épithéliale, et l' infiltration des cellules immunitaires) 10. DSS induit des érosions dans la muqueuse,entraînant un dysfonctionnement de la barrière et une augmentation de la perméabilité épithéliale intestinale 11. Le mécanisme exact reste inconnu. Cependant, une étude suggère que le MAS interagit avec des acides à chaîne moyenne longueur gras pour former des nano-lipocomplexes qui sont capables de pénétrer dans les cellules épithéliales et pour induire la signalisation inflammatoire pathways 12. Dans cet article, nous décrivons en détail comment colite est induite et analysé chez la souris, comment les suppléments nutritionnels sont appliqués par gavage pour assurer un dosage constant dans chaque animal, et comment les effets de ces suppléments sur divers symptômes de colite sont examinés.

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Protocole

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Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle du Cinvestav.

1. Préparation du DSS eau potable et de l'induction de la colite

  1. Préparer un 3,5% p / v de sulfate de dextrane sodique (DSS) dans de l'eau potable autoclavée. DSS se dissout facilement et il n'a pas été nécessaire de filtrer la solution finale.
    NOTE: 7 jours de traitement DSS induit une colite sévère. Si l'induction de colite légère, 3 - 4 jours de traitement sont recommandés. Tant que l'eau potable DSS reste clair, il ne faut pas changer l'eau. Toutefois, si elle se trouble, il doit être remplacé.
  2. Noter le poids de base des souris mâles. Veiller à ce qu'ils sont 8 - 12 semaines d'âge et dans une fourchette de 21 - 25 g de poids corporel.
    NOTE: La concentration de DSS appropriée doit être optimisée dans chaque laboratoire. Les résultats peuvent varier considérablement, en fonction des conditions de logement. Concentrations entre 2,5 à 5% sont habituellement rapportées pour induire une forte colitis C57BL / 6J WT souris 10. DSS de différentes entreprises et différents lots doit être testé, car les résultats peuvent également varier selon les sources de DSS.
  3. Fournir de l' eau ad libitum et le remplacer par 3,5% d' eau douce DSS si nécessaire.

2. Application des suppléments nutritionnels par Gavage

  1. Préparer une solution "peut être alimentée» des suppléments nutritionnels souhaités dans un solvant approprié. Pour cette étude, nous avons utilisé un mélange contenant 200 mg / kg de L-arginine, 83 mg / kg de vitamine C, 46 mg / kg de vitamine E, 77 mg / kg acide eicosapentaénoïque (EPA) et 115 mg kg acide docosahexaénoïque / (DHA ) dans une solution 1: 1 d'eau et de l'huile de carthame.
  2. Remplir une seringue de 1 ml reliée à une aiguille de gavage (15 G x 50 mm) avec le mélange de compléments nutritionnels. Essuyez l'extérieur de l'aiguille de gavage pour éliminer tout composé à l'extérieur de l'aiguille et d'assurer l'application de la dose appropriée.
  3. Retiens la souris en saisissant la base de la queue avecd'une part et en saisissant fermement un pli de la peau à l'arrière du cou avec le pouce et l'index de l'autre main. Placez la queue entre le troisième doigt et la base du pouce de la même main qui tient le cou.
  4. Tout en maintenant la souris dans une position verticale, insérer l'aiguille dans le côté gauche de la bouche de l'animal et suivre attentivement le toit de la bouche pour localiser l'œsophage. Si aucune résistance est rencontrée, faire avancer l'aiguille vers l'estomac.
    REMARQUE: Vérifiez que l'animal respire correctement avant de poursuivre.
  5. Administrer lentement le mélange, retirer le tube en tirant doucement sur la seringue, et relâchez la souris. Appliquer les suppléments nutritionnels une fois par jour par gavage pendant la durée de l'expérience de la colite.

3. Détermination du Disease Activity Index

NOTE: L'indice d'activité de la maladie est la combinaison des scores pour la perte de poids, saignements périanale, et la consistance des selles, qui sont obCONTENUES quotidien 13.

  1. Mesurer le poids corporel par jour, et attribue un score de 0 à 4 en fonction du pourcentage de perte de poids (0: 0%, 1: 1 - 5%, 2: 5 - 10% 3: 10 - 20% et 4:> 20 %).
    NOTE: Bodyweight perte est déterminée en calculant la différence en pour cent entre le poids de base avant l'induction de DSS-colite et le poids réel.
  2. Pour déterminer le niveau de saignement périanale, prélever un échantillon de selles fraîches et utiliser les applicateurs fournis pour appliquer un frottis mince sur une diapositive à partir d'un kit de test gaïac de sang occulte dans les selles. Utilisez un nouvel applicateur pour chaque échantillon.
    1. Fermez le couvercle sur l'avant et ouvrir la fenêtre sur le dos de la lame. Appliquer deux gouttes de la solution de révélateur à l'arrière à l'emplacement de l'échantillon.
    2. Lire les résultats après 30 s. Toute trace de couleur bleue est positive pour le sang occulte. Attribuer un score de 0 à 4 (0: aucune, de 0,5 à 2,5: gaïac positif fécale de sang occulte (en fonction de la puissance du signal), et 3 - 4: gross saignement).
      NOTE: Si le sang dans les selles est visible, le test de sang occulte dans les selles gaïac n'a pas à être effectué, et un score de 3, 3,5, ou 4 est attribué, en fonction de la quantité de sang visible.
  3. Déterminer la consistance des selles en observant un échantillon de selles fraîches. Attribuer un score de 0 à 4 (0: solide, 0,5 normale / - 2,5: tabouret pâteuse, et 3 - 4: diarrhée).

4. Déterminer Intestinal épithéliale Perméabilité in vivo par Evans Bleu Assay

  1. Anesthésier les animaux en leur injectant par voie intraperitoneale avec un mélange de kétamine (100 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (13 mg / kg de poids corporel) dilué dans une solution saline (NaCl 0,9%), et évaluer la profondeur de l'anesthésie en surveillant la pincée réflexe de retrait.
  2. Placez les animaux anesthésiés dans une position couchée et effectuer une laparotomie pour exposer les intestins.
  3. Localisez le caecum et faire une petite incision dans le segment proximal du côlon unescendens (idéalement, immédiatement adjacentes au caecum).
  4. Insérez une aiguille d'alimentation (G22) et le fixer avec une ligature en utilisant un fil de soie commune. Soigneusement flush abondante PBS à travers le tube pour rincer toutes les matières fécales du côlon. Instiller une solution de bleu Evans (1,5% p / v dans du PBS) dans le côlon jusqu'à ce qu'il atteigne l'anus.
  5. Incuber le bleu Evans pendant 15 min. Laver le colorant en rinçant le tube avec abondance PBS jusqu'à ce que le lavage périanale est clair.
  6. Euthanasier les animaux par dislocation cervicale.
  7. Exciser le côlon et le rincer à nouveau avec abondante PBS. Rincer une nouvelle fois avec 1 ml de 6 mM de N -acetylcysteine dans du PBS pour éliminer tout colorant coller à la muqueuse du côlon.
  8. Couper le côlon longitudinalement et rincer une fois avec du PBS et 1 ml de 6 mM N -acetylcysteine.
  9. Noter le poids et la longueur. Pour extraire le colorant bleu Evans, placez le côlon dans 2 ml de N, N - diméthylformamide pendant une nuit à température ambiante avec Agitatio doucen. Mesurer la concentration de colorant par spectrophotométrie à 610 nm.

5. Collecte de tissu

  1. Anesthésier les animaux en leur injectant par voie intraperitoneale avec un mélange de kétamine (100 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (13 mg / kg de poids corporel) dilué dans une solution saline (NaCl 0,9%), et évaluer la profondeur de l'anesthésie en surveillant la pincée réflexe de retrait.
  2. Euthanasier les animaux par dislocation cervicale.
  3. Placez les animaux dans une position couchée et effectuer une laparotomie pour exposer la cavité abdominale.
  4. Avec des ciseaux, disséquer la totalité du côlon et enregistrer sa longueur.
  5. Rincer le côlon soigneusement plusieurs fois avec réfrigéré PBS pour éliminer les matières fécales. Noter le poids des tissus et se préparer pour les expériences suivantes, comme décrit dans les étapes 5.6 - 5.8.
  6. Pour l'isolement de l'ARN et la myéloperoxydase (MPO) essais, couper un échantillon de tissu de taille appropriée (100 mg est généralement suffisant), placez-le dans un tube, et snap-congeler dans de l'azote liquide. Conserver les tissus à -80 ° C pour une utilisation future.
  7. Pour immunofluorescence et la détermination de stress oxydatif (voir ci-dessous), couper un petit colon échantillon (0,5 à 1 cm) et plonger dans de petites tasses en aluminium remplies de température de coupe optimale (OCT) composé. Placez les tasses sur glace sèche et les laisser geler lentement, afin d'éviter la formation de bulles. Des échantillons de tissus congelés peuvent être conservés à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
  8. Pour roule suisse 14, ouvrir le côlon longitudinalement et retirez soigneusement les matières fécales en utilisant une pince. Rouler vers le haut, avec la muqueuse tournée vers l'intérieur, en utilisant une pince à pointe fine ou un mince bâton en bois rond. Placez délicatement à l'intérieur d'une cassette intégration et passez à l'étape 6.1.
    NOTE: DSS induit des dommages au niveau du côlon. Toutefois, la répartition des dommages varie de l'extrémité proximale à la partie distale du côlon, avec la plupart des dommages habituellement observés dans le côlon distal et du rectum. Ainsi, nous vous recommandons de l'analyse de l'histologie soit dans le col distalou dans des rôles suisses de l'ensemble du côlon.

6. Analyse de Colon histologie par hématoxyline-éosine

  1. Préparation tissulaire
    1. Pour l'analyse histologique, soit plonger les rouleaux suisses ou les petits morceaux de tissus provenant de certaines régions du côlon de contrôle et des souris traitées dans 5 ml de 10% de formaldéhyde pendant 48 h à la température ambiante (RT) pour obtenir une fixation correcte.
      Remarque: Toutes les autres étapes de l'étape 6 sont effectuées à la température ambiante, sauf indication contraire.
    2. Lavez-les avec de l'eau du robinet pendant 18 h.
    3. les déshydrater avec 15 ml d'éthanol à 70% pendant 1 h, 96% pendant 1 h, et de l'éthanol absolu pendant 1 h. Répétez chaque étape avec de l'alcool frais avant de procéder à la concentration suivante.
    4. Poursuivre la déshydratation dans un mélange de 7,5 ml d'éthanol absolu et 7,5 ml de xylène absolu pendant 1 h. Répéter une fois avant de passer les échantillons à 15 ml de xylène absolu pendant 1 h. Répétez cette étape une fois avec du xylène frais.
  2. Incorporation des échantillons de tissus du côlon en Paraffine
    1. Immerger les échantillons dans 50 ml d'huile de paraffine pendant 17 h. Répétez cette étape une fois, mais pour seulement 3 h.
    2. Immerger les échantillons en cubes (plastique, moule carré, taille: 22 x 22 x 22 mm) dans 810 ml de paraffine liquide.
    3. Permettre à la paraffine des échantillons de tissus du côlon à se solidifier pendant 24 h à température ambiante.
  3. Tissue Cross-sections à l' aide d' un Microtome de coupe
    1. Découper des échantillons de côlon à l'aide d'un microtome, selon les instructions du fabricant, à une épaisseur de 5 um.
    2. Collecter les coupes dans un bain d'eau (1 L) contenant 0,3% de gélatine. Ceci empêche le pliage du tissu des sections transversales. Récupérer les coupes de tissus et de les monter sur des lames de verre.
  4. Hématoxyline et éosine des tissus sections transversales
    1. Déparaffiner les échantillons pendant 18 h à 60 ° C dans un incubateur. A cet effet, utiliser un verre sPorte-lide avec une poignée.
    2. Après déparaffinage, plongez les lames dans 70 ml de xylène absolu pendant 5 min. Répétez cette étape une fois avec du xylène frais.
    3. Transférer les échantillons dans 70 ml d'alcool absolu pendant 1 min. Répétez cette étape une fois avec de l'alcool frais.
    4. Incuber les échantillons de tissu du côlon dans 70 ml d'éthanol à 96% pendant 1 min. Répétez cette étape une fois avec de l'alcool frais.
    5. Laver les échantillons dans l'eau du robinet deux fois pour 2 s.
    6. Incuber les tissus Harris hématoxyline pendant 7 min.
    7. Laver les échantillons dans l'eau du robinet deux fois pour 2 s.
    8. Incuber les échantillons dans de l'alcool acide (70 ml d'éthanol à 70% et 700 pi de 1 M d'acide chlorhydrique) pendant 7 s.
    9. Laver les échantillons dans l'eau du robinet deux fois pour 2 s.
    10. Incuber les échantillons de tissu dans 70 ml de carbonate de lithium (1 g de carbonate de lithium dans 100 ml d'eau distillée) pendant 7 s.
    11. Laver les échantillons dans l'eau du robinet deux fois pour 2 s.
    12. Incuber les échantillons dans 70 ml d'éthanol 80% Pendant 1 min.
    13. Transférer les échantillons dans 70 ml d'éosine-Y pendant 15 s.
    14. Incuber dans 70 ml d'éthanol à 96% pendant 1 min. Répétez cette étape une fois avec de l'alcool frais.
    15. Incuber les échantillons de tissu dans 70 ml d'éthanol absolu (alcool éthylique anhydre absolu) pendant 1 min. Répétez cette étape une fois avec de l'alcool frais.
    16. Incuber les échantillons dans 70 ml d'un mélange de 35 ml d'alcool absolu et 35 ml de xylène absolu pendant 1 min.
    17. Transférer les échantillons dans 70 ml de xylène absolu pendant 1 min. Répétez cette étape pour 5 min dans 70 ml de xylène absolu frais.
    18. Ajouter 80 pi de résine synthétique pour les échantillons de tissus du côlon, les couvrir avec des lamelles, et les laisser sécher pendant 24 heures à la température ambiante. Enfin, l' analyse des échantillons en utilisant la microscopie à champ lumineux 8.

7. Analyse Junction Composition par immunofluorescence

  1. Préparer le tissu comme décrit dans l'étape 5.7 et couper 8 sections um d'épaisseurà l'aide d'un cryostat.
  2. Fixer et perméabiliser côlon sections transversales avec 96% d'éthanol à -20 ° C pendant 20 min.
    NOTE: Toutes les incubations ultérieures doivent être effectuées à la température ambiante, sauf indication contraire, dans une boîte sombre et humide pour éviter le dessèchement et fluorochrome fading.
  3. échantillons d'air sec, puis rincez-les 3 fois pendant 5 min chacun avec PBS 1x
  4. Incuber les échantillons avec une solution de blocage (PBS contenant 0,01% de Tween et 2% de BSA) pendant 2 h.
  5. Retirer la solution de blocage et le rincer avec du PBS-Tween 0,01% pendant 10 minutes.
  6. Pendant ce temps, diluer les anticorps primaires aux concentrations souhaitées dans du PBS-Tween 0,01%.
  7. Retirer la solution de lavage, appliquer la solution d'anticorps à partir de l'étape précédente, et incuber pendant une nuit à 4 ° C dans une boîte humidifiée.
  8. Retirer la solution d'anticorps et laver 3 fois avec du PBS-Tween 0,01% pendant 5 minutes chacun et une fois avec de l'eau déminéralisée pendant 10 minutes, avec une agitation très douce.
  9. Alors que le lavage, centrifugeuse Fluorochromeconjugated, espèce-spécifiques Anticorps secondaires à 14.000 xg pendant 20 min à 4 ° C.
  10. Diluer les anticorps secondaires sans précipités comme indiqué par le fournisseur dans du PBS-Tween 0,01%, les appliquer et laisser incuber pendant 1 h à température ambiante.
  11. Répétez l'étape 7.8 et enlever la solution de lavage aussi complètement que possible.
  12. Pipette 4 ul d'agent anti-fading sur chaque échantillon sur la diapositive.
  13. Couvrir les échantillons avec une lamelle.
  14. Sécher à l'air pendant 1 h.
  15. glissière de Seal avec le vernis à ongles. Les lames peuvent être stockées à -20 ° C jusqu'à analyse ultérieure.
  16. Analyser sur un microscope confocal à balayage laser 8.

8. Détermination du stress oxydatif par Oxydation de éthidium

  1. Après 7 jours de DSS colite, préparer le tissu comme décrit dans l'étape 5.7 et couper des sections du côlon dans un cryostat à une épaisseur de 5 um. Monter les sections sur des lames de verre traitées avec une solution lysine poly-L-et incuber les échantillons d'esprith 5 uM de dihydroethidium (DHE) dans l'eau à 37 ° C pendant 30 min dans l'obscurité.
  2. Laver les échantillons avec du PBS (pH 7,6) trois fois pendant 15 minutes chacune avec une agitation douce à température ambiante. Air sécher les échantillons et ajouter une goutte de milieu de montage pour protéger la fluorescence. Observer la fluorescence de éthidium oxydé sur un microscope confocal laser à balayage (grossissement 40X, 568 nm de longueur d'onde).

9. Analyse des leucocytaire Recrutement par MPO Assay

  1. Après 7 jours de DSS colite, de recueillir le tissu du côlon et homogénéiser les échantillons (200-400 mg) avec 1 mL d'hexadécyltriméthylammonium (HTAB) du tampon (0,5% HTAB dans 50 mM de tampon phosphate, pH 6,0) en utilisant un homogénéiseur sur de la glace.
  2. Rincer la pointe de l'homogénéisateur à deux reprises avec 1 ml de tampon HTAB à inclure tous les tissus dans le lysat et sonication cinq fois à 40% d'amplitude pendant 10 secondes chacun. Gel-dégel dans l'azote liquide à trois reprises.
  3. Centrifuger à 14000 xg pendant 15 minutes et recueillir le surnageant.Préparer le 2,2'-azino-bis (6-3-éthylbenzothiazoline-sulfonique) (ABTS) en mélangeant une solution ABTS, 5 ml de citrate de sodium (1 M dans l'eau), 0,1 ml de peroxyde d'hydrogène, et 45 ml de bi -eau distillée.
  4. Mélanger 0,1 ml de chaque surnageant avec ml de ABTS solution à 0,1 dans une plaque à 96 puits à fond plat. Au bout de 10 min, mesurer l'absorbance à 460 nm en utilisant un spectrophotomètre.

10. L'évaluation de l'expression de cytokines pro-inflammatoires par PCR

  1. L' homogénéisation tissulaire
    1. Homogénéiser 50 à 100 mg d'échantillons de tissus du côlon dans 1 ml d'un mélange de thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme acide à l'aide d'un homogénéiseur de puissance.
    2. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
  2. séparation de phase
    1. Ajouter 0,2 mL de chloroforme et agiter vigoureusement pendant 30 s.
    2. Incuber à 4 ° C pendant 30 min.
    3. Centrifugeuse à 12.000 xg pendant 60 min à 4 ° C.
    4. Transférer le uphase aqueuse pper dans un nouveau tube (~ 500 pi).
  3. ARN Précipitation et resuspension
    1. Ajouter 0,5 ml d'alcool isopropylique et on incube les échantillons à 4 ° C pendant 60 min.
    2. Centrifugeuse à 12.000 xg pendant 30 min à 4 ° C.
    3. Retirer le surnageant complètement.
    4. Ajouter 1 ml d'éthanol à 75% et le vortex.
    5. Centrifugeuse à 12.000 xg pendant 30 min à 4 ° C.
    6. Retirer le surnageant.
    7. Laisser l'éthanol restant sécher à l'air pendant 3-5 min.
      NOTE: Il est important de ne pas laisser le culot d'ARN sécher complètement, car cela va grandement diminuer sa solubilité.
    8. Re-dissoudre le culot dans 0,3 ml de pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) de l'eau -Traité. transcrire immédiatement les échantillons d'ARN en ADNc (plus stables, voir étape 10.5) ou conserver à -80 ° C.
  4. ARN Quantification
    1. Diluer 1 ul d'ARN avec 99 pi d'eau traitée au DEPC.
    2. Lire le DO à 260 nm et 280 nm en utilisant un spectrophotomètre UV / VIS pour déterminer la concentration de l'échantillon et la pureté.
  5. Synthèse d' ADNc
    1. Mélanger les échantillons d' ARN (1-5 pg) avec 1 pi d'oligo (dT) 12-18 (0,5 ug / ul) et de l' eau traitée au DEPC (volume total de 12 ul) dans des tubes stériles sans RNase.
    2. Incuber à 70 ° C pendant 10 min.
    3. Ajouter 2 ul de tampon de PCR 10x, 1 pi de 50 mM de MgCl2, 1 ul de mélange dNTP 10 mM et 2 ul de 0,1 M de dithiothréitol (DTT).
    4. Incuber à 4 ° C pendant 5 min.
    5. Ajouter 1 pi de transcriptase inverse et on incube à 42 ° C pendant 5 min.
    6. Incuber à 70 ° C pendant 15 min.
    7. Incuber à 4 ° C pendant 15 min. ADNc peut être stocké à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
  6. PCR
    1. Mélanger 2,5 pi de tampon de PCR 10x, 1,5 pi de MgCl2 25 mM, 0,5 ul de dNTP 10 mM , mélange, 0,25 μL d'ADN polymerase Taq, 0,25 ul de chaque amorce (10 pM) et de l'ADNc (100 ng) et de l'eau stérile pour obtenir un volume total de 25 ul.
    2. Exécutez les échantillons sur un cycleur thermique à 96 puits. Pour éviter l'amplification de l'ADN génomique, amorces directe et inverse devraient être situés dans différents exons: IL1β-FW: GCAACTGTTCCTGAACTCAACT et IL1β-RE: TCTTTTGGGGTCCGTCAACT; IL6-FW: CCTTCCTACCCCAATTTCCAA et IL6-RE: AGATGAATTGGATGGTCTTGGTC; KC-FW: TGTCAGTGCCTGCAGACCAT et KC-RE: CCTGAGGGCAACACCTTCA; et Actine-FW: TATCCACCTTCCAGCAGATGT et Actine-RE: AGCTCAGTAACAGTCCGCCTA. En utilisant les conditions de PCR suivantes: 95 ° C pendant 5 minutes suivie de 30 cycles à 95 ° C pendant 15 s, 58 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 secondes, ainsi que d'une extension finale pendant 10 min à 72 ° C .

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Résultats

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Diet suppléments peuvent protéger du DSS Colite

des suppléments diététiques anti-inflammatoires et anti-oxydants tels que la vitamine C, la vitamine E, l'oxyde nitrique (NO) -source L-arginine, et les acides gras co3 poly-insaturés (co3-PUFA), ont été utilisés avec un succès variable dans l'animal modèles pour atténuer les signes de maladies inflammatoires 3,6,15. La malnutrition, le stress oxydatif, et la prod...

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Discussion

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Afin d'utiliser des suppléments nutritionnels dans les études cliniques, les avantages et la sécurité de ces suppléments doivent être soigneusement évalués in vivo dans des études animales. Dans le cas de colite, plusieurs modèles animaux appropriés qui ressemblent aux signes cliniques de MII ont été établis, y compris les modèles chimiques à l'aide de DSS, TNBS, ou l'acide acétique; knock-out (KO) des modèles tels que IL10-KO; et la colite immunitaire à médiation cellulaire en utilisant le transfer...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil mexicain pour la science et la technologie (Conacyt, 207268 et 233395 à Michael Schnoor). KFCO est récipiendaire d'une bourse Conacyt (396,260) pour obtenir un diplôme MSc.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,3 % de gélatine  ;Bioxon158
10 % formaldéhydeJ.T. Baker2106-03
Plaque à 96 puits à fond platCorning3368
Éthanol absolu  ;J.T. Baker9000-03
Xylène absoluJ.T. Baker9490-03
ABTSSigma AldrichH5882
Albumine sérique bovineSigma-Aldrich9048-46-8
ColoScreenHelena Laboratories5072
Corabion (Aimablement fourni par Merck, Naucalpan, Mexique)Merck
Sulfate de dextran Sel de sodiumAffymetrix9011-18-1(M.W. 40,000-50,000)
DihydroethidiumLife TechnologyD11347
Eosin-Y  ;J.T. BakerL087-03
Evans bleuSigma-Aldrich314-13-6
Aiguille d’alimentationCadence Science Inc.9921
Porte-lames en verre avec poignéeMicroscopie électronique70312-16
Lames en verreCorning2947
Harris hématoxyline  ;Sigma-AldrichH3136
Hexadecyltrimethyammonium (HTAB)Sigma AldrichH6269
Histosette (Cassette d’enrobage)SimportM498.2
Acide chlorhydrique 1 MJ.T. Baker9535-62
Peroxyde d’hydrogèneSigma AldrichH3410
KétaminePiSA AgropecuariaQ-7833-028
Paraffine liquide  ;Paraplast39501-006
Carbonate de lithium  ;Sigma-Aldrich2362
N,N-diméthylformamideJ.T. Baker68-12-2
N-acétylcystéineSigma-AldrichA9165
Cubes en plastiqueMicroscopie électronique70181
Solution de poly-L-lysineSigma-Aldrich25988-63-0
Prism 5 statistical logicielGraphPad SoftwarePrism 5
Solution saline 0,9 % NaClCS PiSAQ-7833-009
Citrate de sodiumSigma-AldrichW302600
Résine synthétique  ;Poly Mont7987
Taq ADN polyméraseInvitrogen11615-010
Tissue-tek. O.C.T COMPOUNDSakura Finetek4583
Seringue tuberculineBD Plastipak305945
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5
VECTASHIELD Antifade Medium de montage avec DAPIVector LaboratoriesH-1200
XylazinePiSA AgropecuariaQ-7833-099

Références

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