Un système microfluidique avec Patterning de surface pour les enquêtes cavitation Bubble (s) Interaction -Cell et les effets biologiques résultantes au niveau d'une seule cellule

Summary

Une puce microfluidique a été fabriquée pour produire des paires de points d’or pour la génération de bulles en tandem et des îlots enrobés de fibronectine pour la structuration de cellules uniques à proximité. Le champ d’écoulement résultant a été caractérisé par vélocimétrie par image de particules et a été utilisé pour étudier divers effets biologiques, notamment la poration de la membrane cellulaire, la déformation de la membrane et la réponse intracellulaire du calcium.

Abstract

Dans ce manuscrit, nous décrivons d'abord le protocole de fabrication d'une puce microfluidique, avec des points d'or et des régions revêtues de fibronectine sur le même substrat de verre, qui contrôle précisément la génération de bulles en tandem et des cellules individuelles à motifs à proximité avec des emplacements bien définis et des formes. On démontre ensuite la génération de bulles en tandem en utilisant deux lasers puisés illuminant une paire de points d'or avec un temps de retard peu microsecondes. Nous visualisons l'interaction bulle-bulle et la formation de jet par imagerie à haute vitesse et de caractériser le champ d'écoulement résultante à l'aide d'images de particules (PIV). Enfin, nous présentons quelques applications de cette technique pour l'analyse cellulaire unique, y compris la cellule poration de la membrane avec absorption macromolécule, déformation de la membrane localisée déterminée par les déplacements des billes de intégrine de liaison attachés, et la réponse de calcium intracellulaire de l'imagerie ratiométrique. Nos résultats montrent que un flux d'éjection rapide et directionnelle est proproduite par l'interaction tandem bulle, qui peut imposer une contrainte de cisaillement très localisée sur la surface d'une cellule cultivée à proximité. En outre, les différents effets biologiques peuvent être induites en modifiant la résistance de l'écoulement de jet en réglant la distance de sécurité de la cellule pour les bulles en tandem.

Introduction

Il y a une reconnaissance croissante que l' hétérogénéité cellulaire, résultant de l'expression stochastique des gènes, des protéines et des métabolites, existe au sein d' une grande population de cellules et sert un principe fondamental en biologie pour permettre l'adaptation de la cellule et de l' évolution ^1. Par conséquent, il est souvent imprécis et peu fiable pour utiliser des mesures en vrac sur la population pour comprendre la fonction des cellules individuelles et de leurs interactions. Le développement de nouvelles technologies pour l' analyse unicellulaire est donc d' un grand intérêt dans la recherche biologique et pharmacologique, et peut être utilisé, par exemple, pour mieux comprendre les voies et les processus de signalisation clés en biologie des cellules souches et la thérapie du cancer ^2-4. Au cours des dernières années, l'émergence de plates - formes microfluidiques a grandement facilité l' analyse unicellulaire, où le positionnement, le traitement et l' observation de la réponse de cellules individuelles ont été réalisées avec des stratégies d' analyse nouvelles ^5.

Cavitation joue un rôle important dans un large éventail d'applications biomédicales, y compris le traitement des cancers par ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) ^6, la fragmentation non-invasive de calculs rénaux par lithotritie par ondes de choc (SWL) ^7, l' administration de médicaments ou d'un gène par sonoporation ^8, et la destruction récemment rapporté des cellules ou des tissus par hydrodynamique bulle cavitation ^9,10. Malgré cela, les processus dynamiques de bulle (s) de cavitation interactions avec les tissus biologiques et les cellules ne sont pas bien compris. Ceci est dû au caractère aléatoire de cavitation d'initiation et de bulle dynamique produites par les ultrasons, les ondes de choc et de la pression hydraulique locale; en outre, il y a un manque de permettre des techniques pour résoudre les réponses intrinsèquement complexes et rapides de cellules biologiques, en particulier au niveau d'une seule cellule.

En raison de ces défis, il est pas surprenant que très peu d'études ont abeillen signalé pour étudier les interactions bulle de cellules dans des conditions expérimentales bien contrôlées. Par exemple, la poration de la membrane des cellules individuelles en suspension piégée ¹¹ et la grande déformation impulsif des globules rouges humains ¹² ont été démontrées en utilisant des bulles générées par laser uniques dans des canaux microfluidiques. Cette dernière technique, cependant, ne peut produire de très petites déformations dans des cellules eucaryotes en raison de la présence du noyau ^13. Par ailleurs, il est difficile de contrôler les effets biologiques en aval lorsque l'on traite les cellules en suspension. Dans d' autres études, l' échographie excitation d'un micro - bulles lié à la cellule (ou agent de contraste pour ultrasons) pour produire la poration de la membrane et / ou des réponses du calcium intracellulaire dans les cellules adhérentes individuelles a été rapporté ^8. Membrane poration de cellules adhérentes simples peut également être produit en utilisant des bulles tandem laser généré dans une mince couche de liquide contenant Trypan solution bleu absorbant la lumière ^14, oupar une bulle de gaz oscillante produite par des impulsions laser d' une microseconde irradiant au moyen d' un substrat optiquement absorbant dans microchambres ^15. Par comparaison, le substrat d'absorption optique présente un avantage par rapport à la solution de bleu de Trypan laser absorbant parce que ce dernier est toxique pour les cellules. Plus important encore, les bulles de laser générées sont plus contrôlable en termes de taille des bulles et de l'emplacement que des bulles acoustiquement excités. Néanmoins, dans toutes ces études antérieures, la forme de la cellule, l' orientation et les conditions d'adhésion ne sont pas contrôlées, ce qui peut influencer sensiblement la réponse cellulaire et bioeffets produites par des contraintes mécaniques ^16.

Pour remédier à ces inconvénients dans les études précédentes, nous avons récemment mis au point un système expérimental pour la génération de bulles, patron de cellules, interactions bulle-bulle de cellules, et en temps réel des essais biologiques de la réponse cellulaire dans une puce microfluidique construit en utilisant une combinaison unique de microfabrication techniques. Les trois principales caractéristiques qui distinguent notre système expérimental des autres dans le domaine sont: 1) la formation de motifs de points d'or de taille micronique sur le substrat de verre pour permettre l' absorption du laser localisé pour la génération de bulles ^17; 2) la formation de motifs d'îlots de taille micronique de la matrice extracellulaire (ECM) pour l'adhérence des cellules sur le même substrat pour contrôler à la fois l'emplacement et la géométrie des cellules individuelles; et 3) la compression de la dimension du domaine d'interaction bulle-bulle-cellule de la 3D à un espace-2D quasi pour faciliter la visualisation dans le plan d'interactions bulle-bulle, jet champs d'écoulement, la déformation de la cellule, et bioeffets, tous capturés dans une séquence d'imagerie simplifiée (figure 1d).

Figure 1: La puce et les schémas des différents dosages microfluidique. a) Une puce microfluidique assemblé avec des canaux rempli d'encre bleue pour la visualisation. b) une région à l' intérieur de la puce microfluidique avec des cellules à motifs et les points d'or (la distance entre les deux points d'or à proximité de 40 um). De nombreuses paires d'unités de travail peuvent être disposés dans un canal. c) l' image Close-up d'une unité de travail unique constitué d'une paire de points d'or et une cellule HeLa adhéré à la région de cellule de motif. d) Représentation schématique du fonctionnement du dispositif. Une seule cellule adhère et se répand sur le "H" île en forme revêtue de fibronectine. Une paire de bulles de cavitation (tandem à bulles) avec opposition de phase d' oscillation sont produites par des faisceaux lumineux de laser pulsé sur les points d'or (voir la figure 4a), conduisant à la génération d'un jet rapide et localisée se déplaçant vers la cellule cible à proximité. La cellule peut être déformé, porée pour l' absorption macromoléculaire, et / ou stimuler une réponse de calcium, en fonction de la distance de sécurité (S _d) de la cellule à la bulle en tandem.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Cette plate-forme peut être combiné avec des dosages de fluorescence et des billes fonctionnalisées fixées à la surface cellulaire pour les effets biologiques induits par cavitation. En particulier, cette plate-forme ouvre la voie à des tests fiables et quantifiables au niveau d'une seule cellule. Jusqu'à présent, nous avons utilisé le dispositif pour l'analyse des bulles d'air en tandem induit la déformation de la membrane cellulaire, la poration de la cellule et l'absorption intracellulaire, la viabilité, l'apoptose et la réponse du calcium intracellulaire. Dans le protocole suivant, nous décrivons le processus de fabrication de puces et de la procédure d'analyse des divers effets biologiques mentionnés ci-dessus. Par ailleurs, les opérations de la puce sont également décrits.

Protocol

1. microfabrication

NOTE: Toutes les procédures de microfabrication sont effectuées dans une salle blanche. Un masque de chrome est conçu avant la microfabrication, voir la figure 2.

Figure 2: Représentation schématique de la conception du canal dans la puce microfluidique et les dimensions des unités de travail. a) la conception des masques des PDMS microcanaux alignés (vert) et les motifs sur le substrat (bleu et rouge) verre. b) image agrandie de la conception du masque dans une section représentative des tableaux de travail de l' unité. c) Schéma d'une unité de travail montrant un motif de cellule (bleu) et une paire de points d'or (rouge). Toutes les échelles de longueur sont affichés en bas à droite. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une larger version de ce chiffre.

1. Or dot patterning
   REMARQUE: La zone de chaque point d'or est conçu pour être à l'intérieur de 25 à 30 ^pm2, de sorte qu'il est assez grand pour absorber l' énergie du laser pour la génération de bulles, mais assez petit pour éviter des cellules individuelles qui y adhèrent. Un schéma de principe pour la réalisation de points d'or est représentée sur la figure 3a.
   1. Slide verre nettoyage (dans une hotte chimique)
      1. Rincer la lame de verre avec de l' acétone suivie de l' alcool isopropylique (IPA), puis le sécher avec N ₂ flux.
      2. Faire tremper la lame dans une solution de piranha (H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ = 4: 1) pendant 10 min.
      3. Retirez la lame, le rincer avec de l' eau DI, puis sécher avec N ₂ flux.
      4. Cuire la lame de verre sur une plaque chauffante à 120 ° C pendant 10 min.
      5. Traiter la lame dans un asher de plasma à 100 W pendant 90 s.
   2. Spin-revêtement (hotte spin-coating)
      1. Tourner sur une plaque chauffante et attendre jusqu'à ce que la température est stable à 95 ° C.
      2. Suivez la procédure de revêtement:
         1000 rpm pendant 5 s avec un / s rampe de 500 rpm;
         puis 3000 tours par minute pendant 30 s avec un / s rampe de 1000 rpm.
      3. Fixer la lame de verre nettoyé sur la tournette en appliquant un vide.
      4. Couvrez la surface de glissement avec P-20 et commencer la recette de revêtement.
      5. Répétez le processus de revêtement pour photoresist NFR négatif.
      6. Cuire la lame à 95 ° C pendant 60 s et attendre jusqu'à ce qu'il se refroidit à la température ambiante.
   3. Photolithographie
      1. Monter le masque de chrome sur le aligneur de masque et assurez-vous que le côté du motif est orienté vers le bas vers la diapositive.
      2. Réglez la recette de photolithographie en mode d'exposition dur avec 9 s de l'exposition aux UV et rapidement aligner le substrat de verre avec le masque.
      3. Après la réalisation de l'exposition aux UV, cuire la lame à 956; C pendant 1 min, puis laissez-le refroidir à la température ambiante.
   4. Développement
      1. Développer le motif sur la diapositive dans une solution de développement pendant 60 s.
      2. Retirer la lame du développeur, rincer avec de l' eau DI, et le sécher avec N ₂ flux.
      3. Vérifiez la géométrie du motif sous un microscope, et mesurer et enregistrer la taille de la fonction.
   5. Dépôt d'or (évaporation par faisceau d' électrons) et lift-off
      1. Cuire la diapositive à 120 ° C pendant 5 min, et le laisser refroidir à la température ambiante.
      2. Nettoyer la lame avec le plasma dans la machine de gravure ionique réactive (RIE) pendant 90 s à 500 Torr et 100 W.
      3. Dépôt de 5 nm de Ti et 15 nm de Au sur la diapositive à l' aide d' un évaporateur E-faisceau ^17.
      4. Faire tremper la lame pendant une nuit dans un récipient en verre contenant photoresist solvant pour éliminer le repos de l'or sur le dessus du NFR résister décapant.
      5. Récupérer la diapositive, rincer it avec de l' acétone suivie d'IPA et le sécher avec N ₂ flux.
      6. Sécher la lame sur une plaque chaude à 115 ° C avant de le nettoyer dans le plasma asher d'oxygène à 100 W pendant 90 s.
2. Moléculaire-assemblage de motifs par lift-off (MAPL)
   Remarque: La zone de chaque île de fibronectine est réglé pour être dans les 700-900 pm ² pour faciliter la cellule adéquate HeLa propagation dans une zone carrée , tout en minimisant les chances de multiples cellules d' agrégation sur l'île. Un schéma pour la préparation d'îlots de cellules patterning est représentée sur la figure 3b.
   1. Revêtement de Spin
      1. Répétez l'étape 1.1.2, mais utiliser photoresist S1813-positive et une température de 115 ° C.
   2. photolithographie alignés
      1. Monter le masque de chrome sur le aligneur de masque et assurez-vous que le côté avec le motif est orienté vers le bas en direction de la lame avec lapoints d'or.
      2. Réglez la recette de photolithographie en mode d'exposition dur avec 9 s de l'exposition aux UV.
      3. Alignez le masque dessus avec la glissière inférieure à l'aide des repères d'alignement situés sur le bord du masque, comme une référence spatiale.
      4. Vérifiez la partie centrale du masque et vérifiez que les caractéristiques de modèle sont correctement alignés.
      5. Terminez l'exposition aux UV sans post-cuisson.
   3. Développement
      1. Répétez l' étape 1.1.3 , mais avec 45 s de développement avant le séchage sur une plaque chauffante et la préservation de N ₂ stockage.
3. Traitement chimique
   1. Préparer la solution de passivation: 0,5 mg / mL PLL-g-PEG dans du tampon HEPES 10 mM.
   2. Récupérer la diapositive à partir de N ₂ stockage et le nettoyer à l' aide RIE avec le réglage des paramètres: 500 Torr pression, puissance 100 W, et 90 s durée.
   3. Introduire à la pipette une goutte de solution passivante sur un morceau de film de paraffine.
   4. Sandwich la solution avec le film et la diapositive, faire en sorte que le côté avec le motif fonctionnalités est orientée vers le bas vers le film; éviter la formation de bulles.
   5. Attendez 45 min avant de retirer la lame du film.
   6. Faire tremper la lame consécutivement dans photoresist décapant, décapant photoresist et de l'eau DI (1: 1), et de l'eau déminéralisée, et agiter dans un bain à ultrasons pendant 90 s pour chaque trempage.
   7. Sécher la lame sur une plaque pour enlever l'humidité avant de le sceller dans un dessiccateur et le stocker dans un réfrigérateur.
4. assemblage Chip
   1. Répéter les étapes 1.1.1-1.1.4, mais avec SU8-2025 négatif résine photosensible et le réglage du paramètre appelé le protocole visé Microchem ^18, pour préparer un moule en silicone avec un photomasque.
   2. Fabriquez un microcanal PDMS (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x P x H) et une petite dalle de PDMS (800 structure rainurée um-large) en utilisant la lithographie douce.
   3. Percez le microchannel pour les ports d'accès de fluide et propre avec du ruban adhésif, puis avec de l'IPA.
   4. Protéger la zone à motif du substrat en verre avec la plaque en PDMS et d'appliquer RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) pour éliminer PLL-g-PEG de la zone périphérique.
   5. Traiter le microcanaux avec une dose réduite de RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), puis l'aligner sur le substrat de verre imprimé (avec la petite dalle de PDMS enlevée); amener le micro-canal et le substrat en verre à motif en contact conformationnelle sous un stéréoscope.

Figure 3: Schémas pour la microfabrication et la puce ensemble. a) Modèle de points d'or sur le substrat de verre. b) Préparation du substrat de verre pour la formation de motifs de cellule par l' intermédiaire MAPL. c) Assemblée du canal microfluidique avec une liaison de plasma. Voir la liste des matières pour les définitions of les abréviations. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

5. Attachement cellulaire
   REMARQUE: Les cellules Hela sont maintenues en routine dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS et des antibiotiques / anti-mitotique solution à 1% dans un incubateur de culture cellulaire. Un schéma de principe pour la fixation de l' assemblage de puce et de la cellule est représentée sur la figure 3c.
   1. Amorçage de la puce avec du PBS pendant 30 min à 1 pl / min, puis faire infuser une solution de fibronectine (50 pg / ml dans du PBS, 1 ul / min) pendant 45 min.
   2. En attendant, la culture trypsiniser cellulaire avec 0,25% de trypsine-EDTA, lavez - les dans un milieu de culture, les cellules individuelles de centrifugeuses, et reconstituer la suspension cellulaire dans préchauffé (37 ° C) milieu de culture à 5x10 ⁶ cellules / mL.
   3. Remplacer la solution de fibronectine avec du PBS et rincer la puce à 10 pi / min pendant 5 min.
   4. Injecterla suspension cellulaire préparée dans la puce, arrêter l'écoulement, la pince de sortie, et à maintenir la puce dans un incubateur de culture cellulaire pendant 30 min.
   5. Libérer la sortie de la puce et rincer avec le milieu de culture cellulaire à 10 ul / min pendant 5 min. Réduire le débit de perfusion du milieu de culture à 0,75 ul / min et maintenir la culture cellulaire pendant 2 h dans l'incubateur.

2. Bubble Generation and Flow Visualization

REMARQUE: Un schéma du montage expérimental est représenté sur la figure 4a pour la génération tandem bulle et l'interaction de flux résultant avec une seule cellule cultivée à proximité dans un canal microfluidique.

1. Génération tandem bulles avec deux lasers et commande de synchronisation
   1. Placez la puce microfluidique sur la scène d'un microscope inversé et aligner les foyers de deux pulsés lasers Nd: YAG (λ = 532 nm, durée d'impulsion 5 ns) sur une paire de motifs de points d'or b séparésy 40 um.
   2. Utiliser un générateur de retard numérique pour déclencher les deux lasers avec un retard de temps d'environ 2,5 ms pour produire deux bulles initiées au niveau des points d'or.
   3. Ajuster l'énergie de sortie du laser (~ 10 uJ) pour produire un diamètre maximal des bulles à l'intérieur de 50 ± 2 um.
   4. Synchroniser une caméra à grande vitesse (exposition de 200 ns et 2 millions d'images par seconde (fps)) pour les lasers et saisir la dynamique de l'expansion de la bulle, l'effondrement, l'interaction bulle-bulle, et la formation de jet.
2. Quantification de la vitesse du jet
   1. Enregistrer la position de la pointe de jet (J ₁₎ à l'extrémité proximale de la première bulle (B ₁₎ et l'extrémité distale de B _1, à partir de la génération de la seconde bulle (B ₂₎ et se terminant par le touché de J ₁ en direction de l'extrémité distale de B _1; voir le schéma de la figure 5a.
   2. adapter Linéairement l'évolution temporelle de la position de both proximal (pointe du jet) et les extrémités distales. Calculer la pente de la position de la pointe par rapport à la courbe de temps de l'extrémité proximale afin de déterminer la vitesse du jet. L'intersection des deux lignes indique le temps jet d'atterrissage. Plus de détails peuvent être trouvés dans la référence 19.
3. Visualisation du champ d'écoulement induite bulle tandem
   1. Préparer 1 um de polystyrène (PS), la suspension de billes dans de l'eau déminéralisée (2,6% p / v) et injecter les perles dans la puce microfluidique.
   2. Générer des bulles en tandem comme décrit à l'étape 2.1.1-2.1.3.
   3. Notez la dynamique tandem à bulles à l'aide d'une caméra vidéo à haute vitesse à un taux d'encadrement de 5 M fps avec un temps d'exposition de 100 ns.
   4. Téléchargez la séquence d'images acquises dans un logiciel de PIV commercial.
   5. Diviser chaque image en petites fenêtres d'interrogation de 16 x 16 pixels (px) avec un chevauchement de 75%.
   6. Appliquer à plusieurs passes itération et les filtres régionaux pour réduire les erreurs dans le domaine de la vitesse de calcul, etsortie les résultats dans une carte du vecteur vitesse.

Figure 4: Schéma du dispositif expérimental et l' enregistrement de l' image. a) Montage expérimental pour la génération tandem bulle. b) la séquence temporelle utilisée pour différents types d'acquisitions d'images. FL: microscopie à fluorescence, BF: champ lumineux, IFT: temps intertrame. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. unicellulaire Analyse et effets biologiques

REMARQUE: La bulle est produite en tandem à côté des cellules cibles, ainsi que les effets biologiques obtenus sont étudiés d'une manière dépendant de la distance entretoise. La séquence temporelle des différents types d'acquisitions d'images est représenté sur la figure 4b.

1. Membrane poration et l' absorption macromoléculaire
   NOTE: L'absorption de macromolécules extra-cellulaires dans la cellule cible est caractérisée par la diffusion progressive de la membrane iodure de propidium imperméant (PI) par le biais du site de poration de la membrane cellulaire.
   1. Suite à l' étape 1.5, remplacer le milieu de culture ordinaire ( par exemple, DMEM) avec une solution de PI (100 pg / ml dans du DMEM) fonctionnant à un débit de perfusion de 0,5 ul / min pendant toute l'expérience.
   2. La programmation du logiciel de commande du microscope pour sélectionner automatiquement le PI cube fluorescent sur la tourelle rotative et synchroniser la synchronisation de la caméra CCD avec l'excitation de la fluorescence PI pour capturer des images de fluorescence avec un temps d'exposition de 200 ms.
   3. Après les deux foyers laser sont alignés sur une paire de points d'or à côté d'une cellule cible, record à la fois champ clair (BF) et la fluorescence (FL) images avant le traitement tandem bulle.
   4. Utilisez un logiciel de contrôle de microscope immédiatementlancer un laps de temps de fluorescence d'enregistrement d'image de la cellule cible, peu de temps après l'étape 2.1 pour capturer l'historique du absorption de PI.
2. Déformation de la membrane
   1. Préparer des billes de 1 pm (1% p / v, activés avec un carbodiimide soluble dans l'eau) et de les fonctionnaliser avec le peptide 2000 (100 pg / ml dans du PBS).
   2. Suite à l' étape 1.5, incuber les cellules attachées avec les perles fonctionnalisées à une densité de 1x10 ⁹ billes / mL à 37 ° C pendant 30 min.
   3. Répétez l'étape 2.1 pour produire des bulles tandem à côté de la cellule cible et enregistrer la déformation de la cellule avec une caméra ultra-haute vitesse fonctionnant à un taux de 5 millions de fps de cadrage.
   4. Identifier une triade de 3 perles qui restent sur le plan d'imagerie tout au long de l'expérience et de compiler leur position de (x _1, y ₁₎ (x _2, y _2), et (x _3, y ₃₎ les coordonnées dans l'expérience.
   5. Calculer la superficie de la triade avant et after le traitement tandem à bulles en utilisant la formule:
      
   6. Calculer la souche de la zone comme:
      
   7. Sur la base des coordonnées des trois sommets avant et après le traitement de la bulle en tandem, calculer la déformation et la zone principale souche locale suivant les protocoles établis ^20,21.
3. Viabilité et apoptose
   NOTE: FITC Annexin V marque les cellules, y compris les apoptotiques, par l'externalisation de la phosphatidylsérine (fluorescence verte). PI marque les noyaux des cellules nécrotiques (fluorescence rouge). imagerie du champ lumineux est utilisé pour documenter la morphologie des cellules et pour aider à l'identification de la viabilité cellulaire et l'apoptose.
   1. Notez la position de chaque cellule traitée dans le canal microfluidique (facilitée par les étiquettes d'adresse dans le canal, voir la figure 2b
   2. Incuber les cellules traitées dans le milieu de culture cellulaire pendant 2 h avant de perfuser la puce avec une solution de FITC Annexine V pendant 15 min. Les cellules positives présentent une fluorescence verte.
   3. Répétez l'étape 3.3.2 24 h après le traitement tandem de bulle pour étudier les effets biologiques à long terme dans les cellules ciblées.
4. Réponse de calcium
   1. Mélanger 3 ul de Fura-2 heures la solution mère (1 mg / ml dans du DMSO) avec 3 ul de 10% p / v de Pluronic F-127 dans 500 ul de milieu sérique réduit pour préparer la solution de marquage finale (6 uM).
   2. Suite à l'étape 1.5, remplacer le milieu de culture cellulaire avec la solution de marquage et incuber à température ambiante dans l'obscurité pendant 40 min (1 pl / de débit de perfusion min).
   3. Remplir le canal avec le milieu de sérum réduit (0,75 ul / débit de perfusion de minutes) avant de commencer l'expérience cellulaire.
   4. Lancer l'imagerie ratiométrique (longueur d'onde: 340/380 nm, une exposition de 50 ms)de la cellule cible en utilisant le système PTI commercial.
   5. Après 10 s de l'imagerie ratiométrique de la cellule au niveau de repos, produire des bulles en tandem comme dans l'étape 2.1; premier enregistrement avec un temps de intertrame (IFT) de 0,1 s pendant 1 min, puis augmenter l'IFT à 1 s pour un autre min, et augmentation supplémentaire de 5 s après 2 min.
   6. Utiliser le logiciel PTI pour calculer le rapport R = F340 / F380 dans la région d'intérêt (ROI), qui est proportionnelle à la concentration de calcium intracellulaire.

Results

La plate-forme microfluidique décrit dans ce travail peut être utilisé pour étudier les interactions bulle-bulle et d'analyser une variété de bioeffets induite par cavitation au niveau d'une seule cellule. Ici, nous présentons plusieurs exemples pour démontrer une variété d'études et d'essais biologiques expérimentales qui peuvent être effectuées dans notre système expérimental. Nous allons d' abord illustrer les interactions transitoires de bulles en tandem avec la formation du jet, la ...

Discussion

Analyse unicellulaire, en combinaison avec l' imagerie des cellules vivantes, a grandement amélioré notre compréhension des processus dynamiques et souvent variables dans des cellules individuelles, telles que le développement du phénotype et la réponse immunitaire ^23. Contrairement à la culture cellulaire classique dans des boîtes ou flacons, systèmes microfluidiques permettent un contrôle précis du microenvironnement, jusqu'au niveau d'une seule cellule, en temps réel. Par conséquent, les progrè...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
réactif/matériaux
75 mm x 38 mm Lames de microscope	ordinaire Corning	2947-75X38
Acetone	Sigma Aldrich, Co.	320110	Réactif ACS, &ge ; 99,5 %
d’alcool isopropylique	Sigma Aldrich, Co.	W292907	&ge ; 99,7 %, FCC, FG
Acide sulfurique	Sigma Aldrich, Co.	320501	réactif ACS, 95,0-98,0 %
Peroxyde d’hydrogène	Sigma Aldrich, Co.	216763	30 % en poids dans H2O
Primer P-20	Microchem	MCC Primer 80/20
NFR photoresist	JSR	NFR016D2
Photomask	Photoplotstore	N/A	4x4 Masque d’écriture directe
MF-319 Développeur	Shipley (Rohm and Haas)	Microposit MF-319
1165 Dissolvant de résine	photosensible Dow Chemical, Co.	DEM-10018073	à base de 1-méthyl-2-pyrrolidinone
	Shipley (Rohm et Haas)	S1813
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Film de paraffine	HACH	251764
SU-2025 photorésine	Microchem	SU-2025
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Tube de micro-alésage	Saint-Gobain PPL Corp.	S-54-HL
Goupilles métalliques	New England Petit tube	NE-1300-01	Tube coupé (droit), 0,025" OD x 0,017 po ID x 0,50 po
Cellules HeLa	Duke Cell Culture Facility	(307-CCL-2) HeLa, p.148
Tampon DPBS (1x) ThermoFisher	Scientific	14190144
Milieu de culture DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065
Fibronectine Protéine bovine, Plasma	ThermoFisher Scientific	33010018
0,25 % Trypsine-EDTA (1x)	ThermoFisher Scientific	25200056
Iodure de propidium	ThermoFisher Scientific	P21493
Microsphères de carboxylate 1,00  ; &mu ; m	Polysciences, Inc	08226-15
Microsphères de carboxylate 2.00  ; &mu ; m	Polysciences, Inc	18327-10
EDC (chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide)	ThermoFisher Scientific	22980
Sulfo-NHS	Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	24510
Peptite-2000	Advanced BioMatrix	5020-5MG
FITC Annexin V	ThermoFisher Scientific	A13199
Fura-2, AM	ThermoFisher Scientific	F1221
DMSO	Sigma Aldrich, Co.	D2650
F-127	invitrogen	P6866	0.2 & micro ; m filtré (solution à 10 % dans l’eau)
Sérum réduit	ThermoFisher Scientific	11058021
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Equipment
Assher plasma	Emitech	K-1050X	O2 / Ar plasma d’incinération de photorésine et autres matières organiques
Aligneur de masque	SUSS MicroTec  ;	Karl Suss MA6/BA6
Évaporateur à faisceau d’électrons	CHA Industries CHA	Industries Solution E-Beam
RIE	Trion Technology  ;	Trion Technology Phantom II(	oxyde/ nitrure/ polymère) Gravure
Stéréoscope	AmScope	American Scope SM-4TZ-FRL	Stéréomicroscope
Pompe à seringue	Chemyx Inc	NanoJet
Incubateur de culture cellulaire	NuAire	AutoFlow NU-8500 Chemise d’eau CO2 incubateur
Enceintes de sécurité biologique	NuAire	NU-425-400
Bain-marie	VWR	1122s
Centrifugeuse	IEC	Centra CL2
Microscope	Zeiss	Axio Observer Z1
Nd :YAG laser  ; (laser 1)	New Wave Research	Tempest
Nd :YAG laser  ; (laser 2)	New Wave Research	Orion
Delay generator	Berkeley Nucleonics  ;	BNC 565-8c
Lampe flash	Dyna-Lite	ML1000
	DRS Hadland	; Caméra haute vitesse Imacon 200
Caméra haute vitesse	Shimadzu	HPV-X
Caméra haute vitesse	Vision Research	Phantom V7.3
Logiciel PIV	Caméra LaVision	DaVis 7.2
	Zeiss	AxioCam MRc 5
Système	Zeiss	AxioVision
PTI Horiba		S/N : 1705 RAM-X
Logiciel EasyRatio	Horiba	Easy Ratio Pro 2	version 2.3.125.86
63× objectif	Zeiss	LD Plan Neofluar