Article de méthode

Surveillance des astrocytes réactivité et prolifération in Vitro dans des Conditions de type ischémique

DOI :

10.3791/55108

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21 octobre 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical Sciences, Campus, University of Puerto Rico

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Accident vasculaire cérébral ischémique est un événement complexe dans laquelle l’apport spécifique des astrocytes dans la région du cerveau touchée exposés au manque d’oxygène de glucose (AMG) est difficile à étudier. Cet article présente une méthode pour obtenir des astrocytes isolés et étudier leur réactivité et leur multiplication dans des conditions de ministères.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Accident vasculaire cérébral ischémique est un complexe crânien provoqué par un thrombus ou embolie entrave à la circulation sanguine vers les parties du cerveau. Cela conduit à la privation d’oxygène et de glucose, ce qui provoque la défaillance de l’énergie et la mort neuronale. Après une insulte d’accident vasculaire cérébral ischémique, astrocytes devient réactifs et prolifèrent autour du site de la lésion qu’il développe. Selon ce scénario, il est difficile d’étudier la contribution spécifique des astrocytes dans la région de cerveau exposé à l’ischémie. Par conséquent, cet article présente une méthodologie pour étudier la réactivité primaire astrocyte et prolifération dans un modèle in vitro d’un environnement de type ischémie, appelé la privation d’oxygène glucose (AMG). Les astrocytes ont été isolés de 1 à 4 jours-vieux rats néonatals et le nombre de cellules astrocytaires non spécifique a été évaluée à l’aide du marqueur sélectif astrocyte gliale fibrillaire acide protéine (GFAP) et la coloration des noyaux. La période dans laquelle astrocytes sont soumis à la condition de l’AMG peut être personnalisée, ainsi que le pourcentage d’oxygène, qu'ils sont exposés. Cette souplesse permet aux scientifiques de caractériser la durée de la condition de type ischémique dans différents groupes de cellules in vitro. Cet article explique les délais d’AMG qui induisent la réactivité de l’astrocyte, morphologie hypertrophique et prolifération telle que mesurée par l’immunofluorescence utilisant prolifèrent Cell Nuclear Antigen (PCNA). En plus de la prolifération, astrocytes subissent l’énergie et du stress oxydatif et de répondent aux autres ministères en libérant des facteurs solubles dans le milieu cellulaire. Ce moyen de communication peut être collecté et utilisée pour analyser les effets des molécules libérées par les astrocytes dans des cultures primaires de neurones sans interaction cellule-cellule. En résumé, ce modèle de culture cellulaire primaire peut être utilisé efficacement pour comprendre le rôle des astrocytes isolés sur blessure.

Introduction

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Accident vasculaire cérébral est défini comme « un dysfonctionnement neurologique aiguë d’origine vasculaire avec développement rapid ou soudain des symptômes et des signes, correspondant à la participation des principaux domaines d’action dans le cerveau »1,2. Il existe deux types d’AVC : hémorragique et ischémique. Lorsque la dysfonction vasculaire est causée par un anévrisme ou une défectuosité artério-veineuse, accompagné d’affaiblissement postérieur de rupture d’une artère, il s’agit alors d’accident vasculaire cérébral hémorragique3 qui, dans la plupart des cas, conduit à la mort. Lorsqu’un thrombus ou une embolie fait obstacle à la circulation sanguine, provoquant une privation temporaire d’oxygène et de glucose à une région du cerveau, il est appelé accident vasculaire cérébral ischémique4. Incapacité à nourrir les cellules autour de la zone touchée ou ischémique de base conduit à un déséquilibre métabolique et homéostatique, dysfonction énergique, la mort neuronale et inflammation5, qui peut entraîner une invalidité permanente chez les patients6.

Accident vasculaire cérébral ischémique est une lésion multifactorielle impliquant plusieurs types de cellules qui réagissent et exercent leurs effets à des moments différents. De nombreuses interactions créent un environnement difficile pour étudier le comportement des cellules individuelles. Alors, Comment étudier la contribution d’un type de cellule spécifique dans un environnement aussi complex ? Un modèle accepté in vitro de l’ischémie se compose d’exposition des cellules à la privation d’oxygène et de glucose (AMG), pendant une certaine période, suivie par la restauration des cellules à un environnement normoxiques. Ce système simule un accident ischémique cérébral, suivi d’une reperfusion artérielle. Dans cette méthode, cellules ou tissus sont exposés à un média sans glucose dans un environnement purgé de l’oxygène, en utilisant une chambre hypoxique spécialisée. Le temps d’incubation AMG peut varier de quelques minutes jusqu'à 24 h, selon l’hypothèse qui veut être testé. Des études ont montré que, selon les temps des autres ministères et normoxique environnement, phénotypes spécifiques d’accident vasculaire cérébral (c.-à-d., aiguë ou subchronique) peut être réalisé. Des astrocytes primaires isolées, exposés à d’autres ministères à restauration postérieure à conditions normoxiques, est un modèle cellulaire bien étudié pour imiter course in vitro7. À l’aide d’autres ministères est possible de révéler les mécanismes moléculaires indépendantes des cellules isolées dans un environnement de type accident vasculaire cérébral.

Comme nos connaissances de la biologie de l’astrocyte augmente, il est devenu évident qu’ils sont essentiels pour le maintien des synapses et soutenir la réparation, le développement et la plasticité neurale8. Dans des conditions normales, les astrocytes libèrent et répondent aux cytokines, chimiokines, facteurs de croissance et gliotransmetteurs, garder l’équilibre métabolique et l’homéostasie au sein de synapses5,9. En neuro-inflammation aiguë, comme l’accident vasculaire cérébral ischémique, ces cellules peuvent devenir réactives, montrent une surexpression à long terme de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et montrent une hypertrophie dans leur morphologie5,10, 11 , 12. comme l’infarctus ischémique se développe, l’homéostasie fourni par les astrocytes devient affectée, ce qui concerne l’absorption normale de glutamate, métabolisme énergétique, l’échange des molécules actives et anti-oxydant activité13.

Astrocytes réactivées prolifèrent autour du tissu de l’infarctus, tandis que les leucocytes migrent vers la zone lésés14. Astrocytes prolifération peut être mesurée à l’aide de marqueurs comme antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA), Ki67 et bromodéoxyuridine (BrdU)15. Cette réponse proliférative est générée de façon dépendante du temps, et il contribue à former la cicatrice gliale, un tableau des astrocytes irréversiblement réactives le long du parenchyme du site endommagé après une blessure9. Une des fonctions premières de cette cicatrice est de limiter l’extravasation de cellules immunitaires dans cette région. Toutefois, des études ont montré que la cicatrice devienne un obstacle physique d’axones étendre, car ils libèrent des molécules inhibant la croissance axonale et créer une barrière physique qui empêche que les axones s’étendant autour de la zone lésée16. Néanmoins, il existe des preuves scientifiques montrant qu’après une blessure de la moelle épinière, complètement éviter la formation de la cicatrice gliale peut nuire à la régénération des axones17. Ainsi, le contexte dans lequel la réponse astrocytaires spécifique est mesuré, doit être considéré sur le cadre de la lésion étudié.

La méthodologie présentée peut être appliquée à l’étude de la fonction individualisée des astrocytes après la privation d’oxygène glucose et elle peut être modifiée selon les questions que le chercheur veut répondre. Par exemple, outre les changements morphologiques et les marqueurs exprimés à des moments différents ministères, les surnageants d’astrocytes exposés à d’autres ministères peuvent être davantage analysés afin d’identifier des facteurs solubles libérées par ces cellules, ou utilisé comme un milieux conditionnés pour évaluer ses effet dans d’autres cellules du cerveau. Cette approche permet aux études sur la réactivité d’astrocyte qui pourraient mener à l’élucidation des facteurs qui régissent et modulent leur réponse dans un scénario d’accident ischémique cérébral.

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Protocole

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postnatals rats (rats Sprague Dawley) 1-4 jours vieux sont utilisés pour isoler le cortex. La méthode d’euthanasie est décapitation, tel qu’approuvé par le NIH guidelines.

1. préparation des Instruments et matériaux pour chirurgie

  1. instruments de stériliser à l’autoclave (température : 121 ° c, pression : 15 psi, temps : 30 minutes) à l’aide d’une boîte en acier ou un instant sachet de stérilisation d’étanchéité. Voir des matières Table des matières.

2. Compléter DMEM préparation

  1. dans un bécher d’un litre contenant 700 mL d’eau stérilisés à l’autoclave, ajoutez Dulbecco ' s Modified Eagle ' s en poudre à la température ambiante moyenne.
  2. Ajouter 3,7 g/L de bicarbonate de sodium, tandis que la solution est agitée avec un agitateur magnétique.
  3. , Ajuster le pH à 7.4, avec de l’eau autoclavé porter volume jusqu'à 1 L, puis filtre. À des fins de culture, compléter le volume souhaité de médias avec 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine et chaud à 37 ° c. Voir des matières Table des matières.
    Remarque : Le pH est ajusté à 7,4 via l’insertion de l’électrode pH dans les médias. Les médias doivent être en remuant, ajouter lentement puis de 1 NaOH M, à l’aide d’un compte-gouttes.

3. Culture primaire de Astrocyte

Remarque : après l’ensemencement, milieux cellulaires doivent être changés tous les trois jours et les cellules peuvent être cultivées jusqu'à la confluence (11 à 13 jours). Le troisième jour, touchez plusieurs fois et les cellules microgliales ascenseur et cellules progénitrices oligodendrocytes au large de la culture du ballon, supprimer tous les ' vieux ' médias, laver deux fois avec 10 mL de PBS, aspirer le PBS, puis ajoutez des frais nouveaux médias. Voir des matières Table des matières.

    1. Perform la dissection sous une hotte de culture de tissus de la dissection du cerveau de rat nouveau-né. Obtenir 1-4 jours vieux ratons nouveau-nés (2 cerveaux de rat est utilisés par flacon de 75 cm 2).
    2. Préparer trois boîtes de petri de 60 mm et pipette 5 mL de DMEM complet sur chacun.
      Remarque : Ils peuvent être regroupés comme suit : #1 pour chaque rat brain, #2 pour tous les cortex des cerveaux et #3 pour tous les cortex pelées (sans les méninges).
    3. Saisir le pup et vaporiser avec l’éthanol à 70 %. Elle décapiter et jeter le corps dans un conteneur à déchets biohazard petit.
    4. à l’aide de la pince micro-dissection, maintenez la tête et couper la peau sur le dessus de la tête pour exposer le crâne.
    5. Avec une autre paire de ciseaux, faire un " T " incision commençant par l’arrière du crâne vers le nez. Utilisez une paire de pinces pour retirer doucement le crâne.
    6. Enlever le cerveau exposé avec une paire de pinces et de placer le cerveau dans l’un des plats petri précédemment remplis de milieu.
    7. Utiliser un autre ensemble d’instruments stériles pour les étapes subséquentes.
    8. Permet de placer doucement un cerveau sur le couvercle inversé d’un plat de Pétri de 60 mm micro-dissection forceps. Lorsque la boîte de Pétri est placé sur une gaze stérile, il est possible de visualiser le cerveau clairement et il est plus facile à décortiquer.
    9. Régulière du cerveau avec une pince micro-dissection et séparer l’hémisphère cérébral en les taquinant doucement le long de la fissure médiane avec l’extrémité pointue de la pince micro-dissection.
    10. DEVIER et peler le cortex, laissant derrière lui la substance blanche et les transférer sur un plat de Pétri, déjà étiqueté #2. Répétez l’opération pour tous les cerveaux, combinant tous les cortex disséqué dans la boîte de Pétri étiqueté #2.
    11. Sortez de l’hippocampe de dessous chaque cortex et jeter it.
    12. Utiliser la pince micro-dissection et un petri de 60 mm à éplucher délicatement les méninges des lobes corticales individuels et placez-les dans la boîte de Pétri étiqueté #3.
  2. Dissociation tissulaire : méthode mélangeur homogénéisateur
    1. versez suspension tissu/milieu (pelées cortex du cerveau) dans le sac de mélangeur stérile et ajouter assez moyen pour porter le volume total dans le sac à 5 mL.
    2. Placer le sac dans le mélangeur homogénéisateur, laissant environ 2 cm du sac visible au-dessus de la porte fermée. La dissociation cellulaire se faite pendant 2,5 min à grande vitesse.
      Remarque : Sinon, cela peut être fait en fermant le sac et il battre doucement avec un bécher dans la hotte. Assurez-vous d’utiliser un chiffon entre le sac et le bécher pour éviter tout frottement.
    3. Verser la suspension cellulaire dans un tamis à mailles numéro 60, puis versez le débit filtré à travers sur le tamis du numéro 100, ce qui lui permet de filtrer par gravité.
    4. À l’aide de 15 mL tubes, centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g dans une centrifugeuse clinique (préférence swing seau rotor) pendant 5 min.
    5. Décanter le liquide surnageant dans un bécher, puis à l’aide d’une pipette sérologique, remettre en suspension et dissocier le culot de cellules dans un délai maximum de 5 mL de médias.
  3. Comptage cellules
    1. avec une micropipette, collecter 100 µL de la suspension de cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL et ajouter 100 µL de bleu trypan.
    2. Insérer 10 µL de la suspension recueillie dans l’hémocytomètre et compter toutes les cellules qui sont viables aux quatre coins de la place.
    3. Les formules de calcul de la densité des cellules avant de préparer les flacons sont :
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
    4. Ajouter au moins 500 000 cellules par flacon de 25 cm 2. Pipetter jusqu'à 5 mL de DMEM dans chaque fiole. Le mélange ne devrait pas atteindre le col du matras. Les placer dans un incubateur à 37 ° C à 5 % de CO 2, pendant 3 jours, puis changer les médias.
  4. Techniques de purification astrocyte : médias stratégies de changement, mécaniques et chimiques
    Remarque : le taux métabolique des astrocytes est élevé par rapport aux autres types de cellules, par conséquent, dans sur le plan nutritionnel privés des conditions, ces cellules montrent des taux de survie faibles après quelques jours. Contrairement aux astrocytes, la microglie ne sont pas affectés par la privation nutritionnelle et prolifèrent dans ces environnements 18. Pour conserver un nombre réduit de cellules microgliales, les auteurs ont changent les milieux de culture de cellules astroglials tous les 3 jours. Ce changement constant de milieux cellulaires diminuera également la population microgliales qui peut se développer sur le dessus de la monocouche de cellules astrocytaires dans la fiole 19.
    1. Utiliser un Pasteur pipette pour aspirer les médias avec les cellules microgliales non adhérents de chacune des fioles. Laver tous les débris laissés pour compte à l’aide de PBS stérile filtrée à chacune des fioles de manière goutte à goutte (5 mL/flacon).
    2. Ajouter goutte à goutte le DMEM stérile filtrée (avec sérum bovin foetaux et antibiotiques) dans chaque fiole (fiole de 5 mL). Agiter doucement dans un mouvement circulaire pour couvrir toute la surface.
    3. Cellules de lieu dans un 37 ° ; Incubateur à 5 % de CO 2 pendant 8 à 10 jours jusqu'à ce que les ballons atteignent la confluence (> couverture plaque de 95 %).
      Remarque : Plusieurs protocoles ont montré que quand les astrocytes atteignent confluence, des méthodes mécaniques, tels que les poignées de la culture de 2 à 24 h, entraîne le détachement des cellules qui se trouvent sur le dessus de ces astrocytes, la microglie et des précurseurs de cellules 19 , 20.
    4. Des cellules Non-astrocytaires est réduites dans la culture en procédant à une agitation orbitale à 180 tr/min pendant 30 min. Après avoir enlevé les cellules dans le surnageant, supports neufs sont reversé dans le ballon (environ 15 mL).
    5. Pour éliminer les cellules progénitrices oligodendrocytes, augmenter la vitesse de secousse à 200 tr/min à 6 h 21 , 22 , 23, aspirat surnageant et supports neufs pipet.
      Remarque : Pour diminuer la présence des microglies dans les cultures, deux méthodes chimiques peuvent être utilisés de façon séquentielle (non simultanément) dans la méthode de culture de cellules primaires : Arabinose cytosine (Ara-C) et la L-leucine méthyl ester (LME) 24.
    6. Immédiatement quand les cellules atteignent confluence (100 %), 3-4 jours après l’élimination mécanique des microglies, ces cellules peuvent être traitées avec 8 µM de la cytosine d’Arabinose composée antimitotique (Ara-C) en DMEM pendant 5 jours (changement d’Ara-C frais en DMEM quotidiennement).
      Remarque : Le point de temps à ajouter l’Ara-C est critique puisque ce composé est un médicament antimitotique, ce qui réduit le nombre de cellules se divisant rapidement comme les fibroblastes et les cellules microgliales 19 , 25 26 . Contrairement à la microglie, lorsque confluentes, astrocytes ne prolifèrent par l’intermédiaire de l’inhibition de contact 27.
    7. Prévoir 2 jours pour cellules récupérer de l’Ara-C traitement.
    8. Pour réduire la contamination des microglies, lorsque les cellules atteignent la confluence, utilisez 50 mM de L-leucine méthyl ester (LME) en DMEM corrigé à pH 7,4, pendant 1 h à 37 ° c.
      Remarque : LME traverse la membrane des cellules et organites, et après être hydrolysé, la L-leucine produite s’accumule dans les lysosomes des cellules. L’accumulation de cet acide aminé entraîne un gonflement osmotique et rupture des lysosomes 28 , 29. LME est très efficace pour éliminer les cellules microgliales, par rapport aux autres cellules 20 , 30.

4. Cultiver les Astrocytes en plaques 6 puits

  1. lamelles de revêtement poly-D - lysine
    1. Mettez une lamelle dans chaque plat de Pétri de 35 mm, puis ajouter 100 µL de la solution diluée de Poly-D-Lysine à chaque lamelle et attendre 1 h.
    2. Supprimer la Poly-D-Lysine et laver deux fois avec 2 mL d’eau stérile.
    3. Enlever l’eau et attendre que les lamelles couvre-objet sécher à l’intérieur de la hotte. Stocker les lamelles à-20 ° C pendant deux semaines.
      Remarque : Congeler la solution diluée de Poly-D-Lysine ; Il peut être conservé jusqu'à deux semaines.
  2. Trypsinization
    1. à l’aide d’une pipette Pasteur, aspirer le moyen des fioles. Ajouter 5 mL/flacon de PBS stérile filtrée à rincer doucement les cellules.
    2. Aspirer le PBS au large et ajoute ensuite 5 mL/flacon de stérile filtré 0,25 % trypsine et 0,5 mM solution d’EDTA. Placer le ballon dans les 37 ° c, 5 % CO 2 incubateur pendant 10 min.
      Remarque : Alors que les cellules sont en incubation, chauffer 5 mL/flacon de frais DMEM complet à 37 ° C.
    3. Après 10 min d’incubation, agiter pour s’assurer que toutes les cellules sont a décollé le ballon. Ajouter rapidement les 5 mL de DMEM complet chaud dans chaque fiole, pour neutraliser la trypsine.
    4. Pipetez doucement les cellules monter et descendre plusieurs fois pour briser toute " touffes ". Suspension de cellules de transfert de deux flacons dans un tube à centrifuger conique 15 mL.
    5. Centrifuger pendant 5 min à 200 x g pour recueillir le culot cellulaire. Resuspendre le culot dans 500 µL de milieu et aller de l’avant pour placer les cellules dans les fioles.
      Remarque : Exemples d’analyses à réaliser avec des cellules : 1) Reverse transcription PCR (RT-PCR) pour analyser l’expression des gènes ; 2) Western blot pour évaluer l’expression de la protéine ; 3) analyse en cytométrie en flux afin de quantifier le nombre de cellules progénitrices neurales et des protéines d’intérêt ; 4) immunofluorescence pour analyser l’expression des protéines et la localisation.
  3. Ensemencement des astrocytes
    1. après avoir traité les astrocytes primaires avec la trypsine (voir 4.2), collecter 100 μl de la suspension de cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL et ajouter 100 μL de 0,5 % le bleu trypan.
    2. Ajouter 10 μL de la suspension recueillie au trypan blue à l’hémocytomètre et compter toutes les cellules qui sont viables.
    3. Utiliser les formules à l’étape 3.3 pour calculer la densité des cellules avant de préparer les erlenmeyers.
    4. Préparer le puits multiples plats en ajoutant un stérile, poly-D-Lysine enduite lamelle dans chaque puits. Pipetter 50 000 cellules et remplir le reste du volume dans chaque plat multipuit avec un milieu frais (environ 2 mL).
    5. Placer les cupules multiples dans l’incubateur de 37 ° c à 5 % de CO 2 et, après 5-7 jours, les astrocytes peuvent croître et couvrent toute la surface des lamelles.

5. Protocole de ministères pour les Astrocytes primaire

  1. les moyenne préparation AMG
    1. supplément Dulbecco ' s modified Eagle ' glucose de s libres moyen avec 3,7 g/L de bicarbonate de sodium et 1 % pénicilline/streptomycine. Voir documentation au tableau 4.
    2. Purge 20 mL du milieu glucose libre par barbotage avec 95 % N 2 / 5 % de CO 2 pendant 10 min à un débit de 15 L/min (indiqué par le débitmètre) en insérant une pipette sérologique pour l’installation de gaz dans le milieu de.
      Remarque : Après avoir purgé le milieu de l’oxygène, ajuster le pH à 7,4 (voir la note sur le point 2.1).
    3. Filtrer le milieu sans glucose purgé à l’aide d’un système de filtre de tube de 50 mL.
      Remarque : Faire un milieu frais AMG pour chaque expérience, bouillonnant avec 95 % N 2 / 5 % de CO 2 avant d’utiliser, pour faire en sorte que les cellules sont exposées à un environnement purgé de l’oxygène.
  2. Procédure expérimentale
    1. à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire, enlevez astrocyte média préalablement préparée lamelles couvre-objet (reportez-vous à l’étape 4.3.5) et laver avec du PBS cellulaire deux fois pour enlever toute glucose sur les cellules.
    2. Ajouter 2 mL de médias AMG pour chaque bien et placez les cupules multiples à l’intérieur de la chambre d’hypoxie avec leurs couvercles OFF
    3. Connecter le mélange gazeux à la vanne d’entrée et laissez la vanne de sortie ouverte. Rincer la chambre avec le mélange de gaz de 95 % N 2 / 5 % CO 2, à 15 L/min pendant 5 min.
    4. Couper l’arrivée de gaz et d’abord fermer la pince sur la valve de sortie, puis fermer la pince sur le tuyau de vanne gaz entrée.
      Remarque : S’assurer il n’y a aucune fuite de gaz en couvrant le sceau de la chambre à l’eau savonneuse. Si le joint est sécurisé, aucune bulle ne devrait former.
    5. Placer la chambre entière dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 ° C pendant 1 h ou 6 h en ministères.
    6. Après que la période d’incubation est terminée, aspirer les médias AMG et soigneusement pipette 2 mL de DMEM complet à chaque 4,67 cm 2 bien pour le normoxique traiter 24 h.

6. Protocole pour la préparation de Immunofluorescence Astrocyte primaire

Remarque : pour évaluer la pureté de l’astrocyte, cellule cérébrale différents types tels que les neurones, la microglie et des oligodendrocytes peuvent être détectées par immunofluorescence à l’aide de marqueurs de cellules différentes. Marqueurs de prolifération, PCNA et l’iodure de propidium (PI) peuvent être utilisés sur primaires astrocytes exposés aux ministères, suivie des conditions normoxiques. Voir des matières Table des matières.

  1. Préparation de l’immunofluorescence
    Remarque : il s’agit d’un protocole général d’immunofluorescence, des modifications peuvent être effectuées pour obtenir un signal optimal (par exemple, les périodes d’incubation plus longues, température d’incubation). Chaque marqueur de tableau 1 peut être utilisé selon le fabricant ' protocole s.
    1. Pour évaluer la viabilité des cellules, les cellules peuvent être incubées pendant 5 min à 37 ° C avec PI (5 µM de DMEM complet) et laver deux fois avec 2 mL de PBS pour 5 min. des cellules qui montrent une coloration PI sont moins viables.
      Remarque : Utiliser les cellules traitées à l’étape 5.2.6.
    2. Pour fixer les cellules après coloration de PI, ajouter 2 mL de formol de 4 % par cm 4,67 2 Eh bien, pendant 20 min à 4 ° c. Pour les échantillons étiquetés avec PCNA, la solution préférée de fixation est méthanol pendant 10 min à 4 ° c.
      Mise en garde : Formol et le méthanol sont toxiques.
      Remarque : Toujours vérifier les protocoles d’anticorps spécifiques de chaque société.
    3. Laver les cellules avec 2 mL de PBS pendant 5 minutes et répétez cette opération 3 fois.
    4. Incuber les cellules en bloquant la solution (surfactant non ionique 0,5 %, 10 % FBS dans du PBS) pendant 30 min à température ambiante avec agitant doucement.
    5. Laver les cellules avec 2 mL de PBS pendant 5 min, à répéter 3 fois au lavage.
    6. Incuber à 4 ° C, pendant la nuit (16 h), avec l’anticorps primaire (PCNA, GFAP) dans une solution de 1 % FBS dans du PBS.
    7. Supprimer la solution de l’anticorps primaire et répétez cette opération 3 fois laver les cellules avec 2 mL de PBS pendant 5 min.
    8. Incuber avec l’anticorps secondaire conjugué avec un fluorophore dans une solution de 1 % FBS dans du PBS, pendant 1 h, à température ambiante.
    9. Laver les cellules avec 2 mL de PBS pendant 5 min, répétez cette opération 3 fois. Ajouter 1 µg/mL de DAPI (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phénylindole) pendant 5 min colorer les noyaux cellulaires.
    10. Laver les cellules avec 2 mL de PBS 5 min, à répéter cette étape deux fois et à garder dans du PBS.
    11. Préparer les lamelles sur une lame de microscope à l’aide du milieu de montage.
  2. Microscope confocal
    1. après avoir configuré le microscope, placez le côté de la lamelle couvre-objet sur la platine du microscope.
    2. En utilisant le logiciel, sélectionnez un faisceau laser à 543nm pour l’anticorps conjugué GFAP-Cy3.

7. Analyse de viabilité de cellules

  1. Trypsinize et de quantifier les astrocytes en suivant les points 4.3 et 4.4.
  2. Ajouter 1 x 10 4 cellules/puits aux plaques de 96 puits et cultivez-les à confluence.
  3. à l’aide de la méthodologie de l’étape 5, exposer cultivées plaques 96 puits à soit normoxique 1J AMG ou 6 h am.
  4. Traitement après AMG, normoxique médias est ajouté à toutes les cellules pendant 24 h et viabilité est mesurée à l’aide de dosage de réactif MTT (utiliser en tant que fabricant ' s instructions indiquent).
  5. D’une solution MTT 5 mg/mL, ajouter 10 % du volume total dans chaque puits et incuber pendant 3 h à 37 ° c avec le réactif MTT.
  6. Supprimer media et remettre en suspension des cristaux à l’aide de sulfoxyde de diméthyle 200 µL. Lire la plaque dans un spectrophotomètre à 570 nm.
    Remarque : Une absorbance une diminution par rapport aux cellules de contrôle fera la corrélation avec moins viabilité.

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Résultats

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Une des principales préoccupations de culture astrocytaires primaire est la présence d’autres cellules comme les neurones, oligodendrocytes, les fibroblastes et des cellules microgliales. Dans la Figure 1, les cellules isolées des cortex de rat avaient milieu change tous les 3 jours et étaient soit non traités ou traités avec ajouté LME pendant 1 h. 24 h plus tard, les cellules ont été immunomarquées pour GFAP et Eosine au DAPI. Cellules non traitées ont mont...

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Discussion

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Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes des cortex de rat. Dans cette méthode, il est essentiel pour diminuer la contamination avec d’autres types cellulaires comme les microglies, oligodendrocytes et fibroblastes. Pour réduire le nombre de cellules microgliales, plusieurs mesures peuvent être prises : changer les médias, orbitale secouant et traitements chimiques. Une fois que la pureté de la culture est confirmée par immunofluorescence à l’aide de marqueurs cellulaires sélectifs ou pour les principaux contaminan...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs veulent remercier Paola López Pieraldi pour l’assistance technique. A.H.M. est reconnaissante pour les subventions 8G12MD007600 et U54-NS083924 pris en charge de cette publication. Nous remercions NIH-NIMHD-G12-MD007583 subvention pour la prise en charge de l’installation. D.E.R.A. est reconnaissante de la bourse de recherche fourni par NIHNIGMS-R25GM110513. Nous sommes reconnaissants pour l’utilisation de l’espace commun d’Instrumentation et de l’aide du Dr Priscila Sanabria pour l’utilisation de la facilité d’imagerie optique du programme RCMI par grant G12MD007583. En outre, nous tenons à remercier Jose Padilla pour son rôle remarquable dans le tournage et le montage du protocole visuel.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Instruments pour la chirurgie - Étape 1
Ciseaux opératoires 5.5"Roboz CompanyRS-6812Outils utilisés pour décapiter les rats.
Pince incurvée 7"   ;Roboz CompanyRS-5271Maintient la peau du rat pendant que le crâne est retiré.
Ciseaux de micro-dissection 4"   ;Roboz CompanyRS-5882Coupe à la fois la peau et le crâne du rat.
Pince à micro-dissection 4" coudée, fine tranchante  ;Roboz CompanyRS-5095Maintient la peau du rat pendant que le crâne est retiré.
Micro-pince à dissection 4" légèrement incurvée 0.8Roboz CompanyRS-5135Outil utilisé pour séparer les cortex.
Pince à épiler micro-dissectionRoboz CompanyRS-4972Peels méninges cérébrales.
Microscope de dissectionOlympusSZX16Important pour l’élimination de la méninge des cortex.
Préparation DMEM - étape 2
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)GibCo. Entreprise11995-065Soutient la croissance des cellules.
Bicarbonatede sodium Sigma-Aldrich CompanyS7277Supplément pour les milieux de culture cellulaire.
Sérum fœtal bovin (FBS)GibCo. Entreprise10437-010Sérum-supplément pour la culture cellulaire.
Pénicilline-Streptomycine  ;GibCo. Entreprise15140-148Inhibe la croissance des bactéries dans la culture cellulaire.
Système de filtration 1L avec pores de 0,22umCorning431098
Culture d’astrocytes - étape 3
Pipettes sérologiques 5mLVWR89130-896Pour pipeter le DMEM dans des récipients avec des cellules.
Pipettes sérologiques 10mLVWR89130-898Pour pipeter le DMEM vers des récipients avec des cellules.
Pipettes sérologiques 25mLVWR89130-900Pour pipeter DMEM vers des récipients avec des cellules.
Centrifugeuse tube conique 15mLSanta Cruz Biotechnologysc-200250
Tube Safe-lock 1.5mLEppendorf022363204
Barrier Tips 200 uLSanta Cruz Biotechnologysc-201725
Barrier Tips 1 mLSanta Cruz Biotechnologysc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"VWR14220-048
Boîtes de Pétri de 60 mmFalcon351007
Compresses de gaze stérilesHoneywell Safety89133-086
Stomacher 80 BiomasterSewar Lab System030010019Triturer le tissu cérébral.
Stomacher 80 Blender Sacs stérilesSewar Lab SystemBA6040Sac stérile pour l’homogénéisateur de cellules stomacher.
Bécher 400mLPyrex1000
Tamis stérile de dissociation cellulaire, maille #60  ;Sigma-Aldrich CompanyS1020Pour obtenir une suspension unicellulaire uniforme.
Tamis stérile à dissociation cellulaire, maille #100Sigma-Aldrich CompanyS3895Pour obtenir une suspension unicellulaire uniforme.
Microscope à phase inverséeNikonEclypse Ti-SVérifiez que les cellules ne sont pas contaminées ou qu’une croissance cellulaire anormale n’est pas observée.
Fioles stériles de 75 cm2Falcon353136
Plaque multi-puitsFalcon353046
Micro verres (lamelles), 18 mm, rondsVWR48380-046
Hémacytomètre Bright-LineSigma-Aldrich CompanyZ359629
Pipettes PasteurFisher Scientific13-678-20D
Alcool éthylique  ;Sigma-Aldrich CompanyE7023
Chlorhydrate d’ester méthylique de L-leucine 98 % (LME)Sigma-Aldrich CompanyL1002Favorise l’élimination des cellules microgliales dans la culture primaire de l’astrocyte cortical.
Cytosine &beta ;-D-arabinofuranoside (Ara-C)Sigma-Aldrich CompanyC1768
Poly-D-Lysine Hydrobromure, mol weight 70,000-150,000Sigma-Aldrich CompanyP0899
Trypsine/EDTAGibCo. Entreprise15400-054
Trypan BlueSigma-Aldrich CompanyT8154
Tampon de phosphate salin (PBS) comprimésCalbiochem524650
Eau stérileSigma-Aldrich CompanyW3500
  ; OGD Medium Preparation - étape 5
Centrifugeuse tube conique 50 mLVWR89039-658
Dulbecco' Eagle modifié' s glucose moyennement libreSigma-Aldrich CompanyD5030Soutient la croissance des cellules.
Bicarbonatede sodium Sigma-Aldrich CompanyS7277Supplément pour les milieux de culture cellulaire.
Pénicilline-Streptomycine  ;GibCo. Entreprise15140-148Inhibe la croissance des bactéries dans la culture cellulaire.
200m  ; L-glutamine  ;GibCo. Entreprise25030-081Acide aminé qui complète la croissance des cellules.
Tampon de phospahet salin (PBS) comprimésCalbiochem524650
Système de filtration 50 ml avec pore de 0,22 umCorning430320
Centrifugeuse à tube conique 50 mLVWR89039-658
Débitmètre simple  ;Billups-RothenbergSMF3001Mesurer le débit de gaz dans la purge d’oxygène.
Chambre d’incubation d’hypoxie  ;StemCell27310Génère un environnement hypoxique pour la culture cellulaire.
Compteur d’oxygène dissous traçableVWR21800-022
95 % N2/ 5 % CO2Mélange gazeux LindePurge l’environnement de l’oxygène.
<>Immunofluorescence astrocytaire primaire forte - étape 6
Phosphate tampon salin (PBS) comprimésCalbiochem524650
Formaline Solution neutre 10 %Sigma-AldrichHT501128Solution utilisée pour fixer les cellules.
Méthanol  ;FisherA4544Solution utilisée pour fixer les cellules.
Surfactant non ionique (Triton X-100)Sigma-AldrichT8787
Sérum fœtal bovin (FBS)GibCo. Entreprise10437-010Sérum-supplément pour la culture cellulaire.
Signalisation cellulaireanti-NeuN24307Détecte les neurones matures, sert à valider la culture astrocytaire.
Signalisation cellulaireanti-PCNA2586Détecte les cellules proliférantes.
Iodure de propidium (PI)Sigma-Aldrich CompanyP4170Coloration par apoptose.
Anti-Olig1AbcamAB68105Détecte les oligodendrocytes matures.
Anti-Iba1+Wako016-20001Détecte les cellules microgliales.
Anti-GFAP conjugué à Cy3  ;Sigma-Aldrich CompanyC9205Détecte les astrocytes réactifs dans les cellules traitées.
Alexa Fluor 488Sonde moléculaire Life TechnologyA1101Anticorps secondaire anti-souris.
Alexa Fluor 555Sonde moléculaire Life TechnologyA21428Anticorps secondaire anti-lapin.
4',6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI)Sigma-Aldrich CompanyD9542Coloration nucléaire.
Microscope confocalOlympus

Références

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Mots-clés

Isolement d astrocytesprivation d oxyg ne et de glucoseculture primaire d astrocytesimmunofluorescence GFAPessai de prolif ration PCNAcortex de rat n onataldissociation tissulairechambre d hypoxieprolif ration cellulaireastrocytes r actifs

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