Article de méthode

Analyse des protéines Cap-liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques de l'oxygène

DOI :

10.3791/55112

⸱

28 décembre 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons des protocoles de culture de cellules humaines pour analyser les facteurs d’initiation de la traduction qui se lient à la coiffe 5' de l’ARNm dans des conditions physiologiques d’oxygène. Cette méthode utilise un analogue du chapeau m7GTP lié à l’agarose et convient pour étudier les facteurs de liaison au chapeau et leurs partenaires en interaction.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le contrôle traductionnel est un point central de la régulation des gènes, en particulier pendant les périodes de stress cellulaire. La traduction dépendante de la coiffe via le complexe eIF4F est de loin la voie la plus courante pour initier la synthèse des protéines dans les cellules eucaryotes, mais des variations spécifiques au stress de ce complexe émergent maintenant. La purification des protéines de liaison à la coiffe avec une résine d’affinité composée de m7GTP liée à l’agarose (un analogue de la coiffe de l’ARNm 5') est un outil utile pour identifier les facteurs impliqués dans la régulation de l’initiation de la traduction. L’hypoxie (faible teneur en oxygène) est un stress cellulaire rencontré au cours du développement fœtal et de la progression tumorale, et dépend fortement de la régulation de la traduction. De plus, il a été récemment rapporté que les organes adultes humains ont une teneur en oxygène plus faible (physioxie 1-9 % d’oxygène) qui est plus proche de l’hypoxie que l’air ambiant où les cellules sont régulièrement cultivées. Avec la caractérisation en cours d’un complexe hypoxique eIF4F (eIF4FH), on s’intéresse de plus en plus à la compréhension de l’initiation de la traduction dépendante de l’oxygène par le biais de la coiffe de l’ARNm 5'. Nous avons récemment mis au point une méthode de culture de cellules humaines pour analyser les protéines de liaison à la coiffe qui sont régulées par la disponibilité de l’oxygène. Ce protocole met l’accent sur la culture cellulaire et la lyse dans un poste de travail d’hypoxie afin d’éliminer l’exposition à l’oxygène. Les cellules doivent être incubées pendant au moins 24 heures pour que le milieu liquide s’équilibre avec l’atmosphère du poste de travail. Pour éviter cette limitation, des milieux préconditionnés (désoxygénés) peuvent être ajoutés aux cellules si des points temporels plus courts sont nécessaires. Certaines protéines de liaison à la coiffe nécessitent des interactions avec une deuxième base ou peuvent hydrolyser le GTP m7, par conséquent, certains interacteurs de la coiffe peuvent être manqués dans le processus de purification. Des analogues de chapeau liés à l’agarose peuvent être substitués dans ce protocole. Cette méthode permet à l’utilisateur d’identifier de nouveaux facteurs de traduction régulés par l’oxygène impliqués dans la traduction dépendante de la coiffe.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Contrôle translationnelle émerge comme une étape tout aussi important de la régulation transcriptionnelle de l'expression génique, en particulier pendant les périodes de stress cellulaire 1. Un point central de contrôle de la traduction est à l'étape de limitation de vitesse d'initiation où les premières étapes de la synthèse des protéines impliquent la liaison de la facteur d'initiation eucaryote 4E (eIF4E) à la 7-méthylguanosine (m 7 GTP) coiffe 5 'des ARNm 2 . eIF4E fait partie d'un complexe trimère nommé eIF4F qui comprend eIF4A, un ARN hélicase et eIF4G, une protéine d'échafaudage nécessaire pour le recrutement d'autres facteurs de traduction et les 40S ribosome 3. Dans des conditions physiologiques normales, la grande majorité des ARNm sont traduits par un mécanisme de cap-dépendante, mais sous des périodes de stress cellulaire environ 10% des ARNm humains contiennent 5 'UTR qui pourraient permettre la traduction cap-indépendante intiation 1,4. Traduction de Cap-dépendante a été synonyme historiquementous avec eIF4F, cependant, des variations spécifiques au stress de eIF4F sont devenus un sujet tendance 5-8.

Diverses contraintes cellulaires provoquent l'activité eIF4E à être réprimée par la cible mammalienne de la rapamycine complexe 1 (mTORC1). Cette kinase devient douteux sous contrainte, ce qui se traduit par l'augmentation de l'activité de l'un de ses objectifs, la protéine 4E-liaison (4E-BP). Non-phosphorylée 4E-BP se lie à eIF4E et bloque sa capacité à interagir avec eIF4G provoquant la répression de la traduction cap-dépendante 9,10. Fait intéressant, un homologue de eIF4E nommé eIF4E2 (ou 4EHP) a une affinité beaucoup plus faible pour les 4E-BP 11, peut - être ce qui lui permet d'échapper au stress médiée par la répression. En effet, tout d' abord caractérisé comme répresseur de la traduction en raison de son manque d'interaction avec eIF4G 12, eIF4E2 initie la traduction de centaines d'ARNm qui contiennent des éléments de réponse à l'hypoxie d'ARN dans les 3 'UTR lors d'un stress hypoxique 6,13. Cette i d'activations obtenus par des interactions avec eIF4G3, l' ARN de liaison aux protéines motif 4 et le facteur inductible par l'hypoxie (HIF) , 2α pour constituer un complexe eIF4F hypoxique ou eIF4F H 6,13. En tant que répresseur dans des conditions normales, eIF4E2 se lie avec GIGYF2 et 14 ZNF598. Ces complexes ont été, en partie, identifiés par m 7 résines GTP d'affinité Agarose liés. Cette méthode classique 15 est standard dans le domaine de la traduction et les dosages meilleur et le plus couramment utilisé la technique pour isoler les complexes de plafonnement contraignant pull down et in vitro de liaison 16-19. Comme le mécanisme de traduction cap-dépendante est en train de devenir flexible et adaptable avec des parties inter-changer 6-8,13, cette méthode est un outil puissant pour identifier rapidement de nouvelles protéines cap de liaison impliqués dans la réponse au stress. Par ailleurs, les variations de eIF4F pourraient avoir de vastes répercussions que plusieurs systèmes modèles eucaryotes semblent utiliser un homologue eIF4E2 pour les réponses de stress tellescomme A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, et C. elegans 23.

Les preuves suggèrent que les variations de eIF4F peuvent ne pas être strictement limitées aux conditions de stress, mais être impliqués dans la physiologie normale 24. L'apport d'oxygène aux tissus (au niveau des extrémités des capillaires) ou dans les tissus (mesurée par microélectrodes) varie de 2 à 6% dans le cerveau 25, 3-12% dans les poumons 26, 3,5-6% dans l'intestin 27, 4% le foie 28, 7-12% dans le rein 29, 4% dans le muscle 30, et 6-7% dans la moelle osseuse 31. Les cellules et les mitochondries contiennent moins de 1,3% d' oxygène 32. Ces valeurs sont beaucoup plus proches de l'hypoxie que l'air ambiant où les cellules sont cultivées en routine. Cela donne à penser que ce qui était auparavant considéré comme des processus cellulaires spécifiques à l'hypoxie peuvent être pertinents dans un contexte physiologique. Il est intéressant de eIF4F et eIF4F H participer activement à l'initiation de la traduction des piscines ou des classes d'ARNm distincts dans plusieurs lignées cellulaires humaines différentes exposées à l' oxygène physiologique ou "physioxia" 24. Le manque d' oxygène entraîne également le développement du fœtus 33 et les cellules ont généralement des taux plus élevés de prolifération, plus la durée de vie, moins de dommages de l' ADN et moins les réactions de stress général dans physioxia 34. Par conséquent, eIF4F H est probablement un facteur clé dans l'expression de certains gènes dans des conditions physiologiques.

Ici, nous fournissons un protocole aux cellules de culture dans des conditions d'oxygène physiologiques fixes ou dans une gamme fluctuant dynamique qui est probablement plus représentatif de microenvironnements tissulaires. Un avantage de cette méthode est que les cellules sont lysées à l'intérieur du poste de travail de l'hypoxie. Il est pas souvent clairement comment la transition de la culture de cellules hypoxiques à la lyse cellulaire est effectuée dans d'autres protocoles. Les cellules sont souvent d'abord retirés d'un petit incubateur d'hypoxie êtreavant la lyse, mais cette exposition à l' oxygène pourrait affecter les voies biochimiques comme la réponse cellulaire à l' oxygène est rapide (une ou deux minutes) 35. Certaines protéines cap de liaison exigent des interactions avec une seconde base ou peuvent hydrolyser le m 7 GTP, donc certains interacteurs cap peuvent manquer dans le processus de purification. Agarose liée aux analogues de cap enzymatiquement résistant peut être substitué dans ce protocole. Exploration de l'activité et la composition des eIF4F H et d' autres variations de eIF4F par la méthode décrite ici va faire la lumière sur les gènes machineries d'expression complexes que les cellules utilisent dans des conditions physiologiques ou des réactions de stress.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparatifs pour la culture cellulaire

  1. Achetez des stocks disponibles dans le commerce de cellules humaines.
    NOTE: Ce protocole utilise le carcinome HCT116 colorectal et des cellules primaires humaines rénaux proximaux tubulaires épithéliales (de HRPTEC).
  2. Faire 500 ml de milieu pour la culture de cellules HCT116: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) / moyenne élevée en glucose supplémenté avec 7,5% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S).
  3. Faire 500 ml de milieu de culture de HRPTEC: milieu cellulaire épithéliale supplémenté avec 5% de FBS, supplément de croissance de cellules épithéliales de 1%, et 1% P / S.
  4. Préparer 500 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS): NaCl 140 mM, KCl 3 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 15 mM de KH 2 PO 4. Ajuster le pH à 7,4 et stériliser par autoclavage pendant 40 min à 121 ° C.

2. Ouverture de la cellule en culture

  1. Aspirer soigneusement le moyen d'un plat de confluentes 80-90% sans déranger til cellules.
  2. Aliquotes 3-5 ml de PBS 1x par boîte de culture, roche doucement chaque flacon pour recouvrir la surface du plat, et soigneusement Aspirer le PBS 1x. Répétez l'opération pour un second lavage 1x PBS.
  3. Aliquoter 3 ml de 0,05% de trypsine-acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans chaque boîte de culture et balancer doucement pour bien enrober les cellules avec de la trypsine-EDTA. Incuber à 37 ° C pendant 2-3 min.
  4. Transférer les cellules détachées dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et centrifuger à 4000 g pendant 90 secondes.
  5. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de DMEM complet.
  6. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Calculez combien non pyrogènes et de polystyrène 100 mm culture cellulaire plats sont nécessaires pour obtenir une densité d'ensemencement initiale d'environ 2,500-5,000 cellules par cm 2.
  7. milieu complet Préchauffer culture cellulaire fait dans les étapes 1.2 ou 1.3 dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30-45 min.
  8. Décontaminer la bouteille moyenne et flacon de cellules avec 70% d'éthanol. De ce point avant toutles opérations doivent être effectuées de manière aseptique.
  9. Aliquote 6 ml de DMEM complet en autant de boîtes de culture cellulaire de 100 mm requis pour utiliser la totalité du volume de cellules congelées à l'intérieur de la densité d'ensemencement mentionnée à l'étape 2.6.
  10. Transférer le volume de la suspension cellulaire calculée à l'étape 2.6 à chacune des boîtes de culture de 100 mm. Rock chaque plaque à la main pour répartir uniformément les cellules au-dessus de la surface de la plaque.
  11. Placer la boîte de 100 mm ensemencé de culture de cellules dans l'incubateur à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Laisser les cellules incuber au moins 24 heures avant les prochaines étapes.

3. Repiquage

  1. Afficher chaque boîte de culture de cellules sous un microscope pour déterminer le pourcentage de confluence cellulaire (% de cellules couvrant la zone de la cuvette). cellules à l'incubateur et milieu de pré-chaud complet et 1x PBS Retour. Passez à l'étape suivante si les cellules sont 80-100% confluentes.
  2. Aspirer soigneusement le milieu usé sans perturber lecellules dans chaque boîte de culture.
  3. Aliquotes 3-5 ml de PBS 1x par boîte de culture, roche doucement chaque flacon pour recouvrir la surface du plat, et soigneusement Aspirer le PBS 1x. Répétez l'opération pour un second lavage 1x PBS.
  4. Aliquoter 3 ml de 0,05% de trypsine-EDTA dans chaque boîte de culture et balancer doucement pour bien enrober les cellules avec de la trypsine-EDTA. Incuber à 37 ° C pendant 2-3 min.
  5. Au cours de cette incubation, la fraction aliquote de 10 ml de milieu complet en autant de boîtes de culture sont nécessaires pour obtenir une densité cellulaire de 2,500-5,000 cellules par cm 2.
  6. Lorsque les cellules ont détaché de la plaque, ajouter rapidement 3 ml d'inhibiteur de trypsine 1x défini et agiter doucement le plat pendant 1 min pour assurer que tous les trypsine-EDTA a été neutralisé.
  7. Transférer les cellules individuelles dans un 15 ml tube de centrifugation stérile et mettre de côté. Ajouter 3 ml de 1 x PBS à la boîte pour recueillir toutes les cellules restantes, et que le transfert à la même 15 ml tube de centrifugation.
  8. Sédimenter les cellules par centrifugation à 150 x gpendant 5 min.
  9. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 3 ml de milieu complet.
  10. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et épépiner des boîtes de culture de 150 mm contenant 15 ml de milieu complet pour obtenir une densité cellulaire de 2,500-5,000 cellules par cm 2. Utilisez deux 150 mm pour chaque test de plafonnement contraignant.
    REMARQUE: la diffusion d'oxygène vers les cellules par l' intermédiaire des milieux liquides dépendent du volume 36. Il est recommandé de maintenir le volume des médias compatibles entre les expériences si les cellules adhérentes ou des cellules en suspension sont utilisés. Les médias peuvent être pré-conditionnés (incubé dans le poste de travail pendant 24 heures comme indiqué dans la discussion) afin d'éviter ces variabilités de diffusion.
  11. Placez les plats ensemencées-culture dans l'incubateur à 37 ° C dans une atmosphère de CO 2 de 5%. Laisser les cellules incuber au moins 24 heures avant de procéder aux étapes suivantes.

4. Physioxic exposition

  1. Afficher les cellules au microscope. Pour best les résultats, veiller à ce que les cellules sont 70-80% confluentes pour une exposition de 24 heures, 50-60% confluentes pour une exposition de 48 heures, et 40-50% confluentes pour une exposition de 72 h.
  2. Placer les cellules dans une station de travail à l'hypoxie pendant le temps désiré (24, 48 ou 72 heures en fonction de l'expérience).
  3. Réglez le poste de travail à l'physioxia approprié.
    NOTE: Par exemple, un réglage de 3% O 2 serait accompagnée de 5% de CO 2 et 92% de N 2.
    NOTE: Si les fluctuations d'oxygène dans une plage dynamique sont souhaités sur un calendrier précis, le programme du calendrier dans l'instrument ou d'ajuster manuellement les réglages d'oxygène aux intervalles souhaités.
  4. Régler le taux d'humidité de 60%. L'atmosphère du poste de travail est très sec néanmoins, et les médias sera sensiblement s'évaporer pendant de longues expériences (> 48 h). Gardez une réserve de médias dans un flacon de culture cellulaire à l'intérieur du poste de travail (de sorte que le support est équilibré avec l'atmosphère du poste de travail) pour reconstituer les médias dans le dis de culture cellulaireil est.
    REMARQUE: Toute solution qui va interagir avec les cellules avant la lyse (tel que du PBS et trypsine-EDTA) doivent être conditionnées pendant 24 h avant d'être utilisé dans le poste de travail hypoxie de sorte que l'oxygène dissous équilibre avec l'oxygène de l' air 36.
  5. Gardez les cellules dans le poste de travail jusqu'à ce que la lyse.

5. Tampons Préparation pour Assay Cap-contraignant

  1. Préparer 1x Tris-solution saline tamponnée (TBS).
    1. Dans 800 ml de dH 2 O, dissoudre 8,76 g de NaCl et 6,05 g de Tris base.
    2. Amener la solution à un pH final de 7,4 avec 1 M de HCl.
    3. Amener le volume final à 1 L en utilisant dH 2 O.
  2. Préparer un tampon de lyse non dénaturante. Préparer un tampon de lyse le jour du test de plafonnement contraignant. Faire un tampon de lyse supplémentaire pour laver les billes d'agarose vierges et le GTP agarose γ-aminophényl-m 7 billes C10 liées (étapes 7.9 et 7.13).
    1. Dans 7 ml de dH 2 O, ajouter 160 pi 5 M NaCll, NaF 160 mM , 1 ul de Tris-HCl pH 7,4, 40 ul de 200, 40 pi de 1 M de MgCl2, et orthovanadate de sodium , 40 ul de 1 mM.
    2. Ajouter 40 ul de la solution d'Igepal à 7 ml. Coupez la pointe de la pipette pour aider à récupérer Igepal car il est extrêmement visqueux.
    3. Mélanger par pipetage vers le haut et vers le bas, ou vortex, la solution de 7 ml jusqu'à ce que tous les Igepal a été dissous.
    4. Relevez le volume final de la solution à 8 ml et garder sur la glace.
  3. Préparer 4x dodécylsulfate de sodium (SDS) -PAGE Sample Buffer.
    1. Dans un bécher, mélanger 16 ml de 1 M de Tris-HCl, pH 6,8, 12,64 ml de glycerol, et 8 ml de dithiothréitol (DTT).
    2. Ajouter 3,2 g de SDS et 0,16 g de bleu de bromophénol. Laisser la poudre à dissoudre entièrement par mélange avec un barreau d'agitation magnétique.
    3. Aliquoter dans 1,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C.

6. Lyse cellulaire

  1. Préparer un tampon de lyse non dénaturant et garder sur la glace le jour de the cap-essai de liaison.
  2. Préchauffer PBS 1x et de la trypsine dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 min.
  3. Aliquoter 980 pi de tampon de lyse dans un tube de 1,5 ml pour chaque test de plafonnement de liaison étant effectuées.
  4. Ajouter 10 ul d'acide 4- (2-aminoéthyl) le chlorhydrate de fluorure de benzènesulfonyle et 10 ul d'inhibiteur de protéase de cocktail 100x 980 ul de tampon de lyse. Gardez sur la glace.
  5. Jeter les médias de chaque plat de 150 mm dans un conteneur de déchets à l'intérieur du poste de travail de l'hypoxie.
  6. Laver les cellules avec 3-4 ml d'eau tiède 1x PBS et jeter tout le liquide.
  7. Ajouter 1 ml de chaud 0,05% de trypsine-EDTA à chaque plat et laisser reposer pendant 2 minutes ou jusqu'à ce que les cellules ne sont plus respectées à la plaque.
  8. En utilisant une pipette, transférer les cellules d'une plaque à un tube de 1,5 ml. Répéter au besoin pour que chaque plaque de cellules est transféré dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse séparé.
  9. Centrifuger les tubes de 1,5 ml de microcentrifugation à 6000 xg pendant 90 sec to sédimenter les cellules.
  10. Aspirer la trypsine en utilisant une pipette sans perturber le culot. Si le culot est perturbé, re-centrifugeuse tube de microcentrifugation de 1,5 ml à 6000 xg pendant 90 sec.
  11. Laver les cellules avec du PBS chaud 1x par pipetage 200 pi de PBS dans le tube juste au-dessus du culot. Re-centrifugeuse si le culot est perturbé.
  12. Aspirer le PBS sans perturber le culot.
  13. Introduire à la pipette 500 ul de la solution de 1 ml a préparé du tampon de lyse sur la première pastille cellulaire. Remettre en suspension le culot entièrement par pipetage vers le haut et vers le bas.
  14. Combiner les cellules remises en suspension avec le deuxième culot cellulaire et remettre en suspension le culot seconde par pipetage vers le haut et vers le bas. Répétez ce processus jusqu'à ce que tous les granulés ont été combinés et remis en suspension pour chaque échantillon.
  15. Combinez le lysat avec les 500 ul restants de tampon de lyse dans un tube de 1,5 ml.
  16. Retirer les échantillons du poste de travail de l'hypoxie.
    Remarque: après l'addition du tampon de lyse, d'unoutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans l'air ambiant du poste de travail est réglé à une hypoxie 37 ° C et les étapes suivantes doivent être effectuées à froid (4 ° C ou sur de la glace).
  17. Lyser les cellules en utilisant une agitation douce en faisant tourner les échantillons à 4 ° C pendant 1,5 à 2 heures.
  18. Centrifuger les cellules lysées à 12 000 xg pendant 15 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires.
  19. Transférer le lysat dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml et jeter le culot.
  20. Sous réserve d'une partie (5-10%) du produit surnageant à utiliser comme toute une commande d'entrée de lysat cellulaire pour une future analyse Western Blot.

7. Cap contraignant Assay

  1. Pour chaque échantillon, transférer 50 pl de suspension de l'ébauche d' agarose de commande de bourrelet et 50 ul de la suspension de billes γ-aminophényl-m- 7 GTP d' agarose-C10 lié à séparer 1,5 ml microtubes. Utilisez des ciseaux pour enlever la pointe de la pipette pour faciliter la collecte de la suspension de billes.
  2. Pellet les perles by centrifuger la suspension à 500 g pendant 30 secondes.
  3. Retirer le surnageant avec précaution et remettre en suspension les billes dans 500 pi de TBS.
  4. Répétez les étapes 7.2 et 7.3. Pellet les perles à 500 xg pendant 30 sec et retirer le surnageant.
  5. Transférer le surnageant contenant le lysat de l'étape 6.19 au tube de 1,5 ml contenant les billes blanches d'agarose.
    REMARQUE: Les billes d'agarose vides agissent comme une étape de pré-compensation pour éliminer les protéines du lysat, qui interagissent de manière non spécifique avec le bourrelet.
  6. Incuber pendant 10 min à 4 ° C sous agitation douce.
  7. Sédimenter les billes vides d'agarose par centrifugation à 500 g pendant 30 secondes.
  8. Transférer le lysat au tube de 1,5 ml contenant les γ-aminophényl-m 7 GTP agarose perles de C10 liées.
  9. Laver les billes d'agarose vides en remettant en suspension les billes dans 500 pl de tampon de lyse, pastillage les billes par centrifugation à 500 g pendant 30 secondes, et à rejeter le supernatante. Répétez cette opération quatre fois pour un total de cinq lavages.
  10. Resuspendre les billes d'agarose vierges dans un tampon d'échantillon 1x SDS-PAGE, et faire bouillir les billes pendant 90 secondes à 95 ° C. Conserver à -20 ° C pour une analyse future Western blot pour observer si la protéine d'intérêt se lie non spécifiquement à la perle.
  11. Incuber le lysat avec les perles γ-aminophényl-m 7 GTP agarose C10 liés avec agitation douce pendant 1 heure à 4 ° C pour capturer protéines cap contraignant.
  12. Sédimenter les γ-amino-phényl-7 m GTP des billes d' agarose-C10 lié par centrifugation à 500 g pendant 30 secondes. Jeter le surnageant.
  13. Laver les γ-aminophényl-m 7 GTP agarose perles de C10 lié par étape 7.9 répéter.
  14. Remettre en suspension les billes dans 600 pl de tampon de lyse.
  15. Ajouter GTP à une concentration finale de 1 mM.
  16. Incuber les γ-aminophényl-m 7 GTP agarose perles de C10 liées + 1 mM GTP avec agitation douce pendant 1 heure à 4 ° C. Note: Cettese dissocier des protéines qui interagissent de manière non spécifique avec m 7 GTP (ie, également interagir avec GTP non méthylé).
  17. Sédimenter les γ-amino-phényl-7 m GTP des billes d' agarose-C10 lié par centrifugation à 500 g pendant 30 secondes.
  18. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 200 pi de 4x tampon échantillon SDS-PAGE (50 mM de Tris-HCl, 100 mM de DTT, 2% de SDS, 0,1% de bleu de bromophénol, et 10% de glycérol). Conserver l'échantillon de contrôle de GTP à -20 ° C pour une future analyse western blot 37. Laver les billes par étape 7.9 répéter.
  19. Resuspendre les billes dans 1 x tampon échantillon SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% de SDS, 0,1% de bleu de bromophénol et 10% de glycerol) et faire bouillir à 95 ° C pendant 90 secondes. Rangez la m fraction 7 GTP à -20 ° C pour une future analyse western blot 37.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse de capacité Cap-contraignant en réponse à l' oxygène de eIF4E et eIF4E2 dans un m 7 GTP Affinity Colonne

Les figures 1 et 2 représentent western blots de type m 7 GTP purification par affinité de deux protéines majeures de plafonnement contraignant en réponse aux fluctuations de l' oxygène dans les deux lignées de cellules humaines: cellules primaires humaines rénaux...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'analyse des protéines cap de liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques d'oxygène peut permettre l'identification de nouveaux facteurs initiation de la traduction de l'oxygène réglementé. L'affinité de ces facteurs pour le coiffe 5 'd'ARNm ou d' autres protéines cap-associé peut être mesurée par la force de leur association à m 7 GTP lié perles Agarose. Une limitation de cette technique est qu'elle mesure le potentiel de la coiffe liaison ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada et le ministère de la Recherche et de l’Innovation de l’Ontario.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
&gamma ;-aminophényl-m7GTP Agarose C10 billes liées JenaBioscienceAC-1555Agarose liée m7GTP
Antenne de cultureCorning87722210 cm Boîte de culture 150
mmThermofisher13018315 cm Boîte de
culture AEBSFChlorhydrate ACROS OrganicsA0356829AEBSF
Perles d’agaroseJena Bioscience  ;AC-0015Contrôle des billes d’agarose
Bromophenol BlueFisherBP112-25Composant du tampon de chargement SDS-PAGE
1,5 ml Tubes à centrifugerFroggaBio1210-00SUtilisé pour centrifuger de petits volumes
15 ml Tubes à centrifuger coniquesFisher1495970CUtilisé dans la culture de cellules primaires
Inhibiteur de trypsine définiFisherR007100DTI
DithiothreitolFisherBP172-25DTT
Milieu cellulaire épithélial (kit complet)ScienCell4101Comprend des suppléments de sérum et de facteurs de croissance)
GlycérolFisherBP229-1Composant du tampon de chargement SDS-PAGE
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 mlJena Bioscience272076-0251MGTP
HCT116 carcinome colorectalATCCCCL-247Lignée cellulaire cancéreuse humaine
Cellules épithéliales tubulaires proximales rénales humainesATCCPCS-400-010HRPTEC
Hyclone DMEM/High GlucoseGE Life SciencesSH30022.01Milieux standard pour la culture cellulaire humaine
Solution de pénicilline-streptomycineGE Life SciencesSV30010Composant antibiotique du DMEM
H35 HypOxystationHypoxygenN/APoste de travail pour l’hypoxie
Igepal CA-630MP Biomedicals2198596Composant détergent du tampon de lyse
Phosphate monopotassiqueFisherP288-500KH2PO4
Chlorure de potassiumFisherP217-500KCl
Chlorure de magnésiumFisherM33-500MgCl2
Chlorure de sodiumFisherBP358-10NaCl
Fluorure de sodiumFisher5299-100NaF (composant inhibiteur de la phosphatase du tampon de lyse)
Phosphate disodiqueFisher5369-500Na2HPO4
Premium Sérum de veau fœtalSeradigm1500-500FBS
Cocktail inhibiteur de protéase (100x)Signalisation cellulaire58715Composant du tampon de lyse
Dodécylsulfate de sodiumFisherBP166-100SDS
Orthovanadate de sodiumSigma56508Na3VO4
Tris BaseFisherBP152-5Composant des tampons
0,05 % Trypsine-EDTA (1x)Life Technologies2500-067Trypsine utilisée pour détacher les cellules adhérentes

Références

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Oxygen RegulationHypoxia Workstationm7GTP Agarose BeadsAffinity PurificationWestern Blot AnalysisCell Lysis ProtocolTranslation Initiation FactorsGTP Wash Specificity

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