L'échelle du laboratoire: Production et purification d'un anticorps thérapeutique

Résumé

Ce protocole décrit la production d'un anticorps thérapeutique dans un système d'expression mammalien. Les procédés décrits comprennent la préparation d'ADN vecteur, la transfection stable et l'adaptation d'une lignée de cellules embryonnaires de rein 293 humaine sans sérum, mis en place des cultures à grande échelle et la purification par chromatographie d'affinité.

Résumé

Assurer la production réussie d’un anticorps thérapeutique commence dès le début du processus de développement. La première étape est l’expression vectorielle des gènes de l’anticorps, suivie d’une transfection stable dans une lignée cellulaire appropriée. Les clones stables sont soumis à un criblage afin de sélectionner les clones présentant les caractéristiques de production et de croissance souhaitées. Il s’agit d’une étape cruciale, bien que chronophage, dans le processus. Ce protocole prend en compte la sélection des vecteurs et l’approvisionnement des séquences d’anticorps pour l’expression d’un anticorps thérapeutique. Les méthodes décrivent la préparation de l’ADN vecteur pour la transfection stable d’une variante en suspension de la lignée cellulaire du rein embryonnaire humain 293 (HEK-293), à l’aide de polyéthylénimine (PEI). Les cellules sont transfectées en tant que cellules adhérentes dans des milieux contenant du sérum pour maximiser l’efficacité de la transfection, puis adaptées à des conditions sans sérum. La production à grande échelle, configurée sous forme de cultures par lots, est utilisée pour produire des protéines d’anticorps qui sont purifiées par chromatographie d’affinité à l’aide d’un instrument automatisé de chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC). Les rendements en anticorps produits par cette méthode peuvent fournir suffisamment de protéines pour commencer la caractérisation initiale de l’anticorps. Il peut s’agir de la mise au point d’essais in vitro ou d’une caractérisation physicochimique pour faciliter la tâche fastidieuse du criblage clonal des principaux candidats. Cette méthode peut être transférable au développement d’un système d’expression pour la production d’anticorps biosimilaires.

Introduction

Le succès des anticorps thérapeutiques continue à conduire des investissements importants dans le développement d'anticorps comme une vague de produits thérapeutiques de prochaine génération commence. Le marché des anticorps à refaçonné par des fragments d'anticorps ^1, conjugués anticorps-médicament ^2, des anticorps bispécifiques ³ et des anticorps modifiés avec des propriétés favorables ^4. Une autre classe gagne intérêt pharmaceutique sont biosimilaires. anticorps biosimilaires sont «très similaires» répliquer les produits d'un anticorps thérapeutique qui a dé....

Protocole

NOTE: Un vecteur d'expression de mammifère approprié doit être utilisé pour ce protocole. Ici, une construction unique contenant deux cassettes d'expression est utilisée (c. -à- expression lourde et légère chaîne est entraînée par des promoteurs séparés). chaînes lourdes et légères trastuzumab ont déjà été clones dans le vecteur. Ce vecteur est un cadeau de Andrew Beavil, obtenu grâce à un bénéfice non-plasmide référentiel ^13.

1. Recovery and Scale-up de l'ADN vecteur

NOTE: L' ADN du vecteur a été reçu comme une culture stab agar mou dans la souche Escherichia coli XL-1 Blue; vecteur porte résist....

Résultats

Production stable de trastuzumab par transfectées cellules HEK-293 a été confirmée à l' aide de bio-couche interférométrie (BLI) tel que présenté dans la figure 1. Une courbe standard d' IgG a été générée en mesurant le taux de liaison entre un niveau d'anticorps IgG et la protéine A biocapteur (figure 1A). L'échantillon de surnageant brut a été mesuré de manière similaire, alors que sa concentration interpolée à partir de la courbe étalo.......

Discussion

Ce protocole détaille la transfection, l'expression stable et la purification d'un anticorps thérapeutique dans les cellules HEK-293. L'expression stable des gènes d'anticorps est la première étape dans la génération d'une lignée cellulaire produisant des anticorps pour le développement et la fabrication d'un anticorps thérapeutique. Alors ovaire de hamster chinois (CHO) restent la plate-forme d'expression de choix pour les protéines thérapeutiques, la lignée cellulaire HEK-293 gagne en impor.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Série de vecteurs pFUSE	InvivoGen	N/A	Gènes d’anticorps lourds et légers exprimés dans des vecteurs distincts qui nécessitent une co-transfection.
Série vectorielle mAbXpress	ACYTE Biotech Pty Ltd.		Gènes d’anticorps lourds et légers exprimés dans des vecteurs distincts qui nécessitent une co-transfection. Renvoi : Jones, M. L. et al. Procédé de reformatage rapide, indépendant de la ligature, d’anticorps monoclonaux recombinants. J Méthodes immunitaires. 354 (1-2), 85-90, doi :10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
Vecteur pVITRO1	N/A	N/A	Les gènes des anticorps lourds et légers sont chacun pilotés par un promoteur distinct dans un seul vecteur. Voir : Dodev, T. S. et al. Une trousse d’outils pour le clonage rapide et l’expression d’anticorps recombinants. Sci Rep. 4 5885, doi :10.1038/srep05885, (2014).
Vecteur	Lonza		avec des gènes d’anticorps lourds et légers co-exprimés et traduits en transcrit unique.
Vecteur multi-cistronic série 1	N/A	N/A	Vecteur multi-cistronique avec des gènes d’anticorps lourds et légers co-exprimés et traduits sous forme de transcrit unique. Se référer à : Li, J. et al. Une étude comparative de différents modèles de vecteurs pour l’expression chez les mammifères d’anticorps IgG recombinants. J Méthodes immunitaires. 318 (1-2), 113-124, doi :10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Vecteur multi-cistronic série 2	N/A	N/A	Vecteur multi-cistronique avec des gènes d’anticorps lourds et légers co-exprimés et traduits en transcrit unique. Voir : Ho, S. C. et al. Vecteurs tricistroniques médiés par IRES pour améliorer la génération de lignées cellulaires CHO exprimant des anticorps monoclonaux élevés. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi :10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&kappa ;	Addgene	61883	Vecteur d’expression de mammifère contenant des gènes d’anticorps de trastuzumab avec gène de résistance à l’hygromycine ; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&kappa ; était un cadeau d’Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	Jomar Life Research	fas-hg-s	Utilisé pour préparer la gélose LB à faible teneur en sel contenant 75 & micro ; g/ml d’hygromycine.
Fast-Media Hygro TB	Jomar Life Research	fas-hg-l	Utilisé pour préparer un bouillon de TB à faible teneur en sel contenant 75 & micro ; g/ml d’hygromycine.  ;
Glycérol, BioXtra, &ge ; 99 %	Sigma-Aldrich	G6279	Préparer à 80 % avec de l’eau et de l’autoclave. Conserver à température ambiante.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	Astral Scientific	G221020	Plasmid Maxi Prep Kit ; éluer ou remettre en suspension l’ADN dans l’eau (pH 7,0-8,5).
FreeStyle 293-F Cells	Life Technologies	R790-07	HEK-293 : Lignée cellulaire adaptée à la culture en suspension en milieu sans sérum.
FreeStyle 293 Expression Medium	Life Technologies	12338-018	Milieu sans sérum spécialement formulé pour le maintien de la lignée cellulaire 293-F et de l’expression à haute teneur en protéines.
Kolliphor P188	Sigma-Aldrich	K4894	Tensioactif non ionique ; pluronique F-68 ; préparer à 10 % dans l’eau et filtrer-stériliser à l’aide de 0,22 &mu ; Filtre M. Conserver à 4 °C.
DMEM, glycémie élevée  ;	Life Technologies	11995-065
Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur	Life Technologies	10082-147
Polyéthylénimine, linéaire, MW 25,000  ;	Polysciences, Inc.	23966	Préparer à 1 mg/ml dans l’eau. Ajuster à pH 7,0 avec 1 M HCl (la solution devient claire) et filtrer-stériliser avec 0,22 &mu ; Filtre M. Conserver à -80 ° ; C jusqu’à l’utilisation.
OptiPro SFM	Life Technologies	12309-050	Milieu sans sérum formulé par transfection
Hygromycine B Solution	Jomar Life Research	ant-hg-1
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	AJA2225
Tryptone (caséine peptone)	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Préparer à 20 % dans du PBS et filtrer la stérilisation à l’aide de 0,22 &mu ; Filtre M. Conserver à 4 °C.
Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4, 100 ml	Astral Scientific	09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 colonne de 5 ml	Sigma-Aldrich	GE17-0403-01
AKTApurifier 100	GE Healthcare	28406266	Système FPLC automatisé, qui peut inclure une pompe d’échantillonnage P-960 et un collecteur de fractions Frac-920.
Glycine-HCl	Sigma-Aldrich	G2879
Acide citrique, monohydraté	Astral Scientific	BIOC2123
Citrate de sodium, sel trisodique dihydraté.	Astral Scientific	BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9,0	Astral Scientific	BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifuge Filters (30 MWCO)	Merck Millipore	UFC803008/UFC903008	Utilisé pour tamponner, échanger et concentrer les protéines purifiées.
Kit de dosage de l’acide bicinchoninique Pierce (BCA)	Thermo Fisher Scientific	23227
BLItz System	forté ; BIO	45-5000	Instrument utilisé pour les mesures d’interférométrie de biocouche (BLI).
Biocapteurs de protéine A	forté ; BIO	18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37,5:1), solution à 40 %	Astral Scientific	786-502
Persulfate d’ammonium (APS)	Astral Scientific	AM0486
TEMED	Astral Scientific	AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250	Astral Scientific	786-498
Precision Plus Protéine bicolore 1610374			Bio-Rad

multi-cistronique standard