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Article de méthode

Isolation efficace des îlots fonctionnels de néonatales Pancréas souris

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DOI :

10.3791/55160

⸱

6 janvier 2017

 , 
1Department of Cell and Development Biology, Vanderbilt University Medical School

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les îlots intacts de souris néonatales. Pancreata ont été partiellement digéré avec de la collagénase, suivi d'un lavage et cueillette à la main. 20 - 80 amas d'îlots peuvent être obtenus par le pancréas de souris nouveau-nés, qui sont appropriés pour de nombreuses études d'îlots.

Résumé

protocoles îlot-isolement à base Perfusion-de grande pancreata mammifères sont bien établis. De tels protocoles sont facilement réalisées dans de nombreux laboratoires en raison de la grande taille du canal pancréatique qui permet une injection de collagénase prête et la perfusion tissulaire subséquente. En revanche, l'isolement des îlots de la petite pancreata, comme celui des souris néonatales, est difficile parce que la perfusion ne sont pas facilement réalisables dans la petite pancreata. Nous décrivons ici une simple procédure détaillée qui récupère un nombre important d'îlots de souris nouveau-nés avec une aide visuelle. Des pancréas entier fraîchement disséqués ont été digérés avec 0,5 mg / mL de collagénase IV dissous dans une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) à 37 ° C dans des tubes de microcentrifugation. Les tubes ont été exploitées régulièrement pour faciliter la dispersion des tissus. Quand la majeure partie du tissu a été dispersé de petits amas d'environ 1 mm, les lysats ont été lavées trois à quatre fois avec un milieu de culture avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS). grappes Islet,dépourvue de tissus acineuses reconnaissables, peut ensuite être récupéré sous la dissection stéréoscope. Cette méthode récupère 20 - 80 petites et grandes îlots par le pancréas de souris nouveau-né. Ces îlots sont appropriés pour des dosages plus en aval concevables, y compris la sécrétion d'insuline, l'expression génique et la culture. Un exemple de dosage de sécrétion d'insuline est présenté pour valider le processus d'isolement. Le fond génétique et le degré de digestion sont les plus grands facteurs qui déterminent le rendement. Fraîchement solution de collagénase avec une activité élevée est préférable, car elle contribue à l'isolement du système endocrinien exocrine. La présence de cations [calcium (Ca 2+) et le magnésium (Mg 2+)] dans toutes les solutions et de sérum bovin fœtal dans le lavage / media cueillette sont nécessaires pour un bon rendement d'îlots avec intégrité adéquate. Un champ de dissection avec un bon contraste et le grossissement aidera également.

Introduction

L’isolement des îlots pancréatiques purs est essentiel pour le dosage de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) des cellules bêta et pour la transplantation d’îlots de Langerhans à partir de donneurs cadavériques 1-3. Il est également nécessaire d’établir l’expression des gènes endocriniens dans les cellules 4, 5 des îlots. À cette fin, des protocoles détaillés ont été établis pour permettre l’isolement des îlots pancréatiques des grands pancréas (6 et références ci-dessous). Ces méthodes sont basées sur la perfusion enzymatique pour dissocier l’acineux des tissus des îlots, couplée à la séparation par gradient et à la cueillette manuelle. Ainsi, l’isolement des îlots pancréatiques du grand pancréas peut être effectué facilement dans la plupart des laboratoires. D’autre part, il n’existe aucun protocole détaillé étape par étape pour permettre d’isoler les îlots du pancréas qui sont trop petits pour être perfusés.

Il est important d’étudier l’expression des gènes et la fonction des îlots néonatals. Les îlots de nouveau-nés ont des propriétés différentes de celles des adultes en termes de sécrétion d’insuline et de capacité de prolifération 7, 8. Cependant, il est difficile d’isoler les îlots des animaux nouveau-nés, en particulier des souris, en raison de la petite taille du pancréas nouvellement né. La taille empêche le processus de perfusion habituel lorsque la collagénase est injectée à travers le canal pancréatique. En effet, plusieurs articles ont présenté des études dans ce sens, avec des procédures d’isolement enzymatiques ou non enzymatiques 7, 9, 10. Cependant, il n’existe pas de description détaillée du processus d’isolement des îlots à l’aide d’un appareil visuel 7, 9, ce qui rend difficile pour la plupart des chercheurs de réaliser des études similaires.

Nous avons exploré plusieurs conditions différentes qui produisent des îlots de grande qualité à partir de souris néonatales. Nous présentons ici un protocole qui devrait aider les chercheurs à apprendre les détails clés du processus d’isolement des îlots. Ce protocole s’applique au pancréas de souris jusqu’à l’âge de deux semaines, après quoi une perfusion peut être effectuée pour l’isolement de routine des îlots. Les îlots peuvent être directement utilisés pour la sécrétion d’insuline et les tests d’expression génique.

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Protocole

l'utilisation de l'animal suit les procédures spécifiées dans le protocole M / 11/181 approuvé par le Vanderbilt Institutional Animal Care et l'utilisation Comité pour Gu. souris CD1 ou CBA / BL6 ont été achetés auprès de fournisseurs commerciaux et croisées dans l'animalerie Vanderbilt pour obtenir des souris néonatales.

1. Préparation de la souris, Stock Solutions et équipements

  1. Pour la croix de la souris: mettre en place une croix de la souris et enregistrer les dates de colmatage à l'aide de planification expérimentale. souris CD1 donnent généralement naissance autour du jour 19 après l'accouplement. Utilisez CD1 ou CBA / BL6 croix pour obtenir CD1 ou CBA / BL6 neonates, respectivement. Intercroisements entre les deux lignes utilisent les femelles et les mâles CD1 CBA / BL6.
  2. Pour la collagénase stock: peser 200 mg Type de collagénase IV avec une balance de précision élevé. Transférer dans un tube de 50 ml de centrifugeuse. Dissoudre dans 40 ml de HBSS avec Ca 2+ / Mg 2+ (1,26 et 0,5 mM, respectivement) pour faire un / ml de solution mère de 5 mg.
    1. Autoriser la collagénase àdissoudre pendant ~ 30 min en agitant doucement. Aliquoter et maintenir la solution congelée dans -20 ° C en tant que stock, qui reste actif pendant au moins un an.
  3. Autoclave pour stériliser plusieurs paires de pinces, des ciseaux et des conseils de P20 pour la dissection et l'îlot cueillette.
  4. Pour le 1 M de glucose stock: peser 9 g de glucose dans un tube de 50 ml de centrifugation, ajouter 50 ml du milieu RPMI 1640 pour dissoudre le glucose. Maintenir à 4 ° C jusqu'à son utilisation, mais pas plus de 6 mois.

2. Solutions de travail

NOTE: Le jour de l'isolement des îlots, préparer les réactifs suivants.

  1. Pour la solution IV de travail de type collagénase: dégel et diluer collagénase stocks sur la glace. Distribuer 0,15 ml disponible dans chaque ml tube de 1,7 microfuge. Ajouter 1,35 ml HBSS avec Ca 2+ / Mg 2+. Inversez le tube 5 fois. Laisser sur la glace pendant 15 min.
    1. Spin à grande vitesse pendant 3 min dans une microcentrifugeuse. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Laisser sur la glace jusqu'à utilisation. Jeter le tube avec des débris insolubles.
  2. Pour RPMI complet 1640: ajouter 2,5 mL 1 M de glucose, 50 ml inactivé par la chaleur FBS, et 5 100x ml Stock Pen-streptocoque dans 500 ml du milieu RPMI 1640. Laisser sur la glace jusqu'à utilisation.

3. Isolement et Pancréas Digestion

  1. Euthanasier neonates avec isoflurane, suivis par décapitation selon des protocoles approuvés.
  2. Poser la souris avec le ventre vers le haut. Asperger avec de l'éthanol à 70% pour la stérilisation.
  3. Soulevez la peau du ventre avec des pinces et couper les couches de la peau et des muscles longitudinalement le long de la ligne médiane avec une paire de ciseaux, de la zone génitale à la cage thoracique. Cela ouvre la cavité abdominale pour exposer tous les organes internes.
  4. Transférez tous les organes internes à un plat de 100 cm avec une paire de pinces. Localisez le pancréas, qui est un organe dispersé avec une partie dorsale qui s'accroche à l'estomac et de la rate et une partie ventrale qui adhère au duodénum 11.
  5. Ajouter HBSS dans le plat pour submerger les organes. En solution, les tissus pancréatiques accrochent plus au duodénum, ​​de l'estomac, ou de la rate. Il est facilement reconnaissable sous un champ de dissection en raison de sa couleur blanche typique. Utilisez une paire de pinces pour éplucher les tissus pancréatiques loin de tissus et de transfert entourant à une nouvelle boîte de 60 mm avec HBSS.
  6. Couper chaque pancréas avec une paire de ciseaux en morceaux plus petits que 5 mm à travers toutes les dimensions. Transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Jusqu'à cinq pancreata (moins de P7) peuvent être digérés dans un seul tube. Pour les souris P8-P16, utiliser un tube par le pancréas.
  7. Ajouter 0,5 - solution de travail 1 mL de collagénase à chaque tube (0,2 ml pour chaque pancréas P1-P7 Utiliser 0,5 ml pour chaque pancréas P8-P16.). Laisser le tube dans un incubateur à 37 ° C pendant jusqu'à 15 min. Inversez le tube deux fois par min.
  8. Après environ 5 minutes, appuyez sur le tube pour surveiller l'état de la digestion du tissu pancréatique. Poursuivre le processus de digestion jusqu'à ce que la majeure partie du pancréastissu apparaît amas de cellules fragmentées, avec un diamètre <2 mm. Le lysat apparaît trouble, qui est due à l'autolyse des cellules acineuses normal.

4. Lysate laver

  1. Spin lysat à 500 xg pendant 10 s dans une microcentrifugeuse. Retirer la couche de surnageant avec un Pipetman P1,000. Le surnageant doit apparaître turbide mais dépourvue d'amas cellulaires. Ne pas utiliser de l'aspiration, ce qui peut rapidement aspirer à une distance de fragments de tissus en bas en raison de la présence d'un ADN collant.
  2. Ajouter 1 RPMI mL 1640 complète. Appuyez doucement le tube pour remettre en suspension le lysat fragmenté. Inversez haut et en bas 10 fois. Répétez l'étape 4.1.
  3. Répétez l'étape 4.2 plus de deux fois ou jusqu'à ce que le surnageant apparaît clairement. Re-suspendre des fragments pancréatiques lavés dans 1 ml complets RPMI 1640 médias.

5. Islet Isolation

NOTE: Pour un petit nombre de pancreata, comme ci-dessous (5.1) directe ramasser la main peut être utilisé pour l'îlot isolation. Un grand nombre de pancreata (> 6), la méthode décrite au point 5.2 est préféré.

  1. Direct cueillette à la main:
    1. Transfert lysat de l'étape 4.3 dans un plat de 60 mm. Ajouter 5 ml complets RPMI 1640. Mettre sous un microscope à dissection.
    2. Mettre en place l'éclairage lumineux sur le terrain sur le microscope. Réglez l'intensité lumineuse à ~ 50% de la puissance maximale. Sous cette condition, les îlots apparaissent comme légèrement grappes roses, tandis que les cellules acineuses grappes de forme irrégulière sombres (figure 1A). Un grossissement de ~ 50X (combinant la puissance de l'objectif et l'oculaire) est recommandé d'offrir la meilleure façon d'îlots de visualisation et l'ouverture de la pointe de la pipette en même temps pour la cueillette.
    3. Pick-up îlots avec une pointe de pipette P20 tout en évitant les clusters acineuses. Fractions Distribuer îlots-enrichi à un nouveau plat de 60 mm avec RPMI milieu complet (figure 1B).
    4. Répétez le processus cueillette à la main deux fois de plus. Laissez îlots purs dans un nouveau 60plat mm avec 4 ml du milieu RPMI complet (Figure 1C).
  2. centrifugation Gradient:
    1. Préparer un tube de 15 ml de centrifugeuse qui est préchargé avec 2 ml polysucrose et de sodium diatrizoate à une densité de 1,077 g / ml. Laisser le tube sur la glace jusqu'à utilisation.
    2. Transférer la suspension de l'étape 4.3 sur la partie supérieure de la solution de diatrizoate de sodium, le polysucrose et avec une pipette Pasteur. Ne pas déranger la couche inférieure. Tissues de jusqu'à 10 nouveau-né ou 2 P17 pancreata peuvent être chargés dans chaque tube de 15 ml.
    3. Spin le tube à ~ 600 xg dans un rotor oscillant pendant 15 min à 4 ° C. Utiliser les paramètres de frein-off.
    4. Après centrifugation, transférer les médias et les couches de interphase (noter que dans des conditions de fonctionnement idéales, les îlots seront situés dans l'interphase entre le polysucrose et la culture média après centrifugation) dans un nouveau tube de 15 ml. Ajouter 10 ml de milieu, mélanger doucement mais complètement.
    5. Isoler la fraction d'îlots enrichià 300 xg pendant 5 min. Retirez le support de lavage. Répétez le lavage une fois de plus avec les médias RPMI complet. Pellets Resuspendre dans 4 ml de milieu, qui contient la plupart des îlots et des conduits (figure 1D).
    6. Hand-cueillir les îlots comme indiqué à la section 5.1.

6. GSIS Assays en îlots isolés

  1. Incuber les îlots provenant de l'étape 5.1.4 dans un milieu RPMI complet pendant 2 h, dans une culture tissulaire en C incubateur à 37 °.
  2. Utiliser une pipette pour enlever RPMI sous un microscope de dissection. Ajouter 3 solution KRB mL avec 2,8 mM de glucose à la plaque 3. Agiter 10 fois pour laver les îlots. Retirer solutions KRB.
    1. Répétez le processus de lavage une fois. Incuber les îlots avec 3 solution KRB mL à 37 ° C pendant 1 h dans un incubateur.
  3. Aliquoter 1 KRB ml dans chaque puits d'une plaque de 12 puits. Préchauffer le stock KRB et la plaque à 37 ° C dans un incubateur.
  4. Laver les îlots deux fois avec préchauffée KRB comme dans 6.2. Transfer 10 îlots à chaque puits des plaques préchauffées. Incuber dans un incubateur à 37 °.
  5. Après 45 minutes, retirer 50 ul de surnageant. Celui-ci contient la solution d'insuline sécrétée sous le glucose basale.
  6. Ajouter 32 pl 500 mM de glucose. Agiter la plaque 20 fois pour mélanger la solution. Incuber dans un incubateur à 37 °. Agiter la plaque 5 fois, une fois toutes les 5 min.
  7. Après 45 min, retirer 50 ul surnageant. Ceci est l'insuline sécrétée sous haute glucose.
  8. Transférez tous les îlots à un tube de 1,5 ml. Congeler à -20 ° C pendant 30 min. Décongeler à la température ambiante pendant 5 min. Répétez le processus de congélation et de décongélation.
  9. Ajouter 0,5 ml d'éthanol à 70% avec du HCl 20 mM. Laisser reposer jusqu'au lendemain. Ceci est la insuline dans des îlots.
  10. Utiliser ELISA classique pour tester les niveaux d'insuline, décrit précédemment 3.

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Résultats

Dans des conditions optimales, la méthode présentée peut produire 20 - 80 îlots de pancréas chaque petite souris. Ce nombre dépend de l'arrière-plan génétique, l'âge des souris et la taille des îlots à récupérer. Parmi les couramment utilisés, CD1 out-élevé et / 6J de race pure C57BL produisent moins d'îlots dont la taille est plus petite que les hybrides entre CD1 et C57BL / 6 ou B6CBAF1 commercial / souris J font. Main directe cueillette généralement donné un plus petit nom...

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Discussion

Ici, nous fournissons un protocole étape par étape sur l'isolement des îlots de pancréas qui sont trop petites pour perfusion conventionnelle. Il est prévu pour produire des îlots préparés pour toutes les études en fonction des îlots tels que la purification des cellules bêta, l' analyse de l' expression génique, des îlots de maturation des cellules bêta, la prolifération, la réponse au stress cellulaire, la survie cellulaire, le métabolisme et le maintien fonctionnel GSIS, etc. Ce sera, au mieux de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent pour l’œuvre décrite.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention du NIDDK (DK065949 pour GG). Nous remercions le Dr Brenda M. Jarvis et Jeff Duryea Jr. d’avoir lu le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Collagénase de type IVSigma Aldrich, St Louis, MOC5138
1x HBSS avec Ca2+/Mg2+Mediatech/Cellgro, Manassas, VAMT21020CVSi HBSS sans Ca2+/Mg2+ est obtenu, on peut ajouter à CaCl2 et MgSO4 1,26 et 0,5 mM, respectivement.
RPMI 1640 w/o glucoseThermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA11879-020Le glucose doit être ajouté à des niveaux spécifiques pour ne pas interférer avec l’utilisation ultérieure des îlots de Langerhans.  ;
GlucoseSigma Aldrich, St Louis, MOG-7021  ;
solution de polysaccharose et de diatrizoate de sodiumSigma Aldrich, St Louis, MOHistopaque-10771
StéréoscopeCarl-Zeiss, Oberkochen, AllemagneStéréoscope Stemi2000
Leica, Wetzlar, AllemagneLeica M165
Eppendorf, Hauppauge, NYCentrifugeuse 5417C
CentrifugeuseEppendorf, Hauppauge, NYCentrifuge 5810R
15 mL Tubes centrfugeVWR, Radnor, PA89039-666
50 mL Tubes centrfugeVWR, Radnor, PA89039-658
Balance de précisionVWR, Radnor, PAVWR-225AC
Tubes microfugesVWR, Radnor, PA87003-294
Pipetman P1000Fisher Scientific,  ; Waltham, MAF123602
Pipetman P20Fisher Scientific,  ; Waltham, MAF123600
Antenne parabolique 100 x 15 mmVWR, Radnor, PA25384-088
Antenne parabolique 60 x 15 mmVWR, Radnor, PA25384-168
Plaques à 12 puitsVWR, Radnor, PA665-180
CiseauxFine Scientific Tools, Foster City, CA14080-11
Pince à épilerFine Scientific Tools, Foster City, CA5708-5
souris CD1Charles River Laboratories, Wilminton, MA  ;CD-1
C57BL/6JLe laboratoire Jackson, Farmington, CT  ;C57BL/6J
B6CBAF1/JLe laboratoire Jackson, Farmington, CT  ;B6CBAF1/J
Microcentrifugeuse

Références

  1. Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
  2. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
  3. Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
  4. Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
  5. Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
  6. London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
  7. Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
  8. Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
  9. Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
  10. Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
  11. Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445(2015).
  12. White, J., White, D. C. Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , C.R.C. Press. (1997).
  13. Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
  14. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).

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