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Article de méthode

Détection de Inter-chromosomiques Aberrations Stable par Fluorescence Multiple

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DOI :

10.3791/55162

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11 janvier 2017

 ,  , 
1Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit l’utilité de l’hybridation in situ par fluorescence multiple (mFISH) et du caryotype spectral (SKY) pour identifier les aberrations stables interchromosomiques dans les cellules de la moelle osseuse de souris après exposition à une irradiation corporelle totale.

Résumé

Les rayonnements ionisants (IR) induisent de nombreuses aberrations chromosomiques stables et instables. Les aberrations instables, où la morphologie des chromosomes est considérablement compromise, peuvent être facilement identifiées par les techniques conventionnelles de coloration des chromosomes. Cependant, la détection d’aberrations stables, qui impliquent l’échange ou la translocation de matériel génétique sans modification considérable de la morphologie des chromosomes, nécessite des techniques sophistiquées de peinture chromosomique qui reposent sur l’hybridation in situ de sondes d’ADN marquées par fluorescence, une technique de peinture chromosomique populairement connue sous le nom de fluorescence in situ hybridation (FISH). Les sondes FISH peuvent être spécifiques pour un ou plusieurs chromosomes entiers ou une sous-région précise sur le(s) chromosome(s). La méthode permet non seulement de visualiser des aberrations stables, mais aussi de détecter le(s) chromosome(s) ou une ou plusieurs séquences d’ADN spécifiques impliquées dans la formation d’une aberration particulière. Une variété de techniques de peinture chromosomique sont disponibles en cytogénétique ; ici, deux méthodes très sensibles, l’hybridation in situ à fluorescence multiple (mFISH) et le caryotype spectral (SKY), sont discutées pour identifier les aberrations stables interchromosomiques qui se forment dans les cellules de la moelle osseuse des souris après une exposition à l’irradiation corporelle totale. Bien que les deux techniques reposent sur des sondes d’ADN marquées fluorescentes, la méthode de détection et le processus d’acquisition d’images des signaux fluorescents sont différents. Ces deux techniques ont été utilisées dans divers domaines de recherche, tels que la radiobiologie, la cytogénétique du cancer, la biodosimétrie rétrospective des rayonnements, la cytogénétique clinique, la cytogénétique évolutive et la cytogénétique comparative.

Introduction

Les deux méthodes les plus fiables pour identifier les aberrations stables interchromosomiques induites par les rayonnements sont l’hybridation in situ par fluorescence multiple (mFISH), qui permet de peindre deux chromosomes ou plus simultanément, et le caryotype spectral (SKY), qui donne une couleur distincte à chaque paire de chromosomes homologues dans le génome. Contrairement aux aberrations instables, les aberrations stables sont persistantes dans la nature et peuvent se propager sur plusieurs générations dans les populations irradiées1, et sont considérées comme des « signatures » moléculaires critiques des lésions cytogénétiques induites par les radiations2. Des études menées par divers groupes ont montré que les aberrations stables sont associées à la pathogenèse et au développement d’un certain nombre de maladies, dont le cancer3. Avant l’ère de la peinture chromosomique (également appelée cytogénétique moléculaire), la technique conventionnelle du G-banding était la seule méthode pour détecter les aberrations chromosomiques stables. Cependant, le rubanage chromosomique est un défi pour les cytogénéticiens car la résolution est limitée, la reproductibilité est incertaine, il s’agit d’une procédure à forte intensité de main-d’œuvre et elle nécessite des cytogénéticiens hautement qualifiés et expérimentés pour une interprétation fiable des données4. De plus, la technique classique du banding ne permet pas de détecter des réarrangements chromosomiques complexes, qui impliquent l’interaction de trois cassures ou plus réparties entre deux chromosomes ou plus, résultat courant des lésions dues aux radiations. Des aberrations complexes peuvent persister chez les individus de nombreuses années après l’exposition aux rayonnements, ce qui les rend utiles pour la biodosimétrie rétrospective5. Par conséquent, une autre approche était nécessaire pour surmonter les limites des techniques conventionnelles de baguage pour détecter les réarrangements chromosomiques stables.

À la fin des années 1960, les travaux pionniers de Gall et Pardue (1969) sur l’hybridation moléculaire à l’aide de sondes d’acides nucléiques marquées avec des matières radioactives ont ouvert une nouvelle ère dans le domaine de la cytogénétique, qui a permis de détecter une séquence d’ADN spécifique sur les chromosomes6. Cependant, l’utilisation de sondes radioactives pour l’hybridation moléculaire présentait plusieurs inconvénients : les sondes radioactives sont relativement instables, l’activité de la sonde dépend de la désintégration radioactive de l’isotope utilisé, l’hybridation prend plus de temps, la résolution est limitée, les sondes sont relativement coûteuses et les matières radioactives sont dangereuses pour la santé. Il est donc devenu nécessaire de développer et de concevoir des sondes non radioactives. L’introduction de sondes d’acide nucléique marquées fluorescentes dans les années 1980 et 1990 a permis de surmonter les limites des sondes radioactives et d’améliorer considérablement la sécurité, la sensibilité et la spécificité de la technique d’hybridation7-10. Les sondes fluorescentes produisent des signaux extrêmement brillants lorsqu’elles sont observées au microscope à fluorescence équipé des filtres d’excitation et d’émission appropriés. Toute perte, gain ou réarrangement d’un ou de plusieurs chromosomes marqués fluorescents ou d’une partie du chromosome est facilement identifiable avec cette technique FISH.

L’analyse des aberrations chromosomiques par peinture FISH a conduit à des progrès notables dans la recherche cytogénétique au fil des ans. La conception de sondes marquées fluorescentes pour des applications spécifiques allant des sondes spécifiques au locus aux sondes de peinture de chromosomes entiers a considérablement fait progresser le domaine ; Cela a également facilité la détection d’un réarrangement submicroscopique (« cryptique »), ce qui n’était pas possible avec le bandelage chromosomique conventionnel. La peinture chromosomique de mFISH et SKY s’est avérée être un outil précieux pour l’identification de réarrangements interchromosomiques simples et complexes. Les principes de base des deux techniques sont similaires, mais la méthode de détection et de discrimination du signal fluorescent après hybridation in situ et le processus d’acquisition d’images sont différents. Dans mFISH, des images distinctes de chacun des quatre fluorochromes sont capturées à l’aide de filtres de microscope passe-partout à bande étroite ; Un logiciel dédié est ensuite utilisé pour combiner les images. Dans SKY, l’acquisition d’images est basée sur une combinaison de microscopie à épifluorescence, d’imagerie de dispositifs à couplage de charge et de spectroscopie de Fourier, qui permet de mesurer l’ensemble du spectre d’émission avec une seule exposition à tous les points de l’image. Dans mFISH et SKY, les images monochromes sont capturées indépendamment, puis fusionnées, et enfin, des pseudo-couleurs uniques sont attribuées aux chromosomes dans des images monochromatiques basées sur le colorant spécifique attaché à chaque sonde fluorochrome.

La contribution de l’analyse mFISH et SKY dans le domaine de la radiobiologie est remarquable, en particulier pour l’estimation rétrospective de la dose d’exposition humaine à l’IR (biodosimétrie des rayonnements)11-14, l’évaluation du risque de cancérogenèse des rayonnements15, ainsi que la détection et l’estimation du risque de cancer secondaire lié à la radiothérapie16. Une étude récente sur des souris a montré qu’une technique de peinture chromosomique basée sur FISH est également un outil important pour évaluer l’efficacité de la contre-mesure des radiations17. Dans la présente étude, l’effet de l’exposition totale aux rayonnements corporels sur l’induction d’aberrations chromosomiques stables dans les cellules de la moelle osseuse de souris a été démontré à l’aide des techniques mFISH et SKY.

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Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole animal a été approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Arkansas pour les sciences médicales. Tous les animaux ont été logés dans l'animalerie climatisée standard à 20 ± 2 ° C avec 10 - 15 cycles horaires de l'air frais et l'accès libre à la nourriture standard pour rongeurs et de l'eau. À l'arrivée, les souris ont été mis en quarantaine pendant 1 semaine et à condition de rongeur certifié chow.

1.Radiation exposition et in vivo Arrestation de cellules métaphase

  1. souris Exposer non anesthésié à 2 Gy rayonnement du corps entier dans une chambre d'irradiation. Pendant l'irradiation, placer la souris dans une chambre de maintien bien ventilé pour assurer qu'ils ne se déplacent pas librement et reçoivent une dose uniforme.
  2. Injecter 100 ul de solution à 0,05% de colchicine (cpoudre olchicine dissous en calcium et en magnésium libre PBS) par voie intrapéritonéale en utilisant une aiguille 25 G attaché avec 1 ml seringue jetable. Éviter l'injection directement dans un organe quelconque.
  3. Laisser l'animal dans la cage pendant 2 h avant la récolte des cellules de moelle osseuse. Observez l'animal pour tout signe de douleur ou de détresse.

2. moelle osseuse de cellules Récolte et isolement de cellules de moelle osseuse mononucléaires par gradient de densité Centrifugation

  1. Euthanasier la souris par asphyxie au CO2.
  2. Vaporiser éthanol à 70% sur la dorsale et la face ventrale.
  3. Faire une incision de 2 cm sur la peau abdominale avec des ciseaux pointus. Attrapez la peau de chaque côté de l'incision avec des pinces émoussées et tirez doucement ouvrir les muscles abdominaux.
  4. Coupez les deux pattes de derrière avec des ciseaux et les placer immédiatement dans le pré-réfrigéré PBS avec 4% de FBS.
  5. Nettoyer soigneusement tous les muscles attachés à la patte arrière avec une lame de rasoir et de la gaze de coton bandage pointu.
  6. Séparer le tibia du fémur. Coupez les deux extrémités de chaque os avec une lame de rasoir.
  7. Vider le contenu de la moelle osseuse avec 3 ml de PBS (avec 4% de FBS) à l'aide d'une aiguille 23 G attachée à une seringue de 3 ml et de recueillir le contenu dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Faire passer la suspension de cellules au moins 10 fois à travers l'aiguille pour faire une suspension de cellules isolées.
  8. superposer soigneusement la suspension cellulaire sur un volume égal de milieu de séparation de lymphocytes (3 mL), sans perturber l'interface entre la suspension cellulaire et du milieu de séparation des lymphocytes. Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante.
  9. Recueillir soigneusement la couche leucocytaire sans déranger les autres couches et le transfert dans un nouveau tube de 15 ml centrifugeuse.

3. Préparation de métaphase Spreads cellulaires

  1. Ajouter 10 ml de PBS dans le tube contenant la couche leucocytaire.
  2. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
  3. Retirez délicatement le surnageant. Puis briser til culot cellulaire avec tapotant doucement et ajouter 10 ml de PBS.
  4. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
  5. Retirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire, briser le culot, et ajouter 4 ml de pré-chauffé hypotonique solution de chlorure de 0,075 M de potassium. Ajouter hypotonique goutte de solution à goutte avec une agitation constante douce.
  6. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 ° C dans un bain d'eau.
  7. Après traitement hypotonique, ajouter un volume égal (4 ml) de fixateur (méthanol: acide acétique glacial, 3: 1 v / v) dans le tube de 15 ml et mélanger doucement en inversant le tube.
  8. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant.
  9. Brisez le culot cellulaire avec taraudage suivi par vortex doux pendant quelques secondes et ajouter 3 ml de goutte de solution fixatif à goutte avec une agitation constante.
  10. Incuber pendant 30 min à température ambiante, puis centrifuger à 400 g pendant 5 min.
  11. Retirer le surnageant, briser le culot cellulaire avec gentle taraudage, et ajoutez 3 mL fixateur frais.
  12. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante, et retirer le surnageant. Brisez le culot cellulaire avec tapotant doucement et ajouter 3 mL frais fixateur.
  13. Répétez l'étape 3.12 deux fois de plus.
  14. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante, et retirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Puis ajouter 400 à 600 pi fixateur et bien mélanger avec pipetage.
  15. Déposer 30 ul des cellules fixées sur des lames pré-nettoyés et humides inclinés à un angle de 45 ° et laisser les lames sécher à l'air complètement du jour au lendemain.

4. Souris Chromosome Peinture par mFISH

  1. chromosome dénaturation
    1. Placez la diapositive contenant les écarts de cellules métaphase dans 2x SSC pendant 2 min à température ambiante.
    2. Déshydrater le coulisseau par lavage en série d'éthanol pendant 2 minutes chacune dans 70%, 80% et 100%. Incuber pendant 60 min à 65 ° C.
    3. Préchauffer la solution de dénaturation à 40 mL (70% de formamide / 2x SSC; pH 7,0) à 70 ° C (± 2 ° C) dans un bocal de Coplin en verre pendant 30 min. Dénaturer chromosomes en incubant la diapositive dans une solution de dénaturation préchauffé pendant 1 à 1,5 min.
    4. Quench glisser immédiatement dans de la glace-froid à 70% d'éthanol pendant 2 min pour arrêter le processus de dénaturation ainsi que pour prévenir les chromosomes dénaturés de re-recuit. Déshydrater alors par lavage à l'éthanol à 80% pendant 2 min. Répétez le lavage à l'éthanol avec 100% d'éthanol pendant 2 min. Complètement sécher la lame à la température ambiante.
  2. Dénaturation et Hybridation de la sonde Mélange
    1. Centrifuger brièvement le mélange de sonde fournie par le fabricant, transférer 10 pi de mélange de la sonde dans un 500 pi enfichable tube de centrifugeuse à bouchon, et dénaturés par incubation à 80 ° C (± 2 ° C) dans un bain d'eau pendant 7 min.
    2. Placer le tube de centrifugeuse avec le mélange de sonde dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 10 min.
    3. Appliquer le mélange de sonde dénaturée sur la lame avec chromoso dénaturémes.
    4. couvrir soigneusement la zone avec un 18 mm x 18 mm couvercle en verre de glissement et d'éliminer les bulles d'air visibles en appuyant très doucement la lamelle à glisser. Sceller les quatre côtés de la lamelle avec du ciment en caoutchouc et incuber pendant 12 h à 16 h dans l'obscurité à 37 ° C dans une chambre humidifiée pour l'hybridation.
  3. Poster Hybridation laver et détection
    1. Retirez délicatement le ciment de caoutchouc et la lamelle.
    2. Placer la lame dans préchauffée 0,4x SSC à 74 ° C (± 2 ° C) pendant 5 min.
    3. Laver la lame dans une solution de lavage II (4x SSC / 0,1% de Tween 20) pendant 2 min.
    4. Placer 20 ul d'anti-fade milieu de montage avec DAPI de contraste (1,5 pg / ml) et couvrir avec une lamelle de verre. Appuyez doucement sur la lamelle avec le tissu de laboratoire pour éliminer les bulles d'air et de la solution de montage en excès. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles.
    5. Voir diapositives à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé des filtres appropriés.

5. Spectral caryotype (SKY) de Chromosomes souris

  1. Chromosome et Probe Dénaturation
    1. Equilibrer diapositive dans 2x SSC à température ambiante pendant 2 minutes, sans agitation.
    2. Déshydrater coulissent dans une série d'éthanol (70%, 80% et 100% d'éthanol) pendant 2 minutes à chaque fois à la température ambiante. Air-sécher la lame pour éliminer l'éthanol complètement.
    3. Chauffer la solution 40 ml de dénaturation (70% de formamide / 2 x SSC; pH 7,0) dans un bocal de Coplin en verre pendant 30 min.
    4. Incuber slide en solution de dénaturation pré-chauffé pour 1 à 1,5 min.
    5. immerger immédiatement la lame dans la glace froide éthanol à 70% pendant 2 min pour arrêter le processus de dénaturation ainsi que pour prévenir les chromosomes dénaturés de re-recuit.
    6. Déshydrater la lame en le plaçant dans 80% d'éthanol pendant 2 minutes, puis dans l'éthanol à 100% pendant 2 min à température ambiante.
    7. Dénaturer la sonde SKY (flacon n ° 1 fourni par le fabricant) dans un bain d'eau réglé à 80 ° C (± 2 ° C)pendant 7 min, puis placer immédiatement dans un bain d'eau différente réglé à 37 ° C pendant 10 min.
  2. sonde hybridation
    1. Ajouter 10 pi de sonde de SKY dénaturée sur les chromosomes dénaturés.
    2. Placez délicatement un 18 mm x 18 mm lamelle de verre sur la sonde de SKY sorte que les bulles d'air sont piégés sous la lamelle.
    3. Sceller les bords de la lamelle couvre-objet avec du ciment de caoutchouc.
    4. Placer la lame dans une chambre étanche à la lumière humidifié et incuber dans l'obscurité à 37 ° C pendant 24 h à 36 h.
  3. Post-hybridation de lavage et de détection Fluorescence
    1. Retirer la colle de caoutchouc très soigneusement sans perturber la lamelle.
    2. Placer la lame dans préchauffée solution de lavage rapide (0.4x SSC) à 72 ° C (± 2 ° C) pendant 5 min avec une agitation constante. Immergez glisser dans la solution de lavage III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) et incuber pendant 1 min en agitant.
    3. Facultatif: Ajouter 80 pi de réactif de blocage(Flacon n ° 2 fourni par le fabricant) sur la zone d'hybridation, placer un 24 mm x 60 mm lamelle couvre-objet en plastique et incuber dans l'obscurité à 37 ° C pendant 30 minutes dans une chambre humidifiée.
    4. Retirez délicatement la lamelle en plastique et laver la lame avec préchauffé (45 ° C) une solution de lavage III pendant 5 min.
    5. Appliquer 80 pi de réactif de coloration Cy5 (flacon n ° 3 fourni par le fabricant), placer un 24 mm x 60 mm lamelle couvre-objet en plastique et incuber à 37 ° C dans l'obscurité pendant 40 minutes dans une chambre humidifiée.
    6. Plonger la lame dans un bocal de Coplin en verre contenant préchauffé (45 ° C) solution de lavage III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) et incuber à 45 ° C dans un bain d'eau pendant 2 min avec agitation. Répéter cette opération de lavage 3 fois.
    7. Appliquer 80 pi de réactif de coloration Cy5.5 (flacon n ° 4 fourni par le fabricant), placer un 24 mm x 60 mm lamelle couvre-objet en plastique et incuber à 37 ° C dans l'obscurité pendant 40 minutes dans une chambre humidifiée.
    8. Laver la lame 3 fois avec préchauffé (45 ºC) solution de lavage III.
    9. Maintenez la lame dans une position inclinée contre une serviette en papier pour drainer l'excès de liquide. Ajouter 20 ul anti-fade réactif DAPI (flacon n ° 5 fourni par le fabricant) et placer soigneusement un 24 mm x 60 mm lamelle de verre sans introduire de bulles d'air. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles et d'observer avec un microscope à épifluorescence équipé pour capturer des images SKY.

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Résultats

irradiation totale du corps induit de nombreuses aberrations chromosomiques dans les cellules de moelle osseuse de souris irradiées. Le protocole actuel est optimisé pour in vivo arrêt de la mitose des cellules de la moelle osseuse après une exposition à un rayonnement, la récolte des cellules de moelle osseuse à partir des pattes postérieures de souris irradiées, l' isolement des cellules mononucléées de la moelle osseuse par gradient de densité de centrifugation, la prépar...

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Discussion

Plusieurs étapes essentielles déterminent le succès de mFISH et SKY. La première et la plus importante étape consiste à optimiser le traitement à la colchicine pour in vivo arrêt de la mitose des cellules mononucléaires de moelle osseuse. La concentration et le traitement colchicine temps individuellement ou de concert déterminer l'index mitotique, ainsi que la condensation des chromosomes, deux conditions préalables importantes pour la peinture chromosomique efficace. Une concentration élevée colchicine ou...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par l'Arkansas Espace Grant Consortium et de l'Institut national de recherche spatiale biomédicale par la National Aeronautics and Space Administration, accorde NNX15AK32A (RP) et RE03701 (MH-J), et P20 GM109005 (MH-J), et le US Veterans Administration ( MH-J). Nous remercions Christopher Fettes, coordonnateur du programme pour le ministère de l'environnement et de la santé au travail à l'Université de l'Arkansas pour les sciences médicales, l'assistance éditoriale en préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
FormamideSigma-Aldrich221198-100ML
Tampon SSC 20&fois ; ConcentréSigma-AldrichS6639-1L
SKY Réactif de laboratoire pour sourisImagerie spectrale appliquéeFPRPR0030/M40
CAD - Kit de détection d’anticorps concentrésImagerie spectrale appliquéeFPRPR0033
Peintures simples personnalisées - 3 couleurs ; Chromosome 1 de la souris : Rouge, Chromosome 2 de la souris : Vert, Chromosome 3 de la souris : AquaApplied Spectral ImagingFPRPR0182/10
Lamelles en verreFisher Scientific12-545B
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
Acide chlorhydrique, 37 %, Acros OrganicsFisher ScientificAC45055-0025  ;
Fisherbrand Plats de coloration en verre  ; avec bouchon à visFisher Scientific08-816
KaryoMAX Solution de chlorure de potassium  ;Life Technologies10575-090
Lames de microscope Fisherbrand Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15
Poudre de colcémideFisher Scientific50-464-757  ;
Histopaque-1083  ;Sigma-Aldrich10831
Shepherd Mark I, modèle 25 137Cs irradiateurJ. L. Shepherd & modèle 484B
1 mLBD Biosciences647911
alcool éthylique, 200 ProofFisher ScientificMEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), sans calcium et magnésiumFisher ScientificICN1860454
sérum de veau fœtalFisher Scientific10-437-010
MéthanolFisher ScientificA454SK-4
Acide acétique glacialFisher ScientificAC295320010
Microscope Zeiss ImagerAXIO.Z2
Seringue d’Associates

Références

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