Détection de Inter-chromosomiques Aberrations Stable par Fluorescence Multiple In Situ Hybridation (mFISH) et Spectral caryotype (SKY) chez des souris irradiées

Summary

Le présent protocole décrit l’utilité de l’hybridation in situ par fluorescence multiple (mFISH) et du caryotype spectral (SKY) pour identifier les aberrations stables interchromosomiques dans les cellules de la moelle osseuse de souris après exposition à une irradiation corporelle totale.

Abstract

Les rayonnements ionisants (IR) induisent de nombreuses aberrations chromosomiques stables et instables. Les aberrations instables, où la morphologie des chromosomes est considérablement compromise, peuvent être facilement identifiées par les techniques conventionnelles de coloration des chromosomes. Cependant, la détection d’aberrations stables, qui impliquent l’échange ou la translocation de matériel génétique sans modification considérable de la morphologie des chromosomes, nécessite des techniques sophistiquées de peinture chromosomique qui reposent sur l’hybridation in situ de sondes d’ADN marquées par fluorescence, une technique de peinture chromosomique populairement connue sous le nom de fluorescence in situ hybridation (FISH). Les sondes FISH peuvent être spécifiques pour un ou plusieurs chromosomes entiers ou une sous-région précise sur le(s) chromosome(s). La méthode permet non seulement de visualiser des aberrations stables, mais aussi de détecter le(s) chromosome(s) ou une ou plusieurs séquences d’ADN spécifiques impliquées dans la formation d’une aberration particulière. Une variété de techniques de peinture chromosomique sont disponibles en cytogénétique ; ici, deux méthodes très sensibles, l’hybridation in situ à fluorescence multiple (mFISH) et le caryotype spectral (SKY), sont discutées pour identifier les aberrations stables interchromosomiques qui se forment dans les cellules de la moelle osseuse des souris après une exposition à l’irradiation corporelle totale. Bien que les deux techniques reposent sur des sondes d’ADN marquées fluorescentes, la méthode de détection et le processus d’acquisition d’images des signaux fluorescents sont différents. Ces deux techniques ont été utilisées dans divers domaines de recherche, tels que la radiobiologie, la cytogénétique du cancer, la biodosimétrie rétrospective des rayonnements, la cytogénétique clinique, la cytogénétique évolutive et la cytogénétique comparative.

Introduction

Les deux méthodes les plus fiables pour identifier les aberrations stables interchromosomiques induites par les rayonnements sont l’hybridation in situ par fluorescence multiple (mFISH), qui permet de peindre deux chromosomes ou plus simultanément, et le caryotype spectral (SKY), qui donne une couleur distincte à chaque paire de chromosomes homologues dans le génome. Contrairement aux aberrations instables, les aberrations stables sont persistantes dans la nature et peuvent se propager sur plusieurs générations dans les populations irradiées¹, et sont considérées comme des « signatures » moléculaires critiques des lésions cytogénétiques induites pa....

Protocol

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole animal a été approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Arkansas pour les sciences médicales. Tous les animaux ont été logés dans l'animalerie climatisée standard à 20 ± 2 ° C avec 10 - 15 cycles horaires de l'air frais et l'accès libre à la nourriture standard pour rongeurs et de l'eau. À l'arrivée, les souris ont été mis en quarantaine pendant 1 semaine et à condit....

Results

irradiation totale du corps induit de nombreuses aberrations chromosomiques dans les cellules de moelle osseuse de souris irradiées. Le protocole actuel est optimisé pour in vivo arrêt de la mitose des cellules de la moelle osseuse après une exposition à un rayonnement, la récolte des cellules de moelle osseuse à partir des pattes postérieures de souris irradiées, l' isolement des cellules mononucléées de la moelle osseuse par gradient de densité de centrifugation, la préparatio.......

Discussion

Plusieurs étapes essentielles déterminent le succès de mFISH et SKY. La première et la plus importante étape consiste à optimiser le traitement à la colchicine pour in vivo arrêt de la mitose des cellules mononucléaires de moelle osseuse. La concentration et le traitement colchicine temps individuellement ou de concert déterminer l'index mitotique, ainsi que la condensation des chromosomes, deux conditions préalables importantes pour la peinture chromosomique efficace. Une concentration élevée colchicine ou.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formamide	Sigma-Aldrich	221198-100ML
Tampon SSC 20&fois ; Concentré	Sigma-Aldrich	S6639-1L
SKY Réactif de laboratoire pour souris	Imagerie spectrale appliquée	FPRPR0030/M40
CAD - Kit de détection d’anticorps concentrés	Imagerie spectrale appliquée	FPRPR0033
Peintures simples personnalisées - 3 couleurs ; Chromosome 1 de la souris : Rouge, Chromosome 2 de la souris : Vert, Chromosome 3 de la souris : Aqua	Applied Spectral Imaging	FPRPR0182/10
Lamelles en verre	Fisher Scientific	12-545B
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Acide chlorhydrique, 37 %, Acros Organics	Fisher Scientific	AC45055-0025  ;
Fisherbrand Plats de coloration en verre  ; avec bouchon à vis	Fisher Scientific	08-816
KaryoMAX Solution de chlorure de potassium  ;	Life Technologies	10575-090
Lames de microscope Fisherbrand Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Poudre de colcémide	Fisher Scientific	50-464-757  ;
Histopaque-1083  ;	Sigma-Aldrich	10831
Shepherd Mark I, modèle 25 137Cs irradiateur	J. L. Shepherd &	modèle 484B
1 mL	BD Biosciences	647911
alcool éthylique, 200 Proof	Fisher Scientific	MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), sans calcium et magnésium	Fisher Scientific	ICN1860454
sérum de veau fœtal	Fisher Scientific	10-437-010
Méthanol	Fisher Scientific	A454SK-4
Acide acétique glacial	Fisher Scientific	AC295320010
Microscope Zeiss Imager		AXIO.Z2