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Isolement de souris endométriale épithéliales et stromales Cellules pour

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DOI :

10.3791/55168

⸱

2 mars 2017

 ,  , 
1Department of Development and Regeneration, Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude présente une méthode standardisée et validée pour l'isolement et la culture de la souris primaire stroma de l' endomètre et des cellules épithéliales, qui peut être utilisé dans un système de coculture pour étudier en decidualization vitro.

Résumé

Decidualization est un procédé de différenciation de la progestérone-dépendante des cellules stromales endométriales et est une condition sine qua non pour la réussite de l'implantation de l'embryon. Bien que de nombreux efforts ont été déployés pour faire apparaître les mécanismes sous-jacents de la décidualisation, la signalisation exacte entre les cellules épithéliales qui sont en contact avec l'embryon et les cellules stromales sous-jacent reste mal comprise. Par conséquent, l'étude decidualization d'une manière qui prend à la fois la épithéliales et des cellules stromales en compte pourrait améliorer nos connaissances sur les détails moléculaires de decidualization. A cet effet, dans les modèles in vivo de decidualization artificiel sont physiologiquement la plus pertinente; Cependant, la manipulation de la communication intercellulaire est limitée. À l' heure actuelle, dans les cultures in vitro de cellules stromales endométriales sont utilisées pour étudier la modulation de la décidualisation par plusieurs molécules de signalisation. Classiquement, les cellules stromales endométriales humaines ou de souris sontutilisé. Cependant, la disponibilité d'échantillons humains est très souvent limitée. En outre, l'utilisation des tissus de souris est accompagné de variété dans le procédé de mise en culture. Cette étude présente une méthode validée et standardisée pour obtenir pur cellules endométriales épithélial (CEE) et des cellules stromales (ESC) cultures utilisant des souris intactes adultes traités avec de l'oestrogène pendant trois jours consécutifs. Le protocole est optimisé pour améliorer le rendement, la viabilité et la pureté des cellules et a été étendu afin d'étudier decidualization dans une coculture de CEE et ESC. Ce modèle peut être adapté pour exploiter l'importance des deux types de cellules dans decidualization et d'évaluer la contribution des molécules de signalisation importantes sécrétées par la CEE ou ESC lors de la communication intercellulaire.

Introduction

L'endomètre humain est la paroi interne de l'utérus et subit des cycles mensuels de ventilation et de réparation comme une préparation pour les grossesses possibles. Il se compose d'une seule couche de cellules épithéliales tapissant la cavité utérine et le stroma sous-jacent qui varie en épaisseur en fonction des fluctuations d'hormones oestrogène et de progestérone ovariens. Au cours de la phase lutéale, la progestérone poussée postovulatoire va induire la différenciation des cellules stromales endométriales dans des cellules déciduales plus grandes, rondes, un processus appelé decidualization 1, 2. Chez l'homme, ce phénomène se produit spontanément pour former le predecidua, mais devient plus prononcée lors de l'implantation d'embryons. Une conséquence fonctionnelle de decidualization est que l'utérus devient transitoirement réceptif à l'implantation d'embryons. Cet intervalle est étiqueté comme la «fenêtre d'implantation». Au cours de la première période d'implantation de l'embryon, l'e decidualizedLes cellules stromales ndometrial entourant l' implantation de l'embryon fournissent une barrière pour empêcher le passage de substances nocives pour l'embryon 3. Pendant la grossesse, ce decidua fournira des éléments nutritifs pour le développement du fœtus avant placentation a eu lieu, et sera ensuite former la partie maternelle du placenta 4.

Considérations éthiques et pratiques limitent la conception des études humaines pour étudier le processus de decidualization et ont incité l'utilisation de modèles animaux. Être un membre du groupe de placentation hemochorial, l'endomètre des rongeurs sera également soumis à decidualization avant placentation 5. Chez les rongeurs, cependant, l'initiation du processus de decidualization dépend de la présence de blastocytes dans la lumière utérine, ce qui indique qu'un stimulus supplémentaire est nécessaire pour déclencher les réponses déciduales 6. Cela implique une communication complexe entre ee cellules de l'endomètre épithéliales qui sont en contact direct avec le blastocyste, et les cellules stromales sous-jacentes. Néanmoins, decidualization peut être induite artificiellement en utilisant des stimuli comme le grattage mécanique ou l'instillation d'huile dans un utérus hormono apprêtée. Bien que des études in vivo en utilisant des modèles de decidualization artificiels nous ont permis d'améliorer nos connaissances dans le processus complexe de signalisation des decidualization, des études mécanistiques en profondeur, par exemple, l' enquête de la communication indispensable entre les cellules épithéliales et stromales, sont limitées. Par conséquent, les études in vitro decidualization peuvent être utilisés pour manipuler des voies importantes et l' étude des processus fondamentaux. A cet effet, les cultures de cellules stromales endométriales primaires peuvent être mis en place à partir de l'endomètre humain ou de rongeur. Employant rongeurs consent l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés pour étudier le rôle d'une protéine d'intérêt spécifique pendant le processus de decidualization. Cependant, immature, prepuberty souris sont souvent utilisés afin d'éviter des complications du cycle oestral, tandis que dans d'autres cas, les utérus sont prélevés sur toutes les phases du cycle oestral, ce qui se traduit par une hétérogénéité dans les cultures. En outre, le procédé de decidualization a été étudié dans différents protocoles, par exemple, par (i) les hormones additionnel (oestrogène, la progestérone ou l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc)) dans le milieu de culture, ou par (ii) l' isolement des cellules déciduales de souris à jour 4,5 (pseudo) grossesse, qui exigent besoin supplémentaire de prise de contrôle et d'hommes ayant subi une vasectomie. Ces limitations démontrent la nécessité d'une méthode normalisée pour étudier en decidualization vitro. Dans cette étude, un modèle physiologique pour examiner decidualization in vitro à partir de l' adulte, (pseudo) souris non enceintes seront présentées. Dans ce procédé, l'injection journalière de 17β-estradiol (E2) va induire la prolifération des cellules de l'endomètre, conduisant à une augmentation du rendement homogène et ppopulations de cellules ure. En outre, l'utilisation d'un système de co-culture permet l'étude de la paradiaphonie et de l'épithélium et du stroma de la capacité de manipuler le processus de decidualization à différents niveaux.

Protocole

AlexaFluor

Toutes les expériences sur les animaux pour cette étude ont été approuvés par le comité d'éthique de la KU Leuven (Belgique) (Projet P174 / 2013). Les souris ont été logées dans des conditions standard, avec un accès ad libitum à des boulettes de nourriture et de l' eau du robinet, et maintenus dans des conditions contrôlées (23 ± 1,5 ° C, humidité relative 40 - 60%, 12/12 cycle lumière / obscurité).

1. Souris

  1. Utilisez souche de souris disponible dans le commerce ( par exemple C57BL / 6, femelle 8 - 12 semaines). En règle générale, 4 - 5 souris donneront une quantité appropriée de cellules pour d'autres expériences.
  2. Injecter souris intactes sous-cutanée avec 100 ul de la 17β-estradiol (E2) solution (100 ng / 100 pi) pour 3 années consécutives d avant l'isolement afin de normaliser la phase du cycle oestral des animaux et à induire la prolifération de l'endomètre cellules. La nécessité de vérifier la phase du cycle des souris avant de démarrer le protocole est évitablescause de la 3 d 'un traitement de l'estradiol.

2. Préparatifs

  1. Faire une solution de 100 ng / 100 pi E2 dans l'huile d'arachide. Pour les injections de cinq souris (comme décrit en 1.2), une quantité de 1,5 ml est nécessaire.
    1. Dissoudre 1 mg E2 dans 1 ml d'éthanol à une solution mère de 1 mg / mL.
    2. Diluer cette solution de stock 1: 1000 dans l'huile d'arachide.
  2. Faire 500 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBBS) 1x complété avec 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine (ci-après dénommé HBSS +).
  3. Faire 500 mL de filtre cellulaire Souris endométriale stromales (MESC) moyen à la culture MESC: Modified Eagle Medium / mélange nutritif F12 de Dulbecco (DMEM / F12) avec du phénol rouge, L-glutamine et de 4- (2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-éthanesulfonique l' acide N - (2-hydroxyéthyl) pipérazine N '- (2-éthanesulfonique) (HEPES) contenant 10% de FBS, 0,5 pg / ml d' amphotéricine B et 100 pg / ml de gentamicine (fucomplémen appelé moyen MESC).
  4. Faire 500 ml de milieu filtré MESC 2% à la culture pendant MESC decidualization: DMEM / F12 avec du rouge de phénol, L-glutamine et HEPES contenant 2% de FBS, 0,5 pg / ml d'amphotéricine B et 100 pg / ml de gentamicine.
  5. Préparer 500 ml de filtration de cellules de souris endométriale épithéliale (MEEC) milieu: DMEM contenant 10% de FBS, 0,5 pg / ml d'amphotéricine B, 100 pg / ml de gentamicine, 25% MCDB-105 moyennes et 5 pg / ml d'insuline (appelés ci-après comme milieu MEEC).
  6. Préparer des lamelles Poly-L-lysine (PLL) revêtus pour la culture MESC.
    1. Dissoudre 25 mg de PLL dans 250 ml d'eau distillée. Filtrer la solution en utilisant un filtre de 0,22 um.
    2. Ajouter des lamelles stériles dans une plaque de 12 puits. Ajouter 300 pi de PLL dissous sur les lamelles.
    3. On élimine la solution au bout de 30 min d'incubation. Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure (jusqu'à 1 - 2 mois).
  7. Préparer un 10 mg / ml solution mère of collagénase de type IA et de stocker des aliquotes de 300 pi à -20 ° C. Filtrer avant utilisation.

3. Préparatifs obligatoires 24 h avant Isolation

  1. Préparer collagène des lamelles enrobées pour la culture MEEC.
    1. Préparer une solution d'acide acétique 0,02 M dans de l'eau distillée (1 ml par lamelle couvre-objet).
    2. Ajouter 150 ul de collagène dans 12 ml de 0,02 M d'acide acétique pour obtenir une concentration finale de 50 pg / ml.
    3. Ajouter des lamelles stériles dans une plaque de 12 puits.
    4. Ajouter 1 ml de la solution de collagène (voir 3.1.2).
    5. Incuber O / N (minimum 12 h) à 37 ° C.
      Au cours de l' isolement:
    6. Retirer la solution de collagène au large des lamelles par aspiration et le laisser sécher à l'air dans un environnement stérile (dans la hotte à flux laminaire).
    7. On lave les lamelles couvre-objet à deux reprises avec un tampon phosphate salin (PBS).
  2. Préparer une solution de pancréatine à 2,5% par addition de 0,25 g de pancreatine dans un tube canonique 15 ml contenant 10 ml deHBSS +. Agiter (200 tours par minute), la solution à 37 ° C pendant 1 h pour augmenter la solubilité. Conserver à 4 ° C.

4. Isolement et culture de cellules de souris endométriale épithéliales (MEEC) et souris endométriale stromales Cellules (MESC)

  1. Ajouter 25 mg de trypsine dans un tube de 15 ml contenant une solution de pancréatine de 2,5% (voir 3.2) pour finir avec une solution finale contenant 0,25% de trypsine (ci-après dénommé MESC digestion mix).
  2. L' isolement de l' utérus
    1. Vérifiez la phase du cycle des animaux avec un examen de frottis vaginal.
      1. Restreindre l'animal et rincer le vagin doucement avec 50 ul de PBS 3 - 5 fois.
      2. Recueillir le rinçage final sur une lame de verre.
      3. Examiner le matériau sous un microscope à champ clair en utilisant un objectif 10X ou 20X.
      4. Utilisez uniquement des souris qui sont dans la phase oestrus. Cette étape se caractérise par la présence de cellules epitheliales cornifiées dans le lavage vaginal (figure 1 ).
    2. Euthanasier les animaux à l' aide d' une méthode appropriée telle que la dislocation cervicale ou CO 2 narcose induite.
    3. Pulvériser les carcasses avec 70% d'éthanol afin de générer un environnement stérile.
    4. L'utilisation d'outils chirurgicaux stériles, ouvrir l'abdomen et pousser les intestins de côté pour visualiser les deux cornes utérines.
    5. Prenez la corne de l'utérus à l'extrémité la plus distale dans la trompe de Fallope. Disséquer les cornes utérines de la trompe de Fallope et enlever les tissus adipeux et conjonctif. Découpez la corne à l'extrémité distale au-dessus du corps de l'utérus et le placer dans un plat de 35 mm de Pétri avec 3 ml de HBSS +.
      1. Répétez cette étape pour l'autre corne et pour les autres animaux jusqu'à ce que toutes les cornes utérines sont recueillies.
    6. Nettoyer la corne utérine (en HBSS +) plus loin sous un stéréoscope et enlever toute adipeuse résiduelle ou de tissu conjonctif.
    7. Couper les cornes utérines ouvertes longitudinalement pour exposer la lumière utérine et remplacer ecorne e dans une nouvelle boîte de Pétri avec HBSS frais +.
    8. Transférez toutes les cornes utérines au tube 15 ml contenant de la pancréatine et de la trypsine.
    9. Incuber horizontalement pendant 60 min à 4 ° C sur un agitateur orbital (50 rpm).
    10. Incuber horizontalement pendant 45 min à 23 ° C (RT), sans agitation.
    11. Incuber horizontalement pendant 15 min à 37 ° C (bain d'eau), sans agitation.
    12. Pendant ce temps la digestion mélange MESC en dissolvant 300 pi de 1 mg / ml de collagénase actions dans 2,7 ml de 0,05% d'acide trypsine-Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) solution.
      REMARQUE: A partir de maintenant, d'autres étapes d'isolement sont réalisées dans un environnement stérile sous une hotte à flux laminaire.
  3. Souris endométriale cellules épithéliales (MEEC) Culture
    1. Après 2 heures d'incubation, soigneusement videz la solution de surnageant.
    2. Transfert du col dans une boîte de Pétri contenant du milieu MEEC froid et incuber pendant 5 min pour inactiver la trypsineactivité.
    3. Transférer le col d'un tube de 15 ml contenant 3 ml de HBSS froid +.
    4. Vortex pendant 10 s pour libérer les feuilles épithéliales.
    5. Rincer le col dans un plat propre Petri avec 3 ml HBSS +.
    6. Répétez l'étape 4.3.2 - 4.3.4 pour obtenir un total de trois suspensions contenant des feuilles épithéliales.
    7. Transfert du col à la digestion mix MESC et incuber pendant 30 min à 37 ° C tout en agitant (200 tours par minute) (passez à l'étape 4.4 pour davantage d'isolement de MESC).
    8. Récupérer les feuilles epitheliales en pipettant trois suspensions cellulaires doucement sur une maille de nylon de 100 um afin d'éliminer les débris de tissu.
    9. Centrifuger la suspension cellulaire recueillie à 500 xg pendant 5 min.
    10. Reprendre le culot dans 12 ml de milieu MEEC et bien mélanger.
    11. Installez la solution pendant 5 minutes afin de séparer en restant MESC utilisant la gravité de la sédimentation.
    12. Retirez soigneusement les 2 ml supérieures à l'aide d'une pipette de 5 ml.
    13. Centrifuger le suspensio cellulairen à 500 xg pendant 5 min.
    14. Resuspendre en milieu MEEC par pipetage de haut en bas.
    15. Plaquer les cellules sur des lamelles revêtues de collagène dans la densité souhaitée pour d' autres expériences (Figure 2a).
    16. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant au moins 12 heures.
      NOTE: Pour immunocoloration ou des expériences fonctionnelles comme l'imagerie calcique fluorescente, il est conseillé de plaquer les cellules directement sur les lamelles, tandis que l'ensemencement dans une plaque de 6 puits est recommandée lorsque l'ARN ou d'une protéine isolée est souhaitée. L'isolement des cellules stromales endométriales de souris est divisé en deux tours que la pureté des cellules après seulement une digestion peut être insuffisante. Les utérus sont digérés deux fois pour une récupération optimale des cellules et de la pureté. Dans les deux tours les interventions techniques sont identiques. Les cellules recueillies à partir des deux tours peuvent être conservés pour d'autres expériences, comme souhaité par le chercheur.
  4. Souris endométriale StrCellule omal (MESC) Culture: 1er tour
    1. Avant le début de la première ronde de la digestion, préparer un second mélange de digestion en dissolvant 300 pi de 1 mg / ml de collagénase actions dans 2,7 ml solution à 0,05% de trypsine-EDTA. Ce mélange est nécessaire à l'étape 4.4.8.
    2. Préparer trois petites boîtes de Pétri de froid (4 ° C) HBSS + et 3 x 15 tubes ml avec 3 ml de milieu MESC (tube de X1, X2 et X3).
    3. Après 30 min d'incubation, agiter la solution de trypsine contenant de l'utérus-doucement pendant 10 s. MESC cellules se détacher du tissu utérin et restent dans la solution de trypsine.
    4. Transférez le col de la première boîte de Pétri contenant 3 mL froid (4 ° C) HBSS + et bien rincer.
    5. Ajouter 3 ml de milieu MESC dans le tube contenant l'origine des cornes utérines (tube dans l'étape 4.4.3) pour inhiber l'activité de la trypsine.
    6. Transférez le col de la boîte de Pétri avec le froid (4 ° C) HBSS + X1 tube contenant 3 ml de milieu MESC et agiter doucement pendant 10 s.
    7. Répétez les étapes 4.4.4 (transfert à une boîte de Pétri de froid (4 ° C) HBSS +) et 4.4.6 (transfert à X2 tube et X3) deux fois.
      REMARQUE: Enfin, ce protocole se traduira par 4 suspensions cellulaires: un tube contenant la solution de trypsine et de 3 tubes avec un milieu contenant MESC MESC (tubes X1, X2 et X3).
    8. Transférer dans l'utérus de la nouvelle digestion MESC, tel que décrit dans l'étape 4.4.1 et incuber pendant 30 min à 37 ° C, à la verticale.
    9. Recueillir les cellules stromales en faisant passer les quatre suspensions de cellules à travers une maille de nylon de 40 pm. Rincer la maille avec une 5 ml supplémentaires de MESC.
    10. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 g pendant 7 min.
    11. Reprendre le culot dans MESC et la plaque sur des lamelles PLL revêtues pour d'autres expériences avec la densité désirée.
    12. Laisser incuber pendant au moins 4 - 6 h ou O / N à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%.
  5. Souris endométriale cellules stromales (MESC) Culture: 2 e ronde
    1. Préparer trois petites boîtes de Pétri de froid (4 ° C) HBSS + et 3 x 15 tubes ml avec 3 ml de milieu MESC (Tubes Y1, Y2 et Y3).
    2. Répétez les étapes 4.4.3 - 4.4.7.
    3. Transférer la dernière suspension de cellules avec le col à une maille de nylon de 40 pm.
    4. Recueillir les cellules stromales en faisant passer le contenu du tube de Y1, Y2 et Y3 à travers les mailles de nylon. Rincer la maille avec une 5 ml supplémentaires de MESC.
    5. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 g pendant 7 min.
    6. Remettre en suspension le culot dans du milieu MESC et de la plaque sur des lamelles revêtues PLL pour d' autres expériences (Figure 2b).
    7. Laisser incuber pendant au moins 4-6 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2.
      NOTE: Pour immunocoloration ou des expériences fonctionnelles comme l'imagerie calcique fluorescente, il est conseillé de plaquer les cellules sur des lamelles, tandis que l'ensemencement dans une plaque de 6 puits est recommandée lorsque l'ARN ou d'une protéine isolée est souhaitée.

5. vimentine/ Cytokeratin Double Coloration pour la validation de MEEC pure et Cultures MESC

  1. Ensemencer les cellules sur des lamelles.
  2. Laver 3 x 5 min avec du PBS contenant du calcium et du magnésium sur un agitateur orbital (50 rpm).
  3. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde (PFA) (ATTENTION!) Pendant 10 min, pas sur un agitateur.
  4. Laver 3x avec PBS sans calcium et de magnésium sur un agitateur (50 rpm).
  5. Perméabiliser les cellules avec 0,2% de Triton X-100 pendant 10 min sur une secoueuse (50 tpm).
  6. Laver 3x avec PBS sur un agitateur.
  7. Bloc avec du sérum à 5% de chèvre (GS) dans du PBS pendant 2 heures sur un agitateur (50 tours par minute)
  8. Incuber les cellules avec un anticorps monoclonal de lapin anti-humain de la vimentine (1: 500) et pancytokeratin anticorps monoclonal de souris anti-humain (1: 1000) à 4 ° C sur un agitateur (50 tpm). Les anticorps sont dilués dans du PBS avec 0,5% de GS.
  9. Laver 3x avec PBS sur un agitateur (50 rpm).
  10. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires (1: 1000 dans 0,5% GS) Alexa Fluor 488 conjugué IgG anti-lapin Alexa Fluor 488 et Conju-IgG anti-souris fermée sur un agitateur.
  11. Laver 3x avec PBS sur un agitateur.
  12. Mont glisse avec milieu de montage aqueux contenant DAPI et O sec / N.
  13. Sceller les lames avec le vernis à ongles et continuer à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (Figure 2a, b).

6. In Vitro decidualization dans un système coculture

NOTE: Quatre à cinq animaux sont nécessaires pour établir un système de coculture dans une plaque de 24 puits. Poursuivre le protocole suivant dans un environnement stérile, de préférence sous une hotte à flux laminaire.

  1. Préparer des inserts de culture cellulaire lors de la centrifugation et / ou les étapes d'incubation de l'isolement des cellules epitheliales (comme décrit en 4.3) dans une plaque de 24 puits supplémentaire.
    1. Ajouter 200 - 400 ul de milieu MESC dans la quantité souhaitée de puits dans la plaque à 24 puits.
    2. Placer les inserts dans les préremplies 24 puits à l'aide de pinces stériles.
  2. Reprendre le culot MEEC(Volume de travail: 150 - 300 uL par insert) (étape 4.3.14) dans un milieu MEEC et diviser sur les inserts. La culture des cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%.
  3. Ensemencer les cellules stromales dans une autre plaque de 24 puits (compatibles avec les inserts de culture cellulaire) après le second tour de l'isolement de cellules stromales (étape 4.5.6). Utiliser un volume de travail de 400 ul de suspension cellulaire par puits.
  4. Laisser les cellules stromales se fixer pendant au moins 4-6 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%.
  5. Transférer les inserts de culture cellulaire recouvertes de cellules épithéliales à partir de la première plaque de 24 puits dans la deuxième plaque à 24 puits recouverte par les cellules stromales. Utilisez des pinces stérilisées ou toucher les inserts seulement à leur pied suspendu.
  6. La culture des cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant une période de 3 à 5 d jusqu'à ce que les cellules épithéliales forment une monocouche et les cellules stromales atteignent 80-90% de confluence. En outre, utiliser la résistance électrique transépithélial (TEER)pour surveiller la monocouche epitheliale par l' utilisation d'un appareil de mesure épithéliale volts / ohms comme décrit par Grant et al. 7. Les valeurs de 800-1000 / puits étaient suffisantes pour tenir compte de la monocouche confluentes épithéliale.
  7. Si nécessaire, remplacer le milieu tous les 2 - 3 d en utilisant des pipettes de verre ou les embouts de pipettes fines. Commencer avec le remplacement du milieu des cellules stromales (semés en bas), avant de remplacer le milieu dans des inserts. Il est recommandé d'utiliser préchauffé milieu de culture cellulaire à 37 ° C.
  8. Préparer le milieu de decidualization pour induire en decidualization vitro avant de commencer l'expérience. Utiliser un volume de travail de 400 ul par puits de cellules stromales.
    1. Préparer les solutions mères suivantes et aliquotes stocker à -20 ° C.
      1. Préparer 250 uM médroxyprogestérone 17-acétate (MPA) dans l'éthanol.
      2. Préparer mM solution 100 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-AMPc dans l'eau ultrapure.
    2. Faire le moyen decidual contenant 1 uM MPA et mM AMPc 0,5 dans un milieu de MESC contenant 2% de FBS.
  9. Retirez délicatement le milieu des puits et ajouter le support decidual sur les cellules stromales. Si une condition de contrôle est nécessaire, utiliser le milieu MESC contenant 2% de FBS.
  10. Éliminer le milieu à partir des inserts de culture de cellules et ajouter 300 ul de milieu MEEC sur les cellules.
  11. Incuber les cellules pendant 5 jours dans un incubateur à 37 ° C dans 5% de CO2.
  12. Après le cinquième jour, évaluer l'étendue des decidualization dans les cellules stromales par RT-qPCR (voir ci-dessous).
  13. Valider la viabilité des cellules épithéliales en utilisant le réactif à base de viabilité résazurine.
    1. Préparer une solution 1:10 de réactif de viabilité en milieu MEEC.
    2. Transférer les inserts de culture cellulaire dans une nouvelle plaque de 24 puits.
    3. Ajouter 150 - 300 ul du réactif de viabilité - solution MEEC sur les cellules.
    4. Incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant aumoins 4-5 h ou toute la nuit et évaluer la viabilité des cellules en observant un changement de couleur (bleu au violet / rose).
      NOTE: decidualization peut également être évaluée en utilisant un test ELISA souris prolactine spécifique, comme préféré par le chercheur.

7.Validation de decidualization par qRT-PCR

NOTE: Pour la validation de la decidualization par qRT-PCR, il est recommandé d'effectuer tous les tests-conditions en double afin de recevoir une quantité suffisante de cellules pour l'analyse de l'ARN.
RT-PCR quantitative est réalisée comme précédemment décrit dans De Clercq et al. 8.
En bref:

  1. Isoler l'ARN total en utilisant un kit d'isolement d'ARN commercial.
    1. Évaluer la quantité et la qualité de l'ARN en utilisant des méthodes commerciales selon le protocole du fabricant, respectivement.
  2. La synthèse d'ADNc, selon le protocole du fabricant à partir de 1 ug d'ARN total.
  3. Utiliser un kit commercial en suivant le protocole du fabricant pour effectuer la réaction qRT-PCR.
    1. Exécutez tous les échantillons en triple exemplaire.
    2. Faire usage de la publicité TaqMan Master Mix et des sondes TaqMan spécifiques pour les gènes de ménage souhaités et prolactine (prl8a2) pour mener à bien la réaction.

Résultats

Présentation générale du protocole

La figure 1A illustre une vue d' ensemble du protocole. Une injection quotidienne de E2 (100 ng) pendant trois jours consécutifs a été utilisé pour synchroniser les animaux et de normaliser la phase du cycle oestral. Le cycle oestral peut être évaluée par lavages vaginaux et est divisé en proestrus, l'oestrus, dioestrus, et la phase de métoestrus. La phase de cycle peut être désigné en fonction de la proportion de cellules desquamées dans le lavage, qui sont soumis à des changements hormonaux. L'augmentation des niveaux d'oestrogène fera les animaux évoluent à la phase oestrus. Cette phase peut facilement être détectée par la présence de cellules epitheliales cornifiées exclusivement et l'absence de leucocytes (figure 1B). Le jour 4, du col de l' animaux qui sont en phase oestrus sont recueillies et MEEC et MESC sont isolés (figure 1C). decidualization cun être induite par addition de 0,5 mM d'AMPc et 1 uM d'AMP au milieu de FBS à 2% au cours d'une période d'incubation de 5 jours.

Contrôle de la qualité des MEEC et MESC Cultures

La pureté des cultures de cellules primaires peut être évaluée par la différence de la vimentine et de cytokératine expression. Vimentine est un filament intermédiaire qui est exprimée dans les cellules mésenchymateuses, donc dans les cellules stromales de l'endomètre. Cytokeratin est un filament intermédiaire trouvé dans le cytosquelette du tissu épithélial. La figure 2A montre le niveau d'expression de l' ARNm de la vimentine et la cytokératine dans MEEC et MESC évaluée en utilisant qRT-PCR. les niveaux de Vimentin sont riches en MESC et faible en MEEC (2,2x supérieur, p <0,001), tandis que les niveaux cytokératine sont riches en MEEC et faible en MESC (36x supérieur, p <0,001). A vimentine / cytokératine double coloration a été réalisée et a indiqué que les cellules stromales expriment vimentine alors EPITHELIAL cellules expriment la cytokératine (figure 2B, C). L'absence d'anticorps primaire a été utilisé comme témoin négatif pour la coloration immunologique (figure 2D, E). Ces colorations immunohistochimiques montrent que les cultures de cellules endométriales (MEEC et MESC) ont une pureté allant jusqu'à 90%.

Decidualization dans MEEC / MESC cocultures

Après isolement, les cellules de l'endomètre et du stroma de la souris ont été inoculées dans un système de co-culture pour simuler l'environnement de l'endomètre. Les cellules ont été cultivées jusqu'à ce que les cellules epitheliales ont formé une monocouche dans l'insert de culture cellulaire (valeurs TEER de 800 - 1000 / puits) et les cellules stromales ont atteint un état de sous-confluentes. Decidualization a été induite dans les cellules du stroma avec application de 0,5 mM d'AMPc et 1 uM d'AMP. Après cinq jours d'incubation, les taux d'ARNm de prolactine ont été évalués dans les cellules du stroma par qRT-PCR comme une indication pour DECIDualization (figure 3A). Les taux de prolactine sont fortement exprimés dans des cellules soumises à des hormones et non détectables dans les cellules incubées avec le milieu témoin (p <0,01).

Etant donné que les cellules épithéliales sont difficiles à visualiser à l' intérieur des inserts de culture cellulaire, un test de viabilité a été effectuée immédiatement après la période d'incubation de cinq jours (figure 3B). Un mélange de milieu de croissance normal et un réactif de viabilité ont été ajoutés aux puits et mis à incuber pendant une durée minimale de 8 à 12 heures. Le changement de couleur du bleu au rose vif indique la présence de cellules épithéliales viables. Notez que le changement de couleur ne se produira que lorsque les cellules viables sont présents.

figure-results-1
Figure 1: Vue d' ensemble générale du Protocole. (A) Schéma du protocole d'isolement à partir de troisjours d'injections consécutives d'oestrogène. Le jour 3, les préparatifs nécessaires doivent être préparés. Le jour 4, on évalue la phase oestrus (indiquée par l'étoile), en effectuant un lavage vaginal. MESC et MEEC sont isolés sous différentes étapes de la digestion. Au jour 6, ou lorsque les cellules sont confluentes, decidualization peut être induite dans le système de co-culture par addition d'AMPc et de l'AMP sur le support et une période d'incubation de cinq jours (jours 6-11). (B) de l' image représentant de la phase oestrus caractérisée par la présence de cellules épithéliales cornées dans le lavage vaginal (grossissement 10X). (C) de l' image représentant de MESC et MEEC (grossissement 20X, barre d'échelle: 100 um). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-2
Figure 2: immunocoloration et RT-PCR quantitative pour la vimentine et Cytokeratin en MEEC et MESC. (A) Les niveaux d' ARN messager de la vimentine et de cytokératine expression pour indiquer la pureté des cultures. Les taux d'ARN sont quantifiés relativement à la moyenne géométrique des gènes domestiques ACTB et TBP. Les données sont montrées comme la moyenne ± SEM. Vimentine / cytokératine double coloration sur des cultures de MESC (B) et les cultures MEEC (C). Insérer dans la gauche montre une vue de grossissement 63X. Contrôle négatif avec l' anticorps primaire omis pour MESC (D) et MEEC (E) (barre d'échelle: 50 um). ***: P <0,001 avec deux voies ANOVA avec correction de Bonferroni pour les tests multiples. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-3
Figure 3: Validation du decidualization par RT-PCR. Les niveaux (A) ARNm d'expression prolactine dans les cellules stromales pour évaluer la décidualisation. Les taux d'ARN sont quantifiés relativement à la moyenne géométrique des gènes domestiques PGK1 et TBP. Le facteur de variation dans les cellules cultivées dans le contrôle ou le milieu déciduale est représenté sous forme de moyenne ± SEM. (B) images illustratifs de cellules stromales avant ( en haut) et après ( en bas) decidualization stimulus. L'insert sur la droite représente un grossissement d'une cellule stromale decidualized. Decidualization est caractérisée par la présence de cellules multinucléées, indiqué par des flèches noires. (C) Des images représentatives de l'évaluation de la viabilité des cellules épithéliales dans l'insert après le dosage. Les images ont été prises immédiatement après l'administration du réactif de viabilité (Prestoblue) (0 h) et fuite matin (ON). **: P <0,01 avec le test de Mann-Whitney U. ON: du jour au lendemain. Barre d'échelle: 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Decidualization est la différenciation de la progestérone-dépendante des cellules stromales endométriales dans des cellules déciduales rondes sécrétant. Chez l'homme, ce processus se produit spontanément au cours de la phase lutéale du cycle menstruel et est déclenchée dans les cellules du stroma entourant les cellules vasculaires pour former le predecidua. Cependant, chez les rongeurs, la présence d'un blastocyste est indispensable pour induire décidualisation. Le fait que la décidualisation n'a lieu qu'après contact avec les cellules épithéliales endométriales implique que les facteurs importants sont sécrétées par les cellules épithéliales pour induire decidualization dans le stroma sous-jacent. Bien que cette différence dans l'initiation du processus de decidualization devrait être reconnu, le fait que decidualization humain devient plus robuste sur l'implantation d'embryons suggère que des mécanismes similaires pourraient être impliqués. In vitro des cultures cellulaires sont souvent utilisés pour étudier l'effet des molécules spécifiques pendant le processus de decidualization.Néanmoins, la disponibilité et la quantité de tissus humains qui peuvent être collectées sont souvent limitées et accompagnées de variations, par exemple, la phase du cycle, le nombre de grossesses et la présence de maladies gynécologiques comme l' endométriose ou l' adénomyose. Beaucoup de ces problèmes peuvent être évités par l'utilisation du tissu murin qui est facilement accessible et la phase du cycle indépendant. Un autre important avantage de l'utilisation du tissu murin est la possibilité d'utiliser des rongeurs génétiquement modifiés et la possibilité d'installer un grand nombre d'expériences. À l'heure actuelle, de nombreux protocoles d'isolement différents ont été décrits dans la littérature avec une grande variabilité de l'âge des animaux et la période dans la phase oestrus au moment de l'utilisation.

Cette étude présente une nouvelle méthode pour l'endomètre co-cultures primaires de cellules stromales et épithéliales dans lequel on a profité d'un cycle oestral normalisé par une injection quotidienne d'œstrogènes avant l'isolement. En outre, l'oestrogène est known pour induire la prolifération de cellules épithéliales et stromales ce qui augmente encore le rendement par isolement. Le protocole d'isolement décrit dans le présent document se fonde sur Grant et al. 7 Toutefois, d' autres étapes d'optimisation ont été inclus pour augmenter le rendement, la pureté et la viabilité des différentes cultures cellulaires. Tout d'abord, toujours HBSS a été complété avec des antibiotiques pour éviter la contamination de la culture primaire. Pendant l'isolement de MEEC, une adaptation de la température a été effectuée (15 min à 37 ° C) pour augmenter la récolte des cellules epitheliales au cours de la première digestion. Ensuite, une étape supplémentaire a été ajoutée pour modérer l'activité enzymatique après digestion par la trypsine par addition de milieu contenant du FBS à inhiber son activité. En outre, MEECs ont été passés à travers un filtre dont le maillage était plus grande que ce qui est communément décrit (100 um) comme ils viennent souvent en grappes et feuilles de cellules. En outre, la contamination par des cellules de stroma a été réduit en effectuant un ajoutétape itional dans laquelle MEECs et mESCs ont été séparés en fonction de la gravité de la sédimentation. Enfin, MEECs ont été ensemencées sur des lamelles revêtues de collagène pour augmenter la fixation des cellules à des lamelles de verre, comme il est devenu clair que l'attachement aux lamelles de verre non revêtues ou PLL revêtues était insuffisante. Au cours de l'isolement des mESCs, la collagénase (1 mg / mL) a été complétée pour améliorer la digestion. En outre, cette étape de digestion a été réalisée en double afin d'éviter la contamination des MEECs restants. Toutes ces étapes supplémentaires ont donné lieu à des cultures pures et viables des populations de cellules homogènes.

La pureté de la population cellulaire a été évaluée par coloration immunologique et qRT-PCR en utilisant la vimentine en tant que marqueur de la cytokératine et stromales comme un marqueur épithélial. De toute évidence, un motif d'expression opposé de vimentine et cytokératine a été observée dans MEEC et MESC. Cependant, on peut remarquer que l'expression d'ARNm relative de la vimentine et de cytokératine est similaire dans les cultures MEEC. similles résultats ar sont publiés par d' autres groupes de recherche, dans lequel les cellules épithéliales en culture acquièrent vimentine expression 9. Plus importante est la différence dans l'expression des protéines entre la vimentine et de cytokératine comme cela a été observé dans les colorations immunohistochimiques des différentes populations de cellules. Double immunomarquage a montré que les CPE étaient positifs pour la cytokératine et ESC étaient positifs pour la vimentine. L'utilisation de ces marqueurs dans immunocoloration est une méthode établie et en standard utilisé pour indiquer les types de cellules 10.

Bien que beaucoup de recherches ont été effectuées sur le decidualization de MESC, il reste possible que la présence de cellules épithéliales dans ce modèle peut modifier les résultats de decidualization. En premier lieu, il a été montré que si MEEC atteigne une monocouche, en présence de milieu conditionné MESC ou dans un milieu de co-culture, la monocouche a une résistance électrique trans-épithéliale améliorée des cellules épithéliales (TEER), résultant de facteurs sécrétés par MESC 7. En outre, Pierro et al. 11 ont apporté la preuve que la prolifération epitheliale, influencée par 17β-oestradiol, peut être médiée par des facteurs sécrétés par les cellules stromales, et en variante, les cellules epitheliales peuvent libérer des facteurs qui modulent stroma decidualization 12, 13. Dans l'ensemble, il est clair que l'environnement co-culture épithéliale-stromale fournit une situation plus physiologique qui permet une interaction et de communication paracrine. Le procédé de mise en culture de deux différents types de cellules en utilisant un système de co-culture d' insertion a été décrit précédemment 14, 15 et a été adapté pour l'utilisation de cellules primaires de souris. Par la détection des niveaux d'ARNm de la prolactine en tant que sortie de lecture pour decidualization, la technique décrite a une lecture très reproductible pour decidualization disponibles et permettents ainsi l'étude de la relation épithéliale-stromale pendant decidualization. signaux paracrines médiation de MEEC pourraient modifier l'étendue de decidualization dans les cellules stromales. En outre, le modèle permet une modulation spécifique de la face épithéliale sans affecter directement les cellules stromales. Par conséquent, cette co-culture de MEEC et MESC offre un outil idéal pour évaluer l'effet des hormones, des cytokines, etc. , sur les cellules épithéliales avec une température lue sur stromal decidualization. Un autre avantage de ce système de co-culture est qu'elle permet aux chercheurs d'étudier l'implication d'une protéine spécifique dans le processus decidualization soit dans l'épithélium ou le compartiment stromal en utilisant des cellules isolées à partir d'animaux transgéniques. En outre, cette technique sera très utile pour étudier blastocyste adhérence pour évaluer si les facteurs paracrines sécrétées par les cellules épithéliales en présence d'un blastocyste sont suffisantes pour induire decidualization du stroma sous-jacentcellules. Une étape importante dans l'invasion trophoblastique corrélée à la dégradation de matrice extracellulaire, qui est médiée par l'action des enzymes protéolytiques. La technique proposée peut être appliquée comme un modèle in vitro pour étudier la diaphonie entre le blastocyste, les cellules épithéliales et du stroma de support.

Cependant, à l'heure actuelle peu est connu sur l'origine des cellules épithéliales qui peuvent être aussi bien luminal que glandulaire. Par conséquent, une caractérisation plus poussée du profil génétique et moléculaire des cellules épithéliales est nécessaire. En outre, le procédé décrit est limité dans les connaissances disponibles sur la polarisation des cellules épithéliales. À l'heure actuelle, la polarisation des cellules épithéliales n'a pas été prise en compte. Cependant, des différences dans l'expression des protéines de la membrane sont décrites dans les membranes apicales et basales. polarisation inappropriée de la couche épithéliale pourrait avoir un impact sur l'interaction paracrine entre epitheliAl et les cellules stromales. Cependant, les procédés pour obtenir des cellules epitheliales polarisées ont été décrits et peuvent être inclus dans la technique décrite 15, 16.

Au total, le protocole décrit propose une technique permettant d'établir avec succès des cultures de cellules primaires de souris épithélial de l'endomètre et des cellules stromales. Cette technique aboutit à des cultures de cellules pures comme confirmé par qRT-PCR et immunocoloration de la vimentine et de cytokératine. En fin de compte, un épithéliale et stromale co-culture a été introduite qui permet la recherche de signaux paracrines médiation soit par MEEC et / ou MESC dans le processus de decidualization.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de la recherche-Flandre (FWO G.0856.13N) et le Conseil de recherches de la KU Leuven (OT / 13/113). KDC est financé par le FWO Belgique. AH est financé par OT / 13/113. Nous tenons à remercier la Cellule Imaging Core installation de la KU Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) pour l'utilisation du microscope confocal.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ThinCert Insert de culture tissulaire pour plaques de 24 puits ; 1 & micro ; m taille des pores ; des inserts transparentsGreiner Bio-one662610sont également prévus pour d’autres plaques multipuits et/ou d’autres tailles de pores. Autres fournisseurs : Merck Millipore.
https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/
0110_0110_0090_0030/13408/  ;
Nunc Culture cellulaire traitée 24 plaquesde puits Thermo Scientific142475http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475
8-Bromoadenosine 3&prime ;,5&prime ;-Sel sodique monophosphateSigma AldrichB7880Préparer une solution mère de 100 mM dans de l’eau Milli Q. Stocker les aliquotes à -20 ° ;C.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en®ion=BE  ;
Médroxyprogestérone 17-acétateSigma AldrichM1629Préparez une solution mère de 250 µ ; M dans éthanol. Stocker les aliquotes à -20 ° ;C.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en®ion=BE  ;
Huile d’arachisSupermarchéHuile d’arachis de cuisson standard que l’on peut trouver dans tous les supermarchés est utilisée
Réactif de viabilité cellulaire PrestoBlueThermo ScientificA13261https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1
HBSS 1x, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénolGibco14175-046Conserver au réfrigérateur le plus longtemps possible. Utiliser HBSS+ froid pendant le protocole.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046  ;
17-&bêta ; EstradiolSigma AldrichE8875Préparer une solution mère de 1 mg/mL dans de l’EtOH avant de la diluer dans de l’huile d’arachis (1:1 000).
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en& ; region=BE
Filtre à milieu cellulaire Stericup, 0.22 µ ; m, polyéthersulfone, 500 ml, radio-stériliséMerck MilliporeSCGPU05REhttp://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE
Pénicilline-Streptomycine (5 000 U/mL)Gibco15070-063https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063
DMEM/F12, rouge de phénol, L-glutamine, HEPESGibco11330-032https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057
sérum de veau fœtal, qualifié, inactivé par la chaleur, approuvé par l’UE, origine Amérique du SudGibco10500-056https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064
amphotéricine BGibco15290-018https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018
Gentamicine (50 mg/mL)Gibco15750-037https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037
DMEM, faible teneur en glucose, pyruvate, sans glutamine, sans rouge de phénolSigma AldrichD5921http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en®ion=BE
MCDB-105Sigma AldrichM6395Diluer dans de l’eau Milli Q, ajuster le pH à 7 avec du NaOH et filtrer avant utilisation. Stocker dans l’obscurité.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en®ion=BE  ;
Insuline du pancréas bovinSigma AldrichI1882http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en®ion=BE
Couvre-filets, verre, 18 mm & Oslash ;Glaswarenfabrik Karl Hecht1001/18http://www.hecht-assistant.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937
& tx_rmproducts_pi1[p]=3504
& tx_rmproducts_pi1[v]=20088
& cHash=abd12065683fe74b00eaa
5e562824d06
Poly-L-lysineSigma AldrichP2636http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en®ion=BE
Collagénase de type IA de Clostridium histolyticumSigma AldrichC2674http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en®ion=BE
DPBS, sans calcium, sans magnésiumGibco14190-094https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094
Trypsine du pancréas bovinSigma AldrichT7409http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en®ion=BE
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénolGibco25300-054Réchauffer à température ambiante avant utilisation.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054  ;
Crépine à cellules, 40 & micro ; m mesh, jetableBD Falcon352340https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Crépine à cellules, 100 µ ; m mesh, jetableBD Falcon352360https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Millex-GP Unité de filtre à seringue, 0,22 et micro ; M, polyéthersulfone, 33  ; mm, stérilisé aux rayons gammaMerck MilliporeSLGP033RShttps://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1
Acide acétique (glacial) 100 %Merck Millipore1.00063https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063
Collagène ICorning  ;354236De rat tail.
https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& ;
productid=354236%28
Lifesciences %29#  ;
Pancréatine de pancréas porcinSigma AldrichP3292 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en®ion=BE
35 mm Boîtes de culture tissulaire, polystyrène, stérileBD Falcon353001https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630
Éthanol absolu AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. réactif analytiqueVWR Chemicals20821296https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP
vimentine monoclonale de lapin (D21H3)Cell Signalling Tech#5741Utiliser 1/500.
http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741
souris monoclonale anti-cytokératine panhumaineSigma AldrichC2562Utilisation 1/1 000.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en& ; region=BE
Solution de paraformaldéhyde, 4 % dans PBSAffymetrix19943http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1
Triton X-100Sigma AldrichX100http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en®ion=BE&gclid=
Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw
BEiQAI8rq
879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f
8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k
8P8HAQ
Sérum de chèvreSigma AldrichG9023http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en®ion=BE
Chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488Thermo ScientificA-11034http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& ;
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Anti-souris chèvre Alexa Fluor 594Thermo ScientificA-11032http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& ;
resultPage=1&
resultsPerPage=15&
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priorSearchTerms=&
searchMode=mot-clé&
productTypeSelect=anticorps&
targetTypeSelect=
antibody_secondary&
species=ltechall&
keyword=594#filters=genericsort2 : \ %22Capra %20hircus\ %22 ;; générique6 :^\ %22Mus %20musculus\ %22$ ;;
Support de montage VECTASHIELD avec DAPIVector LaboratoriesH-1200http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html
DPBS, avec calcium et magnésiumGibco14040174https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133
cyclique

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