A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

Résumé

Nous présentons dans l'étude d'un nouveau test basé sur la fluorescence en utilisant des lymphocytes dérivés d'une souris transgénique. Ce dosage est adapté pour le criblage à haut débit (HTS) de petites molécules dotées de la capacité de l'une ou l'inhibition de la promotion de l'activation des lymphocytes.

Résumé

Le criblage à haut-débit (HTS) est actuellement le pilier pour l'identification des entités chimiques capables de moduler les réactions biochimiques ou processus cellulaires. Avec l'avancement des biotechnologies et le potentiel translationnelle élevé de petites molécules, un certain nombre d'approches novatrices dans la découverte de médicaments ont évolué, ce qui explique le regain d'intérêt dans l'utilisation des HTS. Le domaine de l'oncologie est actuellement la zone la plus active de recherche pour le dépistage des drogues, sans percée majeure faite pour l'identification de nouveaux composés immunomodulateurs ciblant les complications liées à la transplantation ou d'affections auto-immunes,. Ici, nous présentons un roman dans le test murin in vitro des lymphocytes fluorescents à base facilement adapté pour l'identification de nouveaux composés immunomodulateurs. Cet essai utilise des cellules T ou B dérivées d'une souris transgénique dans laquelle le promoteur conduit l'expression Nur77 GFP sur T- ou la stimulation du récepteur des lymphocytes B. Comme l'intensité de la GFP reflète laactivation / activité transcriptionnelle de la cellule cible, notre test définit un nouvel outil pour étudier l'effet du composé (s) donnée sur les réponses cellulaires / biologiques. Par exemple, un criblage primaire a été réalisée en utilisant 4,398 composés en l'absence d'une "hypothèse cible", qui a conduit à l'identification de 160 résultats potentiels présentant des activités immunomodulatrices. Ainsi, l'utilisation de ce test est approprié pour les programmes de découverte de médicaments explorant de grandes bibliothèques chimiques avant de poursuivre des études in vitro / in vivo de validation.

Introduction

criblage à haut débit (HTS) est une stratégie éprouvée largement adoptée pour l'identification de nouvelles molécules thérapeutiques ou pour le repositionnement de médicaments approuvés par la FDA dans de nouvelles indications médicales. ¹ Jusqu'à présent, le succès HTS obtenu peut être mesurée par la pléthore de médicaments précédemment découverts. Par exemple, l'inhibiteur de tyrosine-kinase lapatinib utilisé pour le traitement du cancer du sein, la sitagliptine; une dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4), l'inhibiteur utilisé comme un médicament anti-hyperglycémique, et la Bcr-Abl inhibiteur de tyrosine kinase dasatinib oral pour le traitement de la leucémie myéloïde chronique représentent quelques exemples d'une liste de médicaments approuvés initialement découverts par HTS. ² Bien que la productivité de l'industrie pharmaceutique a récemment souffert d'un manque dans la découverte de nouvelles entités chimiques, la probabilité de découverte de médicaments réussie peut être améliorée grâce à une augmentation du nombre de candida pré-cliniquetes présentant des propriétés biologiques / biochimiques modulateurs. En conséquence, le développement de nouveaux tests HTS adaptés pour le criblage phénotypique pourrait offrir le potentiel de fournir des outils pharmacologiques importants pour la découverte de nouveaux hits de drogue. ^{3, 4, 5, 6} En outre, HTS peuvent maintenant être effectuées à un rythme plus rapide en raison de transformations technologiques importantes au cours des dernières années , y compris les installations sur mesure flexibles robotiques, de nouvelles technologies de lecture et une miniaturisation poussée. ^{2, 7} Parmi les facteurs qui contribuent à l'intérêt croissant pour l'utilisation du dépistage phénotypique (aka l' avant de la pharmacologie) est la perception qu'en se concentrant sur les effets fonctionnels plutôt que des hypothèses réductionnistes simplificatrices concernant les cibles moléculaires (dépistage / réactions biochimiques par objectifs) est plus probable sho efficacité clinique w. Ainsi, le dépistage phénotypique tient la promesse de découvrir de nouveaux composés potentiellement thérapeutiques et les voies moléculaires des maladies actuellement incurables. ²

Pour bien identifier des inhibiteurs ou activateurs pour une cible moléculaire donnée ou la fonction cellulaire, un dosage très sensible et fiable est nécessaire pour faire la différence entre succès de bonne foi et de faux positifs. Donc, ce qui fait un bon dosage? La qualité d'un dosage donné doit être jugé par le premier rapport signal-sur-bruit (par un facteur réfléchi Z). ⁸ Deuxièmement, l'effet ciblé ou le but de l'écran doivent être clairement établies. Par exemple, les approches basées sur les cellules fonctionnelles peuvent offrir des avantages significatifs pour le dépistage du récepteur par rapport à un essai spécialement conçu pour évaluer la liaison du ligand-récepteur. La raison pour cela est que cette dernière approche ne peut pas différencier entre les ligands agonistes et antagonistes.ss = "référence externe"> 9 En revanche, une approche basée sur des cellules est susceptible d'être plus efficace que la fonction du récepteur peut être évalué directement en un phénotype biologique (prolifération, arrêt du cycle cellulaire, l' apoptose et / ou la différenciation). Cependant, il faut noter que les tests biochimiques peuvent fournir des avantages significatifs par rapport aux essais phénotypiques car ils empiètent sur une cible intracellulaire spécifique. Un dosage biochimique bien optimisé aura généralement moins de dispersion de données qu'un dépistage phénotypique tout en simplifiant la suite des enquêtes relatives au mécanisme moléculaire de la drogue de l'action. Cependant, l'inconvénient majeur de tests d'objectifs ou biochimiques est le risque d'amplifier le taux de résultats faussement positifs qui peuvent influer sur les cibles non spécifiques lorsqu'il est testé dans un système biologique (perte de la spécificité étudiée à l'origine dans le dosage biochimique). ¹⁰ Bien que d' un point de coupure bien établie entre résultats négatifs et positifs peut réduire le nombre de faux positifs in le criblage primaire, l'utilisation d'un système physiologiquement pertinent mimant l'environnement cellulaire natif telles que des cellules intactes, des tissus entiers ou animal entier reste le noyau du pendule de la conception de l'essai. Par conséquent, le dépistage phénotypique permet la découverte de plomb avec des effets phénotypiques biologiques / souhaitables pour les maladies sans cibles de médicaments identifiés sans avoir une connaissance préalable de l'activité du composé ou le mode d'action. ¹¹

L'étude de ce document concerne le développement et le test d'un dépistage phénotypique optimisé et reproductible sur la base de deux éléments importants: un modèle de souris disponible dans le commerce et une sous-famille cluster de composés chimiques. En ce qui concerne le modèle animal, le test repose sur l'utilisation de lymphocytes provenant d'une souche de souris (Nur77 ^GFP) hébergeant un chromosome artificiel bactérien contenant une cassette dans laquelle l'expression de la protéine fluorescente verte (GFP) est entraîné par epromoteur e Nur77. ¹² La caractéristique de cette stimulation est basée sur le fait que Nur77 est un gène précoce immédiat régulée à la hausse suivant récepteur des lymphocytes T (TCR) ou un récepteur de lymphocyte B (BCR) de stimulation. ¹² En ce qui concerne la méthode de dépistage lui - même, une approche a été utilisée pour aider à éviter la projection d'analogues triviales tout en minimisant le temps nécessaire pour évaluer une grande bibliothèque chimique (> 10 ⁵ composés). Pour ce faire, une base de données de composés chimiques sélectionnés par les chimistes médicinaux en utilisant des outils de criblage virtuel a été exploitée pour identifier des composés topologiquement similaires en utilisant des structures de semences actives connues comme des références. Cette approche nous a permis de cribler 4,398 composés représentant une bibliothèque globale de plus de 136.000 entités chimiques.

Protocole

Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par le Comité de l'Université de Montréal le soin des animaux. Les souris ont été euthanasiées par inhalation de CO ₂ graduelle jusqu'à ce qu'aucun des signes vitaux n'a été observé suivi par dislocation cervicale. La procédure a été effectuée par une personne certifiée pour garantir que les animaux ont été euthanasiés d'une façon humaine et conformément aux recommandations du Conseil canadien de protection des animaux.

1. Préparation des splénocytes Medium and Flow-cytométrie Buffer

1. Effectuez toutes les étapes sous une hotte biologique 70% d'éthanol nettoyés.
2. Retirer 70 ml de Roswell Park Memorial Institute préchauffée (RPMI) 1640 moyen 1x (disponible dans le commerce et fourni dans filtrés 500 ml de volume des flacons stériles) et placer dans un tube stérile. Le milieu enlevé sera utilisé plus tard dans le protocole.
3. Compléter les 430 ml restants de RPMI 1640 1x avec 50 ml inactivé de sérum bovin fœtal (FBS), 5 ml de pénicilline / streptomycine, 5HEPES ml, 5 ml d'acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium, 5 ml et 0,05 ml filtrées (1M) 2-mercaptoéthanol.
   NOTE: moyenne de splénocytes Pré-chaud à l'aide d'un bain-marie réglé à 37 ° C pour éviter les cellules de chaleur choquant. Ceci est important pour éviter l'induction de l'apoptose cellulaire.
4. Pour préparer le tampon par cytométrie de flux, ajouter 2 ml de FBS à 98 ml du tampon phosphate salin (PBS) et conserver au réfrigérateur jusqu'à utilisation (de préférence dans les trois jours).

2. Génération de splénocytes suspension cellulaire de Nur77 ^GFP Spleens souris

1. Un isolat septique ou la rate d'une vieille femme de 6-8 semaines souris Nur77 ^GFP.
   1. Pour ce faire, travailler sous hotte stérile. Faire tremper les sacrifiés souris fourrure, des ciseaux et des pinces à 70% d'éthanol.
   2. Poser la souris sur son côté droit, couper la peau et les muscles dans le quadrant supérieur gauche abdominale. Inspecter la zone d'incision pour localiser visiblement la rate puis le découper. Gardez la rateen milieu de splénocytes sur la glace jusqu'à ce que prêt à effectuer l'étape suivante.
2. Placez la rate (s) dans une boîte de 10 cm culture Pétri ² cellules contenant 5 ml de milieu de splénocytes préchauffé.
3. Piler la rate à l'aide d'un piston de seringue stérile jusqu'à ce que la solution soit trouble. Une matrice de collagène de la rate doit rester à la fin de la procédure.
4. Après une vaste brassage en milieu de splénocytes, de recueillir la suspension cellulaire et le passer à travers un tamis cellulaire de 70 um placé sur un tube de 50 ml pour filtrer-tout débris ou des caillots.
5. Centrifuger à 500 xg pendant 5 min. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 2-3 ml de tampon de lyse interne produit commercial ou de globules rouges. Après pipetage (2-3 fois) laisser le reste de suspension pour 20-30 s.
6. Ajouter 5 ml de PBS ou un tampon approprié de choix puis centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 500 x g.
7. Retirer le surnageant (devrait être de couleur rouge car il contient lysée rouge bles cellules Lood) et remettre en suspension le culot cellulaire dans 2 ml de milieu de splénocytes.
8. L'utilisation d'un hémocytomètre, compter le nombre de cellules colorées avec du bleu trypan faire la différence entre (nécrotiques) cellules vivantes et mortes.

3. T-cellule d'isolement de la suspension cellulaire splénocytes

1. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 500 x g. Remettre en suspension les cellules dans un milieu RPMI exempt de sérum (50 ml) provenant de l' étape 1.3 pour obtenir une concentration cellulaire de 10 x 10 ⁶ cellules / ml.
2. Transférer les cellules à un tube 5 ml de polystyrène et mettre de côté une partie aliquote de 100 pi de splénocytes de pureté évaluation / comparaison à la fin de l'étape de purification.
3. Ajouter du sérum de rat normal à la suspension cellulaire à 50 ul / ml, suivi par un anticorps T d'isolement des cellules cocktail (50 ul / mL).
4. Mélanger la suspension cellulaire et laisser reposer pendant 10 minutes. Cette étape permet au cocktail d'anticorps pour lier toutes les cellules non désirées.
5. Ajouter les sphères rapides streptavidine (aimantperles IC) pendant 2,5 minutes, puis amener le volume à 2,5 ml en utilisant le milieu sans sérum.
6. Placer le tube dans un aimant d'isolement des cellules pendant 3 min.
7. Transférer la suspension de cellules T dans un nouveau tube de polystyrène en maintenant l'aimant et en versant la solution en un seul mouvement.
   NOTE: La suspension isolée contient les cellules T purifiées. Toutes les cellules non désirées sont maintenus sur le côté du tube lié aux billes magnétiques de streptavidine.
8. Compter les cellules T isolées en utilisant du bleu trypan et un hémocytomètre.
   NOTE: A cette étape , la pureté des cellules T isolées peuvent être vérifiées (facultatif) en analysant le pourcentage d'événements CD3 ⁺ avant et après l' isolement des cellules T par cytométrie de flux. ¹³
   1. En bref, centrifugeuse 1 ml de splénocytes suspension cellulaire à 500 x g. Jeter le surnageant et les cellules en suspension dans un tampon de cytométrie de flux à une concentration de 1 x 10 ⁶ cellules / ml.
   2. Ajouter fluorescent marqué anti-nymee CD3 anticorps à une concentration de 1: 100. Incuber à 4 ° C pendant 30 min. Laver une fois, de centrifugation et remettre en suspension dans un tampon cytométrie de flux (400 pi) pour une analyse par cytométrie de flux.

4. B-cellule d'isolement de la suspension cellulaire splénocytes

1. Suivre le même protocole que celui décrit pour les cellules T (étapes 3,1 à 3,8) mais en utilisant un kit d'isolement de cellules B. Pour l' évaluation de la pureté, utiliser l'anticorps CD19 au lieu de l'anticorps CD3. ¹³
   1. L'évaluation de la pureté (facultatif), en utilisant l'anticorps CD19 à la place de l'anticorps CD3. 1 mL de centrifugeuse splénocytes suspension cellulaire à 500 x g. Jeter le surnageant et les cellules en suspension dans un tampon de cytométrie de flux à une concentration de 1 x 10 ⁶ cellules / ml.
   2. Ajouter fluorescence étiquetée anticorps anti-souris CD19 à une concentration de 1: 100 et incuber à 4 ° C pendant 30 min. Laver une fois, centrifugeuse et remettre en suspension dans un tampon par cytométrie de flux (400 pi) foanalyse de r par cytométrie de flux.

5. L'activation des lymphocytes T et l'induction de l'expression de GFP

1. Ensemencer les cellules T, en suspension, dans une plaque de 96 puits à fond rond à une concentration de 2,5 x 10 ⁵ cellules / puits.
2. Ajouter interleukine recombinante (IL) -7 à 2 ng / ml et perles CD3 / CD28 magnétiques (25 pi / 10 ⁶ cellules). Gardez une partie des cellules T non traités avec des perles pour servir de témoin négatif pour les mesures ultérieures qui représentent les cellules T non activées.
3. Douze heures plus tard, récolter les cellules de la plaque de 96 puits T par pipetage doucement la suspension de cellules dans chaque puits et vers le bas pour briser les complexes billes-cellules / agrégats. Recueillir la suspension de tous les puits dans un tube de polystyrène 5 mL.
4. Placer le tube contenant la suspension à l'intérieur du même aimant d'isolement des cellules utilisées précédemment pour la purification des cellules T ou B et laisser reposer pendant 5 min.
5. Transférer le int T de suspension cellulaireoa nouveau tube de polystyrène en maintenant l'aimant et en versant la solution en un seul mouvement.
6. Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de splénocytes frais pour obtenir une concentration de 2 x 10 ⁶ cellules / ml.
7. Évaluer GFP intensité d'expression par cytométrie de flux (en option pour le contrôle de la qualité) à 12 à 24 h post-stimulation en comparaison avec des cellules non-T activées. ¹²
   REMARQUE: La fluorescence de la GFP est intrinsèque aux cellules T Nur77 ^GFP et se manifeste lors de l' activation réussie du RCT. ¹²
8. Pour l'évaluation de la viabilité et de l'activation (en option), par microscopie, colorer les cellules activées avec Hoechst 30 minutes avant l'analyse à une concentration de 0,2 ug / ml. Ajouter un volume adéquat de la suspension cellulaire sur une lame de couverture ou à un puits d'une plaque à 384 puits noire face à fond plat et examiner au microscope à fluorescence pour évaluer les cellules vivantes. Les cellules mortes ne conserveront pas nucléairecoloration. ¹⁴

6. L'activation des cellules B et l'induction de l'expression de GFP

1. En utilisant un ballon de culture T-25, remettre en suspension les cellules isolées B à 1 x 10 ⁶ cellules / ml.
2. Ajouter des anti-souris IgG / IgM (H + L) à 10 ul / ml et CD40L recombinant à une concentration de 200 ng / ml. Gardez une partie des cellules B non traitées pour servir de témoin négatif pour les mesures ultérieures (représentant les cellules B non activées).
3. Évaluer GFP intensité d'expression par cytométrie de flux à 12 ou 24 h post-stimulation en comparaison avec des cellules non activées B.
   REMARQUE: La fluorescence de la GFP est intrinsèque aux cellules ^GFP Nur77 B et se manifeste lors de l' activation réussie du BCR. ¹²
4. Pour l'évaluation de la viabilité et de l'activation (en option), par microscopie, colorer les cellules activées avec Hoechst 30 minutes avant l'analyse à une concentration de 0,2 ug / ml. Ajouter un volume adéquat de la suspension cellulaire àune lame de couverture ou à un puits d'une plaque à 384 puits noire face à fond plat et d'examiner sous un microscope à fluorescence pour évaluer les cellules vivantes. Les cellules mortes ne conserveront pas une coloration nucléaire. ¹⁴

7. criblage à haut débit des petites molécules

1. Préparer une suspension cellulaire à 2 x 10 ⁶ cellules / ml des cellules T ou B activées (billes magnétiques ou des anticorps / CD40L) ou des groupes non activés.
2. Plate 75.000 cellules / puits dans une plaque à 384 puits (volume de 40 pi). Utiliser une plaque à 384 puits noire face à fond plat ou d'une lamelle de microscope pour la viabilité et l'activation d'évaluation par microscopie à fluorescence (en option étape de contrôle de la qualité avant HTS) en utilisant Hoechst tache (voir les étapes 5.8 et 6.4 pour plus de détails). ¹⁴
3. Manuellement ou en utilisant un système automatisé, ajoutez les médicaments de choix (dissous dans 0,5% de DMSO) à chaque puits.
4. Ajouter le véhicule (DMSO) à positif (activé) et négatif (non-activée) Les puits de contrôle. Ajuster la concentration du DMSO jusqu'à un maximum de 0,5%.
5. Laisser incuber les plaques pendant 24 h (ou la durée d' incubation de choix) à 37 ° C et 5% de CO _2.
6. Le jour de l'examen, on dilue la solution de colorant 33342 de Hoechst (1:. 3333, par exemple , ajouter 10 ul des cellules dans les plaques à 384 puits pour générer un volume total de 50 ul). Tacher 30 min avant l'analyse de la GFP, par addition d'une solution de Hoechst pour obtenir une concentration de 0,2 ug / ml.
7. pipette doucement les cellules de haut en bas pour obtenir une distribution homogène dans chaque puits.
   Remarque: Cette étape est importante dans le cas de la distribution des médicaments (étape 7.3), en utilisant un système automatisé, les cellules ont tendance à s'accumuler sur un côté du puits, opposée à la direction de l'écoulement.
8. Faites tourner les plaques à 45 xg pendant 3 min à température ambiante.
9. Laissez les plaques pour se reposer pendant 15 min à température ambiante.
10. Effectuer plaque (s) de lecture-out, en utilisant les scre à contenu élevé confocale automatiséssystème renfor- (HCS). ¹⁵ Charger la plaque sur la machine. Définir l'objectif à 40X ou plus grossissement. Utilisez la caméra n ° 4 pour Hoechst (lampe UV) et la caméra n ° 1 pour la GFP (laser 488). Mettre en place la machine à lire 6-10 champs par puits. Réglez la machine à faire deux lectures séquentielles par champ à 488 nm (pour lire GFP) et la lumière UV (à lire Hoechst). Définir l'objectif à 40X ou plus grossissement.
    NOTE: Le système est un microscope informatisé qui ne nécessite aucun réglage. La distance focale, l'intensité de la lumière incidente et le temps d'exposition sont tous les réglages automatiquement par la machine.

Résultats

Conception de l'essai HTS

Deux facteurs importants ont été pris en considération lors de la conception de l'essai ici fluorescent. Tout d' abord, nous avions besoin de reproduire un état physiologique dans lequel l' activation des lymphocytes T ou B représenterait une maladie (par exemple de la maladie du greffon contre l'hôte). En second lieu, l'évaluation de l'activation cellulaire doit être réalisée en utilisant une m...

Discussion

Plusieurs méthodes de lecture ont été exploitée pour le développement des sensibles et fiables HTS. Ceux-ci comprennent colorimétriques, luminescents ou fluorescents méthodes. Bien que les méthodes colorimétriques sont simples à mettre en place, ils nécessitent plusieurs ajouts de produits chimiques qui peuvent interférer ou perturber les cellules testées. ²³ En outre, ils ne permettent pas une évaluation dynamique d'une réponse biologique comme l'effet pharmacologique est évaluée à un ef...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris Nur77GFP	La	souche de souris de laboratoire Jackson n° 016617	Une colonie interne a été établie dans notre animalerie.
96 plaques de culture wells-U, stériles	VWR International	10062-902	Activation des lymphocytes T à l’aide des billes magnétiques
70 & micro ; Crépine à cellules m, stérile	Corning Inc.	352350	Génération de splénocytes suspension cellulaire
5 ml tubes à fond rond en polystyrène, stérile	Corning Inc.	352058	Génération de splénocytes suspension cellulaire
50 ml Tubes à fond conique en polypropylène, stériles	VWR International	89039-656  ;	Génération de suspension cellulaire de splénocytes
Seringue de 10 ml sans aiguille, stérile	Becton, Dickinson and Company	305482	Pour écraser la rate
Fiole de culture T-25	Greiner Bio-One	690 175	Pour inculquer les lymphocytes B lors de l’activation
Boîte de culture cellulaire de 5 ml, stérile	Greiner Bio-One	627 160	Pour écraser la rate
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	WISENT Inc.	450-200-EL  ;   ;	Composant du milieu splénocytaire
RPMI 1600 avec bicarbonate de sodium et L-glutamine	WISENT Inc.	350-002-CL  ;	Composant du milieu splénocytaire
Acides aminés non essentiels MEM	WISENT Inc.	321-010-EL  ;	Composant du milieu splénocytaire
HEPES acide libre 1 M	WISENT Inc.	330-050-EL  ;	Composant du milieu splénocytaire
Solution de pyruvate de sodium (100mM)	WISENT Inc.	600-110-EL  ;	Composant du milieu splénocytaire
Sérum fœtal bovin (FBS)	WISENT Inc.	080-910  ;	Composant du milieu splénocytaire et tampon de cytométrie en flux
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	WISENT Inc.	311-010-CL	Composant du tampon de cytométrie en flux
2-Mercaptoéthanol (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023	Composant du milieu splénocytaire
Kit d’isolement des lymphocytes T	Stemcell Technologies	19851	Pour isoler les lymphocytes
T Kit d’isolement des lymphocytes B	Stemcell Technologies	19854	Pour isoler les lymphocytes B
Activateur T de souris CD3/CD28 superparamagnétique billes	Thermo Fisher Scientific	11452D	Pour activer les lymphocytes T  ;
Aimant d’isolement cellulaire	Stemcell Technologies	18000	Pour isoler les lymphocytes T et retirer les billes magnétiques.
AffiniPure F(ab')2 Fragment de chèvre anti-souris IgG + IgM (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.	115-006-068	Pour stimuler les lymphocytes B
Murin recombinant IL-7	Peprotech	217-17  ;	Pour soutenir la survie des lymphocytes T pendant l’activation
CD40L recombinant	R& D Systems	8230-CL/CF	Pour stimuler les lymphocytes B
Anticorps anti-CD3 de souris	BD Pharmingen	561799	Pour colorer les lymphocytes T pour la cytométrie en flux
Anticorps anti-CD19	de souris BD Pharmingen	553786	Pour colorer les lymphocytes B pour la cytométrie en flux
Biomek FXp	PerkinElmer Inc.	A31842	Pour remettre en suspension les cellules après une incubation de 24 heures Système
de dépistage à haut contenu Opera Phenix	PerkinElmer Inc.	HH14000000	Pour analyser le signal GFP/Hoechst