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Article de méthode

Swab Méthode d'échantillonnage pour la détection des norovirus humains sur les surfaces

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DOI :

10.3791/55205

⸱

6 février 2017

 ,  , 
1Division of Viral Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

Dans cet article

Résumé

Une méthodologie d’échantillonnage basée sur la macromousse a été développée et évaluée pour la détection et la quantification des norovirus sur les surfaces dures de l’environnement.

Résumé

Les norovirus humains sont une cause majeure de l'épidémie et la gastro-entérite sporadique dans le monde entier. Parce que la plupart des infections sont soit répartis directement par la voie de personne à personne ou indirectement par l'intermédiaire de surfaces ou de la nourriture de l'environnement, matières contaminées et les surfaces inanimées sont des véhicules importants pour la propagation du virus au cours des flambées de norovirus.

Nous avons développé et évalué un protocole utilisant des tampons de macromousse pour la détection et le typage des norovirus humains des surfaces dures. Comparé avec des tampons de fibres à pointe ou des lingettes antistatiques, des tampons de macromousse permettent la récupération du virus (plage de 1,2 à 33,6%) des surfaces de siège de toilette jusqu'à 700 cm 2. Le protocole comporte les étapes d'extraction du virus à partir des tampons et une plus grande concentration de l'ARN viral en utilisant des colonnes de centrifugation. Au total, 127 (58,5%) des 217 échantillons de frottis qui avaient été recueillies à partir de surfaces à bord des navires de croisière et les établissements de soins de longue durée où norovirus gastro-entérite avait étérapporté testé positif pour GII norovirus par RT-qPCR. 29 d'entre eux (22,8%) pourrait être génotypés avec succès. En conclusion, la détection des norovirus sur des surfaces environnementales en utilisant le protocole que nous avons développé peut aider à déterminer le niveau de contamination de l'environnement pendant les épidémies, ainsi que la détection du virus lorsque les échantillons cliniques ne sont pas disponibles; il peut également faciliter le suivi de l'efficacité des stratégies d'assainissement.

Introduction

Les norovirus humains sont une cause majeure de l' épidémie et de gastro - entérite aiguë sporadique dans le monde entier 1, 2, 3. Le virus est extrêmement contagieux et la transmission se fait par personne directement à l'interaction personne ou indirectement par le contact avec des aliments contaminés, l'eau ou des surfaces environnementales. Les norovirus peuvent être versées pour des périodes prolongées et prolongé la survie du virus sur des surfaces environnementales a été documentée 1, 2, 3. Au cours de l' excrétion de pointe, des milliards de particules virales sont libérées par gramme de fèces, vomi et contient également un nombre suffisant de particules virales pour causer une infection 4, 5, 6, 7, 8,ef "> 9, 10. En outre, le transfert du virus entre les surfaces inanimées et la peau humaine peut se produire facilement 2, 11, 12. Par conséquent, la surveillance de la contamination de l' environnement peut aider dans les enquêtes sur les éclosions et à évaluer l'efficacité du nettoyage et procédures de désinfection.

Plusieurs protocoles d'échantillonnage ont été décrits pour la détection du rotavirus, le coliphage MS2, calicivirus félin (FCV) et P22 du bactériophage 13, 14, 15, 16. Cependant, les conditions de validation décrites dans ces études, y compris la dessiccation rapide (<1 h) et de petites surfaces (25 x 100 cm 2), peuvent ne pas représenter adéquatement les paramètres sur le terrain. En outre, le faible taux de contamination de enviro attendueles surfaces nnement exigent des protocoles qui sont capables de détecter de très peu de particules virales.

Nous avons développé une méthode d'échantillonnage de surface à base macromousse pour la détection et le typage des norovirus. Cette méthode a été validée lors de plusieurs éclosions de norovirus. Le protocole comprend 1) la manière de recueillir des échantillons d'écouvillons des surfaces environnementales (2) la façon de maintenir la meilleure intégrité des échantillons lors de la collecte et l'expédition au laboratoire, et 3) les tests de laboratoire et le typage des norovirus.

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Protocole

1. Swab échantillonnage dans le domaine

  1. Porter une paire de gants propres.
  2. Mesurer la taille de la zone d'échantillonnage sans toucher la surface en utilisant un ruban à mesurer ou d'une règle. Essayez d'estimer la superficie aussi précisément que possible et de remplir un formulaire de rapport (tableau supplémentaire 1).
  3. Vérifiez le kit de prélèvement pour les fuites éventuelles et le transport des sacs de prélèvement de l'étiquette et des kits d'écouvillon.
  4. Déplacer l'écouvillon dans la zone d'échantillonnage comme suit: un coup dans le sens horizontal, d'un seul coup dans le sens vertical, et d'un seul coup dans une direction diagonale. Ne pas tamponner une aire de surface supérieure à 700 cm2.
  5. Placez chaque écouvillon dans un tube et serrer le bouchon.

2. Stockage et transport des écouvillons au laboratoire

  1. Maintenir des tampons à 4 ° C pendant jusqu'à 48 heures. Si le stockage pendant de longues périodes est nécessaire, stocker les tampons à -20 ° C (ou -70 ° C).
  2. Gardez les tubes à 0-4 ° C (c.. , Utiliser des compresses froides) dans un contenant isolé pendant le transport vers le laboratoire et le navire en 24-48 h de collection.

3. Virus Concentration, Viral RNA Extraction et purification

NOTE: Toutes les étapes de centrifugation utiliser une centrifugeuse de dessus de table à 5000 xg pendant 5 min à température ambiante, sauf indication contraire. Soyez très prudent lorsque vous travaillez avec le tampon universel extraction d'acide nucléique (UNEX). Porter des lunettes ou un écran facial.

  1. Repérer un 15 tube de ml et une colonne ARN Midi pour chaque échantillon. Inclure un contrôle négatif d'extraction dans chaque expérience.
  2. Pour préparer la solution Lysis pour 10 écouvillons, mélanger 25 ml de tampon UNEX avec 25 ml de PBST (PBS pH 7,2 contenant 0,02% de Tween-80).
  3. Ajouter 50 pi de coliphage MS2 suspension (10 6 UFP / ul) à 50 ml d' une solution de lyse.
  4. Placer un écouvillon dans un tube de 15 ml et ajouter 5 ml de solution Lysis. Mélanger et incuber pendant 10 min à température ambiante.
  5. Ajouter 5 ml d'éthanol à 100% à chaque tube et vortexer pendant 10 secondes.
  6. Retirez délicatement l'écouvillon du tube de 15 ml (il contient du tampon UNEX) pressant doucement contre le côté du tube pour éliminer l'excès de liquide, puis jeter l'écouvillon. Les volumes restants doivent être compris entre 9-10 mL.

4. La colonne Midi Nucleic Acid Extraction virale

  1. Transférez soigneusement 4,5 mélange / éthanol UNEX mL de l'étape 3.6 sur une colonne midi, centrifugeuse et jeter le filtrat.
  2. Chargez encore 4,5 ml du même mélange sur la même colonne, centrifugeuse, et jeter le filtrat.
  3. Pour le premier lavage, ajouter 3,5 ml de 70% d'éthanol sur le Midi colonne, centrifugeuse et jeter le filtrat.
  4. Pour le second lavage, ajouter un autre 3,5 ml d'éthanol à 70% sur la colonne Midi. Centrifugeuse et jeter le filtrat.
  5. Pour le sèche-spin, centrifuger les colonnes Midi pour éliminer toute trace d'éthanol (ce qui peut affecter négativement votre récupération de l'ARN viral).
  6. Placer la colonne Midi dans un nouveau tube de 15 ml de la centrifugeuse. Ajouter 250 pi de tampon d'élution sur la colonne Midi; attendre 1 min avant centrifugation pour obtenir la meilleure récupération de l'ARN viral.
  7. Stocker l'acide nucléique extrait à -70 ° C ou procéder immédiatement à l'étape 5.

5. Concentration virale acide nucléique en utilisant l'ARN propre et Concentrateur Kits

  1. Ajouter 500 pi de RNA Binding Buffer à 250 pi d'ARN élué à l'étape 4.7 ci-dessus et vortex pendant 10 s.
  2. Ajouter 750 pi 100% d'éthanol et vortex pendant 10 s.
  3. Etiqueter une colonne spin pour chaque échantillon. Chargez l'échantillon de 750 pi sur une colonne de spin.
  4. Centrifuger les colonnes de centrifugation à 12 000 x g pendant 1 min. Jeter l'écoulement.
  5. Chargez les 750 pi restants sur une colonne et centrifuger à 12000 xg pendant 1 min.
  6. Pour le pré-lavage, ajouter 400 pi de tampon ARN Prep à chaque colonne et centrifuger à 12000 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement.
  7. Pour le premier lavage, ajouter 800 ul d'ARN tampon de lavage à chaque colonne et centrifuger à 12000 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement.
  8. Pour le second lavage, ajouter 400 ul d'ARN tampon de lavage pour faire tourner la colonne et centrifuger à 12 000 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement.
  9. Pour le sèche-spin, centrifuger la colonne de centrifugation pour éliminer toute trace de tampon de lavage à 12.000 xg pendant 2 min.
  10. transférer soigneusement la colonne de spin à un tube propre de 1,5 ml.
  11. Ajouter un tampon d'élution de 25 ul sur la colonne de centrifugation et laisser incuber pendant 1 minute à température ambiante. Cela permettra d'accroître la récupération de l'ARN viral à partir de la colonne.
  12. Recueillir l'ARN par centrifugation de la colonne de centrifugation à 10.000 g pendant 1 min.
  13. Soit passer directement à RT-qPCR (étape 6) ou de l'ARN du magasin à -70 ° C.

6. Mutiplex RT-qPCR Détection de génogroupe I et II norovirus, et Coliphage MS 2 (tableau complémentaire 2)

  1. surfaces de travail propres, pipettes, et les centrifugeuses avec une solution de décontamination RNase pour réduire la contamination possible.
  2. Décongeler réactifs RT-qPCR sur la glace. ARN Thaw sur la glace (dans une zone / pièce séparée).
  3. Déterminer le nombre de réactions et d' ajouter au moins 10% de plus d'entre eux (par exemple , si 10 réactions sont nécessaires, faire master mix pour 11).
  4. Vortex composants individuels maître de mixage, à l'exception de 25x RT-qPCR enzyme, pendant 5 s. Mélanger soigneusement l'enzyme en tapotant le tube avec un doigt.
  5. En bref maître centrifugeuse composants de mélange pour 5 s.
  6. Préparer le mélange maître pour la détection par RT-PCR en temps réel des GI norovirus et GII selon les instructions du kit et ajouter des amorces et des sondes oligonucléotidiques spécifiques à norovirus dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse (tableau complémentaire 3).
  7. Mélanger le mélange maître par pipetage 5-10 fois haut et en bas (tourbillonnement est pas recommandé). Aliquoter 22 pi du mélange maître dans chaque puits de PCR en temps réel plaque de 96 puits.
  8. ARN de l'échantillon de Vortexpendant 5 secondes, et de recueillir par une brève (5 s) centrifugation.
  9. Ajouter 3 ul d'échantillon d' ARN et GI et des contrôles positifs GII à la plaque de RT-PCR quantitative (suivi du modèle tableau 2). Ajouter 3 pi de nucléase-freewater dans les puits sans matrice de contrôle (CNT).
  10. Sceller la plaque en temps réel avec un film adhésif optique.
  11. centrifuger soigneusement la plaque en temps réel à 1300 xg pendant 1 min pour éliminer les bulles d'air ou de gouttes liquides qui peuvent être présents dans les puits.
  12. Mettre en place un temps réel de l'instrument PCR et de mise en place des conditions thermocyclage suivantes: 1) étape de RT pendant 10 min. à 45 ° C (2) l'activation de la polymérase Taq, 10 min. à 95 ° C et (3) 45 cycles de 15 s à 95 ° C et 60 s à 60 ° C.

7. Quantification des norovirus dans des échantillons écouvillon

  1. Vérifiez les résultats des contrôles positifs et négatifs pour valider les résultats de RT-qPCR (tableau complémentaire 3).
  2. Déterminer si chaque courbe standard répond à lades valeurs acceptables indiquées dans le tableau complémentaire 2 et calculer l'écart - type global de la courbe standard en utilisant l' équation 1.
    (Équation 1)% d' efficacité = 100 x 10 (moyenne Ct Valeurs-Intercept) / Slope.
  3. Si le logiciel de cycleur thermique PCR ne calcule pas la pente pour chaque courbe standard, déterminer la pente et R 2 valeurs par régression en utilisant un logiciel statistique (par exemple Excel, SPSS ou SAS). En outre, le calcul du rendement de% pour les courbes standard suivantes équation I
  4. Notez le nombre de copies d'ARN calculées par le logiciel thermique du cycleur pour tous les échantillons à tester en fonction des courbes standard qui répondent aux critères spécifiés dans le tableau complémentaire 4. Relancez tous les échantillons avec des courbes standard t chapeau ne répondent pas aux critères ou des contrôles faux positifs. Vérifier les valeurs Ct de coliphage MS2, qui a été ajouté en tant que contrôle interne pour contrôler l'inhibition PCR.
  5. Déterminer le nombre total de copies d'ARN per échantillon par la multiplication du nombre de copies d'ARN calculé lors de l'étape 7.2 par le rapport entre le volume (25 à 50 pi) de l'éluant de l'ARN total à celle de l'ARN (3 à 5 ul) utilisé pour la réaction RT-PCR quantitative. En variante, le calcul de la densité de l' ARN en divisant le nombre total de copies d'ARN par la surface d'objet (cm2) analysée.

8. génotypage des échantillons en temps réel RT-PCR positifs par imbriquée Amplification PCR conventionnelle Hemi

  1. Préparer le premier tour de mélange maître pour chaque ensemble amorce de l'essai de RT-PCR (Tableaux supplémentaires 2 et 5).
  2. Ajouter 5 pi de norovirus ARN positif à 20 pi de mélange maître.
  3. Exécuter la RT-PCR dans les conditions suivantes: (1) étape de RT pendant 30 min à 42 ° C (2) l'activation de la Taq polymérase, 15 min à 95 ° C, et (3) 40 cycles de 30 s à 95 ° C, , 30 s à 50 ° C et 60 secondes à 72 ° C. Après 40 cycles, incuber pendant 10 min supplémentaires à 72 ° C.
  4. Préparer le second tour de mater mélange pour chaque ensemble amorce de l'essai de RT-PCR (Tableaux supplémentaires 2 et 5).
  5. Ajouter 23 ul mélange maître et ajouter 2 pi de produits de RT-PCR du premier tour (de premier tour) à chaque tube (idéalement le produit du premier tour doit être dilué au 1/10 dans de l'eau sans RNase).
  6. Répétez l'étape 8.3.
  7. Préparer un gel d'agarose à 2% dans de l'EDTA 100 ml 1x Tris-acétate (Tris 40 mM, acide acétique 20 mM et EDTA 1 mM, à pH 8,3). Après dissolution de l'agarose par chauffage du mélange dans un four à micro-ondes, ajouter 10 pi de colorant d'acide nucléique pour 100 ml de gel préparé après refroidissement du mélange à 60-70 ° C, verser le gel et insérer les peignes. Laissez le gel reposer pendant au moins 30 min.
  8. Mélanger 15 pi de chaque produit de RT-PCR avec 3 pi de 6x colorant de chargement. Charge 15 pi de chaque échantillon et l'électrophorèse du gel d'agarose à 100 V pendant 1 h.
  9. fragments cible d'accise RT-PCR de taille appropriée (330 pb pour GI et 341 pb pour GII) de l'un de gelD purifier l'ARN en utilisant un kit d'extraction de gel commercial. Le produit de PCR purifié peut maintenant être utilisé pour le séquençage de Sanger.

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Résultats

La figure 1 présente un organigramme du protocole tampon d'échantillonnage. Ce protocole se compose de quatre étapes principales; 1) la collecte d'échantillon, 2) le stockage et le transport d'échantillons, 3) la purification de l'ARN viral et de la concentration, et 4) l'essai de RT-PCR quantitative et génotypage.

figure-results-1

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Discussion

Les norovirus ont une dose infectieuse humaine de 50% entre 18 et 10 3 particules virales 20. Par conséquent, la contamination même de bas niveau des surfaces peut poser un risque pour la santé publique. Plusieurs aspects du protocole écouvillon d'échantillonnage ont été évalués, y compris: 1) différents matériaux écouvillon, 2) écouvillons de condition de stockage pendant le transport, 3) la concentration de l'ARN viral, et 4) coliphage MS2 que le contrôle de l'extraction ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts conflictuels. Les constatations et les conclusions de ce rapport sont celles des auteurs et ne représentent pas nécessairement la position officielle des Centers for Disease Control and Prevention.

Remerciements

Les auteurs n’ont aucune reconnaissance.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom générique des kits
Écouvillon MacrofoamPrehumidened EnviroMax Swabkit  ;Puritan2588060PFUW
Tampon de lyse d>ARNfort  ; CDC Tampon UNEXMicrobiologicsN° MR0501
Extraction de l’ARN Midi ColonneOmega BiotekN° de Cat R6664-02
RNA purification spin columnZymol RNA Clean and Concentrator kit  ;Zymo ResearchCat No R1016
Kit RT-PCR en temps réelAgPath Kit RT-PCR en une étape LifeTechnologiesCat No 4387391
Kit RT-PCR conventionnelQiagen Kit RT-PCR en une étapeKit QiagenCat No 210212
Kit d’extraction de gelQiagen QIAkit d’extraction de gel rapideQiagen KitCat N° 28704 ou 28706
Coliphage MS2ATCCN° de Cat 15597-B1
Transcriptions d’écoulement de l’ARN Plateforme
de PCR en temps réel AppliedBiosystemsModèle ABI 7500
Plaque de réaction optique à 96 puitsThermo ScientificCat N° 4316813
MicroAmp Clear Adhesive Film  ; Thermo ScientificCat No 4306311
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Références

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