Visualisation des interaction protéine-protéine en nucléaire et cytoplasmique Fractions par Co-immunoprécipitation et In Situ Proximité Ligation Assay

Résumé

Les interactions protéine-protéine peuvent se produire à la fois dans le noyau et le cytoplasme d’une cellule. Pour étudier ces interactions, la co-immunoprécipitation traditionnelle et le test moderne de ligature de proximité sont appliqués. Dans cette étude, nous comparons ces deux méthodes pour visualiser la distribution des interactions NF90-RBM3 dans le noyau et le cytoplasme.

Résumé

Les interactions protéine-protéine sont impliquées dans des milliers de processus cellulaires et se produisent dans un contexte spatial distinct. Traditionnellement, la co-immunoprécipitation est une technique populaire pour détecter les interactions protéine-protéine. L’analyse par transfert Western ultérieur est la méthode la plus courante pour visualiser les protéines co-immunoprécipitées. Récemment, le test de ligature de proximité est devenu un outil puissant pour visualiser les interactions protéine-protéine in situ et offre la possibilité de quantifier les interactions protéine-protéine par cette méthode. Semblable à l’immunocytochimie conventionnelle, la technique de ligature de proximité est également basée sur l’accessibilité des anticorps primaires aux antigènes, mais en revanche, la technique de ligature de proximité détecte les interactions protéine-protéine avec une technique unique impliquant la PCR à cercle roulant, tandis que l’immunocytochimie conventionnelle ne montre que la co-localisation des protéines.

Le facteur nucléaire 90 (NF90) et la protéine de motif de liaison à l’ARN 3 (RBM3) ont déjà été démontrés comme partenaires d’interaction. Ils sont principalement localisés dans le noyau, mais migrent également dans le cytoplasme et régulent les voies de signalisation dans le compartiment cytoplasmique. Ici, nous avons comparé l’interaction NF90-RBM3 dans le noyau et le cytoplasme par co-immunoprécipitation et test de ligature de proximité. De plus, nous avons discuté des avantages et des limites de ces deux techniques dans la visualisation des interactions protéine-protéine en ce qui concerne la distribution spatiale et les propriétés des interactions protéine-protéine.

Introduction

Facteur nucléaire 90 (NF90) est une protéine multi-isoforme avec de nombreuses fonctions , y compris la réponse à l' infection virale, la régulation de l' interleukine-2 post-transcription et la régulation de la biogenèse des miARN ^1-3. RBM3 est une protéine de liaison à l' ARN, impliqués dans la traduction et la biogenèse des miARN et peut être induite par divers facteurs de stress , y compris l' hypothermie et l' hypoxie ^4-6. Récemment, nous avons trouvé NF90 et RBM3 dans un complexe protéique ^7. L'interaction de NF90 et RBM3 est essentiel pour moduler la protéine kinase réticulum endoplasmique kinase (PERK) l' activité de l' ARN comme en réponse de la protéine dépliée ^7. Deux NF90 et RBM3 sont situés principalement dans le noyau , mais une faible proportion de NF90 et une navette RBM3 dans le cytoplasme et il se lient les unes aux autres pour des fonctions spécifiques, par exemple pour réguler l' activité PERK. Par conséquent, il est important de visualiser la répartition des interactions NF90-RBM3 dans le compartiment sous-cellulaire, ce qui peut indiquerleurs différents rôles dans le compartiment respectif.

Il y a des décennies, deux hybrides de levure (Y2H) a été développé pour détecter l'interaction entre les deux protéines ^8. Cependant, en raison de la construction artificielle de protéines fusionnées, des résultats faussement positifs ont restreint l'application de cette méthode. Pendant longtemps, la co-immunoprécipitation a été la principale technique pour analyser les interactions protéine-protéine, en particulier dans des conditions endogènes ^9. D'analyser le complexe protéique de co-immunoprécipitation, Western Blot est la technique la plus commode, tandis que la spectrométrie de masse est utilisée lorsque super-sensibilité et la précision sont souhaitées. Au cours des dernières années, un essai de ligature de proximité a été développé comme un nouveau procédé pour détecter des interactions protéine-protéine dans les cellules et les tissus in situ ^10,11.

Ici, nous avons comparé la méthode de co-immunoprécipitation le plus populaire et relativement nouvelle méthode d'essai de ligature de proximité dans la capture NF9l'interaction 0-RBM3 dans les fractions subcellulaires. Nous avons également discuté les avantages et les limites des deux techniques.

Protocole

1. Co-immunoprécipitation

1. Seed HEK293 cellules à 2 x 10 ⁵ cellules par puits dans une plaque à 6 puits dans 2 ml Eagle modifié (DMEM) le supplément de Dulbecco avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 100 U / ml de pénicilline-streptomycine (Pen-Strep) .
2. Cultiver les cellules pendant 48 heures à 37 ° C avec 5% de CO _2.
3. Laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate froide (PBS) à trois reprises. cellules de récolte par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
4. Préparer des fractions nucléaires et cytoplasmiques en utilisant des réactifs commerciaux d'extraction nucléaire et cytoplasmique. Suivez les instructions du fabricant, avec quelques modifications.
   1. En utilisant 3 x 10 ⁶ cellules pour une expérience de co-immunoprécipitation (avec environ 90% de confluence de 3 puits d'une plaque à 6 puits). Ajouter 300 ul solution froide cytoplasmique d'extraction (CER I) et vortex pendant 15 secondes à la vitesse maximale.
   2. Incuber pendant 30 min sur la glace. Pendant l'incubation, Vortex pour toutes les 10 min 5.
   3. Ajouter 16,5 ul froid extraction cytoplasmique solution II (CER II), vortex pendant 5 secondes et incuber pendant 5 min sur la glace.
   4. Vortex pendant 5 secondes et centrifuger à 16 000 xg pendant 5 min à 4 ° C.
   5. Transférer le surnageant (extrait cytoplasmique) dans un nouveau tube pré-réfrigéré, et garder sur la glace jusqu'à utilisation.
   6. Laver culots insolubles (contenant des noyaux) trois fois avec PBS 1 ml à froid à chaque fois par pipetage de haut en bas cinq fois. Retirer PBS après lavage.
   7. Ajouter 150 ul solution d'extraction à froid nucléaire (NER), vortex pendant 15 secondes et incuber 1 h sur la glace. Pendant l'incubation, vortex pendant 15 secondes et la pipette 10 fois avec une pointe de 200 pi toutes les 10 min.
   8. Vortex pendant 15 s et centrifuger à 16 000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
   9. Transférer le surnageant (extrait nucléaire) dans un nouveau tube pré-réfrigéré, garder sur la glace jusqu'à utilisation.
5. Sortir 10% du volume des extraits nucléaires et cytoplasmiques chacun comme entrées.
6. UNEdd PBS froid aux extraits qui restent à un volume final de 1 ml. Gardez sur la glace jusqu'à utilisation.
   NOTE: Pré-compensation est pas indispensable lors de l'utilisation de protéines des billes magnétiques G-conjugué. Cependant, si le fond est élevé, effectuer le pré-compensation en incubant 40 pi de billes de protéine G-conjugués magnétiques (50% en suspension) et 1 ml dilué lysat provenant de cette étape à 4 ° C pendant 30 min sur un rotateur. surnageant séparée (lysat pré-autorisé) à partir de perles avec support magnétique. Jeter les perles.
7. À l'anticorps primaire couple avec des perles magnétiques de protéine G-conjugués, incuber 40 ul de billes de protéine magnétiques G-conjugués (50% en suspension) avec un anticorps 4 ug polyclonal de lapin anti-RBM3 ou de lapin IgG (témoin négatif) dans 200 ul de PBS plus Tween 20 (PBST 0,02% de Tween 20) à température ambiante (TA) pendant 40 min sur un rotateur.
8. perles et surnageant séparé anticorps couplé à un support magnétique, et jeter le surnageant. Laver les billes une fois avec 200 ul de PBST (0,02%).
9. Ajouter 1ml dilué lysats (ou si nécessaire, des lysats pré-autorisé) aux billes, et incuber sur un agitateur à 4 ° C jusqu'au lendemain.
10. Le lendemain, séparer les billes et le surnageant par une grille magnétique, et jeter le surnageant. Laver 3 x 10 minutes avec 0,5 ml de PBST (0,02%) pour chaque tube à 4 ° C sur un agitateur avec une vitesse fixe de 20 tours par minute.
11. Éluer des protéines à partir des billes par l'ajout d'un tampon d'échantillon de 40 pi (tampon échantillon commercial 1x et 50 mM de 1,4-dithiothréitol (DTT)). On chauffe à 70 ° C pendant 10 min. Isoler et les liquides de transfert à un nouveau tube de 1,5 ml.
12. Diluer les lysats d'entrée dans un tampon d'échantillon (concentration finale: 1 x tampon d'échantillon commercial et DTT 50 mM) et on chauffe à 70 ° C pendant 10 min. entrées de charge et protéines immunoprécipitées de la dernière étape à un 4-12% de gel bis-Tris préfabriqué. Le volume de chargement de chaque puits ne doit pas dépasser 20 pi. Effectuer l'électrophorèse dans un tampon 1x exploitation commerciale sur la glace pendant 35 min.
    NOTE: Charge nucléaire et extrait cytoplasmiques dans un rapport de 1: 2 (V / V), ce qui reflète la même quantité initiale de cellules.
13. Transfert des protéines à membrane PVDF dans un tampon 1x transfert commercial à 30 V pendant 2 h à 4 ° C.
14. Membrane de bloc avec 5% de lait écrémé dans du PBST (0,1% de Tween 20) à température ambiante pendant 40 minutes sur un agitateur.
15. Incuber la membrane avec des anticorps primaires (tous deux dilués à 1: 1000) dans du PBST (0,1%) à 4 ° C pendant une nuit.
16. Laver 3 x 10 min avec du PBST (0,1%) à température ambiante sur un agitateur.
17. Incuber la membrane avec la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à des anticorps secondaires anti-souris ou anti-lapin (à la fois dilué dans 1: 5000) dans du PBST (0,1%) à température ambiante pendant 1 h.
18. Laver 3 x 10 min avec du PBST (0,1%) à température ambiante sur un agitateur.
19. Utiliser 0,2 ml chimioluminescence amplifiée (ECL) du mélange de substrat par ^cm2 de membrane, incuber à température ambiante pendant 5 min. Evitez toute la lumière à partir de cette étape, sauf à compter les feux rouges.
20. Jeter liquide et exposer à un film X-ray dans une cassette de film. Développer film à l'aide d'un pr automatique du filmMachine ocessing.

2. Immunocytochimie et Proximité Ligation Assay

1. Semence des cellules HEK293 à 1,5 x 10 ⁴ cellules par chambre dans une chambre 8 de poly-D-lysine lame enduite dans 0,4 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 100 U / ml de Pen-Strep.
2. Cultiver les cellules pendant 48 heures à 37 ° C avec 5% de CO _2.
3. Aspirer le milieu, et fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 10 min à température ambiante.
4. Aspirer PFA, et lavage 3 x 10 min avec 0,5 ml de PBS par chambre.
5. Et perméabiliser les cellules de bloc avec 0,5% de Triton X-100 et 5% de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS à température ambiante pendant 1 h.
6. Incuber avec des anticorps primaires de 0,1% de Triton X-100 et 5% de NGS dans du PBS sur un agitateur à 4 ° C pendant la nuit. Diluer monoclonal de souris anti-anticorps et NF90 polyclonal de lapin anti-anticorps RBM3 1: 100 dans du PBS pendant deux taches. Pour le contrôle négatif, omettre indépendamment l'une des deux anticorps primaires, et omettre les deux anticorps dans un troisième contrôle.
   REMARQUE: Ne pas utiliser le blocage commercial et des réactifs de dilution.
7. Laver 3 x 10 min avec 0,5 ml de PBS par chambre.
8. Sous réserve des protocoles d'essai de ligature immunocytochimie ou de proximité
   1. Immunocytochimie
      1. Incuber à 1: 500 fluorescent anti-souris couplé au colorant vert dilué et d'anticorps fluorescents rouges de colorant couplé anti-lapin secondaire à température ambiante pendant 1 h. Evitez la lumière de cette étape en avant.
      2. Counterstain avec des noyaux 4 ', 6-diamidin-2-phénylindole (DAPI) dilué 1: 5000 dans du PBS à température ambiante pendant 10 min.
      3. Laver 3 x 10 min avec 0,5 ml de PBS par chambre.
      4. Enlever les chambres de la lame de verre et sec. Monter avec 250 μ, moyenne par diapositive de montage.
   2. essai de ligature de proximité
      1. Préparer proximité sondes de dosage de ligature. Mélanger et diluer deux proximité sondes de dosage de ligature (anticorps secondaires anti-souris et anti-lapin attachés avec différents oligonucléotides qui peut ligaturer through l'ajout de deux autres oligonucléotides en solution de ligature) les deux 1: 5 à 0,1% de Triton X-100 et 5% NGS dans PBS, avec un volume total de 320 pl pour une diapositive 8 chambre (environ 40 pi par cm ²⁾ . Incubation à température ambiante pendant 20 min.
      2. Enlever les chambres de la lame de verre et ajouter les sondes diluées. Incuber dans un incubateur humide à 37 ° C pendant 1 heure.
      3. Préparer la solution de ligature. Mélanger 8 pi ligase, 64 pi x 5 ligature stock et 248 ul H ₂ O.
      4. Appuyez sur le liquide de la diapositive, et laver 2 x 5 min dans 1x Wash Buffer A (fourni avec le kit).
      5. Ajouter la solution de ligature et on incube dans un incubateur humide à 37 ° C pendant 30 min.
      6. Préparer une solution d'amplification. Mélanger 4 pl polymerase, 64 pl amplification 5x stock et 252 ul H ₂ O. Évitez la lumière de cette étape en avant.
      7. Appuyez sur le liquide de la diapositive, et laver 2 x 2 min 1x Wash Buffer A.
      8. Ajouter l'amplisolution lification et incuber dans un incubateur d'humidité obscurité à 37 ° C pendant 100 minutes.
      9. Appuyez sur le liquide de la diapositive, et laver 2 x 10 min dans du 1x Wash Buffer B (fourni avec le kit). Laver pendant 1 min dans 0,01x Wash Buffer B.
      10. Sécher la lame et monter avec 250 pi d'un milieu de montage commercial (avec DAPI) par diapositive.
9. Examiner les signaux fluorescents sous un microscope en utilisant une lentille d'oculaire 10X et 20X objectif. L'acquisition d'images par une caméra CCD.

Résultats

La figure 1 montre que NF90 et RBM3 sont tous deux des protéines nucléaires et seulement une petite fraction est présente dans le cytoplasme. Notamment, il y a trois bandes différentes colorées positives pour RBM3. Le plus petit peu moins de 20 kDa reflète la taille correcte de RBM3 (le poids moléculaire prédit de RBM3 est de 17 kDa). L'origine des deux autres groupes reste à étudier. Des expériences de co-immunoprécipitation avec RBM3 que la protéine appât a révélé que ...

Discussion

Il y a plusieurs avantages ainsi que des lacunes pour les deux méthodes. En tant que technique relativement nouvelle, un avantage évident d'essai de ligature de proximité est la possibilité d'élucider les interactions protéine-protéine au niveau d'une seule cellule au lieu d'un lot de cellules hétérogènes. Images à haute intensité et de la résolution (par exemple par microscope confocal) offrent la possibilité pour la quantification par comptage des taches fluorescentes simples. En revanche, la ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
L’aigle modifié de Dulbecco s Medium (DMEM)	Sigma	D6429	Glycémie élevée 4 500 mg/L
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10270106
Pénicilline-Streptomycine (PenStrep)	BioConcept	4-01F00-H
NE-PER Réactifs d’extraction nucléaire et cytoplasmique	Thermo Fisher Scientific	78833
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Carl Roth	6908.3
Dynabeads Protein G	Novex, Thermo Fisher Scientific	10003D
DRBP76 (NF90/NF110)	BD Transduction Laboratories	612154	utiliser 1:1 000 pour la WB et 1:100 pour l’ICC/PLA
L’anticorps RBM3	ProteinTech	14363-1-AP	utilise 1:1 000 pour la WB et 1:100 pour l’anticorps ICC/PLA
Lamin A/C	Technologie de	signalisation cellulaire#2032	utilisez 1:1 000 pour WB  ;
anticorps anti-GAPDH	Abcam	ab8245	utiliser 1:1 000 pour WB  ;
IgG de lapin normal	Santa Cruz	sc-2027
IgG anti-lapin, anticorps secondaires liés à	HRP Technologie de signalisation cellulaire	#7074	utiliser 1:5 000 pour WB  ;
anticorps secondaire HRP anti-souris	Carl Roth	4759.1	utiliser 1:5 000 pour WB  ;
Substrat de transfert Clarity Western ECL	Bio-Rad	#1705060
NuPAGE Novex 4-12 % Bis-Tris Gel	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX
NuPAGE LDS Tampon d’échantillon (4x)	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP0007
NuPAGE MES SDS Tampon de fonctionnement (20x)	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP0002
Tampon de transfert NuPAGE (20x)	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP00061
Amersham Hypond P 0.2 Membrane PVDF	GE Healthcare Life Sciences	10600021
Poly-D-Lysine 8 puits Culture Slide	Corning BioCoat	354632
Paraformaldéhyde (PFA)	Sigma	P6148
Sérum de chèvre normal (NGS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	PCN5000
IgG anti-souris de chèvre (anticorps H+L), conjugué Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11001
IgG anti-lapin de chèvre (anticorps H+L), conjugué Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
4&prime ;, 6-Diamidin-2-phénylindol (DAPI)	Sigma	D9542
Sonde PLA Duolink Anti-souris PLUS	Sigma	DUO92001
Duolink PLA  ; sonde anti-lapin MINUS	Sigma	DUO92005
Duolink Réactifs de détection Red	Sigma	DUO92008
Duolink Wash Buffers Fluorescence	Sigma	DUO82049
Duolink Milieu de montage avec DAPI	Sigma	DUO82040
Mowiol 4-88	Sigma	81381
Microscope	Olympus	AX-70
Caméra CCD	SPOT	Insight 2MP Firewire
Film radiographique	Fujifilm	Super RX
Machine de traitement de film	Fujifilm	FPM-100A