Ce protocole décrit une technique de dosage personnalisable évolutive dans Drosophila qui produit des données robustes et quantitatives pour mesurer le comportement de toilettage. La méthode est basée sur la comparaison de la différence dans l'accumulation de colorant sur les corps des animaux non-soignés par rapport aux animaux soignés sur une période de temps déterminée.
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Article de méthode
Quantification du comportement de toilettage de la drosophile
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le comportement de toilettage de Drosophila est un programme complexe de locomoteurs à plusieurs étapes qui nécessite un mouvement coordonné des membres antérieurs et des pattes arrière. Nous présentons ici un protocole d'analyse de toilettage et un nouveau design de chambre qui est rentable et évolutif pour les études à petite ou grande échelle de toilettage de Drosophila . Les mouches sont répandues dans leur corps avec un colorant Jaune Brillant et ont le temps de retirer le colorant de leur corps dans la chambre. Les mouches sont ensuite déposées dans un volume déterminé d'éthanol pour solubiliser le colorant. L'absorbance spectrale relative des échantillons de colorant-éthanol pour les animaux soignés contre les non-tissés est mesurée et enregistrée. Le protocole fournit des données quantitatives sur l'accumulation de colorant pour les mouches individuelles, qui peuvent être facilement calculées en moyenne et comparées entre les échantillons. Cela permet aux conceptions expérimentales d'évaluer facilement la capacité de toilettage pour les études sur les animaux mutants ou les manipulations de circuits. Cette procédure efficace est à la fois polyvalente et évolutive. Nous montrons wFlux ork du protocole et données comparatives entre des animaux WT et des animaux mutants pour le récepteur Dopamine Drosophila de type I ( DopR ).
Introduction
Toilettage dans Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) est un comportement inné robuste qui implique la coordination de multiples programmes moteurs indépendants 1 . Les mouches des fruits nettoient leurs corps de poussière, microbes et autres agents pathogènes qui pourraient entraver une fonction physiologique normale telle que la vision et le vol, ou conduisent à des défis immunitaires importants. En détectant et en réponse à la fois mécanique 2 et l'activation immunitaire 3 , les mouches se frottent de façon répétitive les jambes ensemble ou sur une région ciblée du ....
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Protocole
1. Préparation
- Préparez un aspirateur pour déplacer la Drosophile en direct d'un flacon de culture vers la chambre de toilettage. Les aspirateurs permettent le transfert d'animaux conscients aux chambres de comportement afin de s'assurer que l'anesthésie n'affecte pas l'observation comportementale ultérieure.
- À l'aide de ciseaux, coupez 1,5 pieds de l'ID du tube tygon ⅛ ", OD ¼". Coupez au moins 1 pouce de la pointe d'une pointe de micropipette jetable de 1 mL. Tenir un morceau de maille carré de 1 cm (ouverture 0,196 pouce) sur le bout coupé.
REMARQUE: la plupart des conseils 1m....
- À l'aide de ciseaux, coupez 1,5 pieds de l'ID du tube tygon ⅛ ", OD ¼". Coupez au moins 1 pouce de la pointe d'une pointe de micropipette jetable de 1 mL. Tenir un morceau de maille carré de 1 cm (ouverture 0,196 pouce) sur le bout coupé.
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Résultats
Le test de toilettage produit des données quantitatives pour évaluer la performance comportementale en fonction du reste relatif de colorant accumulé laissé sur les corps des mouches après un temps de mesure pour le toilettage (30 min). Des exemples d'images de la conception de la chambre de toilettage coulissante et des étapes principales de l'analyse sont mis en évidence à la figure 1 . Les mouches agrégent une quantité significative de colorant provenant du dé.......
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Discussion
Le test de toilettage est relativement simple, mais nous recommandons aux expérimentateurs d'accorder une attention particulière aux problèmes suivants. Le maintien d'un joint étanche en serrant les vis sur les plaques supérieure et inférieure après l'introduction des mouches et du colorant est essentiel pour des résultats reproductibles. Le colorant Jaune Brilliant est très fin et les joints lâches permettront des pertes de teinture des bords de la chambre. L'irrégularité de la teneur en teinture pour c.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
Remerciements
Nous souhaitons remercier Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon et Rose Hedreen pour les premiers travaux de test et d'établissement de cette méthodologie et des conceptions de chambre. Nous remercions Kelly Tellez et Graham Buchan pour la lecture et l'édition du manuscrit. Nous remercions Andrew Seeds et Julie Simpson pour leur travail pionnier et leurs conseils et leur soutien en suggérant l'utilisation de Brilliant Yellow Dye (Sigma). Ce travail est soutenu en partie par le Fonds de bienfaisance en recherche et en éducation médicale et chirurgicale Mary E. Groff, le Bronfman Science Centre et le Hellman Fellows Progr....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube transparent en PVC Tygon haute flexibilité | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8 », OD 1/4 », utilisé avec des pointes de micropipette et un treillis pour construire des aspirateurs buccaux Pointes |
| micropipette (1 mL et 200 μ ; L) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Écran en maille de nylon, 2 x 2,6 " | McMaster-Carr | 9318T44 | Utilisé pour construire des aspirateurs de chambre de toilettage et de bouche |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Colorant jaune brillant | Sigma-Aldrich | 201375-25G | nous recommandons l’utilisation de gants en nitrile lors de la manipulation de ce produit |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | réglé pour « toucher" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| Tubes à centrifuger 1,5 mL | VWR International | 10025-726 | |
| Tubes à microcentrifuger 0,65 mL | Les tubes VWR International | 20170-293 | peuvent être réutilisés avec des dosages successifs |
| Plaque UV à 96 puits | Corning | ||
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | doit télécharger le catalogue pour accéder au numéro de produit | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Incubateur de drosophile | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4 » en plastique acrylique | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 écrous | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1 » Vis à tête hexagonale | McMaster-Carr | 92185A199 | la plaque inférieure doit être taraudée pour cette taille Vis |
| tête hexagonale 8 - 32 x 1/2 » Vis à tête hexagonale | McMaster-Carr | 92185A194 | la deuxième plaque à partir du haut doit être taraudée |
| 2 - 56 3/8 » vis à métaux Phillips à tête plate | McMaster-Carr | 91500A088 | celles-ci maintiennent les deux plaques du milieu ensemble |
| 0,175 » ID, 1/4 » OD, 0,34 » tuyau en aluminium | McMaster-Carr | 92510A044 | Fabriqué en interne ; Le produit répertorié a à peu près les mêmes dimensions et devrait fonctionner pour les vis de taille 8. Ceux-ci servent de gaines pour les vis de 1" et placent légèrement le capuchon hexagonal vers le haut à partir de la surface de la plaque supérieure |
Références
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F.
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Réimpressions et autorisations
