Article de méthode

Quantification du comportement de toilettage de la drosophile

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DOI :

10.3791/55231

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19 juillet 2017

 ,  , 
1Department of Biology, Williams College

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une technique de dosage personnalisable évolutive dans Drosophila qui produit des données robustes et quantitatives pour mesurer le comportement de toilettage. La méthode est basée sur la comparaison de la différence dans l'accumulation de colorant sur les corps des animaux non-soignés par rapport aux animaux soignés sur une période de temps déterminée.

Résumé

Le comportement de toilettage de Drosophila est un programme complexe de locomoteurs à plusieurs étapes qui nécessite un mouvement coordonné des membres antérieurs et des pattes arrière. Nous présentons ici un protocole d'analyse de toilettage et un nouveau design de chambre qui est rentable et évolutif pour les études à petite ou grande échelle de toilettage de Drosophila . Les mouches sont répandues dans leur corps avec un colorant Jaune Brillant et ont le temps de retirer le colorant de leur corps dans la chambre. Les mouches sont ensuite déposées dans un volume déterminé d'éthanol pour solubiliser le colorant. L'absorbance spectrale relative des échantillons de colorant-éthanol pour les animaux soignés contre les non-tissés est mesurée et enregistrée. Le protocole fournit des données quantitatives sur l'accumulation de colorant pour les mouches individuelles, qui peuvent être facilement calculées en moyenne et comparées entre les échantillons. Cela permet aux conceptions expérimentales d'évaluer facilement la capacité de toilettage pour les études sur les animaux mutants ou les manipulations de circuits. Cette procédure efficace est à la fois polyvalente et évolutive. Nous montrons wFlux ork du protocole et données comparatives entre des animaux WT et des animaux mutants pour le récepteur Dopamine Drosophila de type I ( DopR ).

Introduction

Toilettage dans Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) est un comportement inné robuste qui implique la coordination de multiples programmes moteurs indépendants 1 . Les mouches des fruits nettoient leurs corps de poussière, microbes et autres agents pathogènes qui pourraient entraver une fonction physiologique normale telle que la vision et le vol, ou conduisent à des défis immunitaires importants. En détectant et en réponse à la fois mécanique 2 et l'activation immunitaire 3 , les mouches se frottent de façon répétitive les jambes ensemble ou sur une région ciblée du corps jusqu'à ce qu'il soit suffisamment propre et que le soin de toilette progresse dans une autre partie du corps. Les mouches effectuent des mouvements de toilettage dans des épisodes distincts qui se produisent principalement dans des motifs stéréotypés 1 , 4 . Une hiérarchie comportementale devient évidente lorsque les signaux de toilettage sont priorisés. Les circuits et les modèles d'activité ont été identifiés en appui oFa modèle que les programmes de toilettage en haut de la hiérarchie se produisent d'abord et supprime les signaux parallèles provenant des zones du corps qui sont préparées par la suite 5 . La plus haute priorité est donnée à la tête, puis à l'abdomen, aux ailes et enfin au thorax 5 .

Le programme de toilettage de D. melanogaster est un système idéal pour l'étude des circuits neuronaux, des signaux moléculaires modulateurs et des neurotransmetteurs. Par exemple, le compromis de la fonction 6 de la neurofibromine, la perte de la protéine de retardement 10 fragile X de Drosophila ( dfmr1 ) 7 et l'exposition au bisphénol A (BPA) 8 provoquent tous des traitements généraux excessifs et d'autres comportements analogues aux symptômes humains discrets de neurofibromatose, fragiles X Le syndrome et les aspects des troubles du spectre autistique et du trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité (TDAH), respectivement. Le comportement de toilettage peut aussi être habituéDérivé de façon différentielle à travers les souches mutantes 2 , prêtant ce programme moteur à des études de plasticité comportementale. L'ampleur des phénomènes neurologiques qui peuvent être modélisés par Drosophila exige une nouvelle approche comparative pour mesurer la capacité des mouches de se toiletter.

L'action combinée des transporteurs de monoamine vésiculaire et l'abondance relative de la dopamine et d'autres amines biogènes dans le corps ont montré que la médiation du comportement de toilettage des mouches des fruits 9 , 10 . L'octopamine et la dopamine stimulent l'activité comparable de toilettage des jambes postérieures dans les mouches décapitées, tandis que la tyramine, le précurseur de l'octopamine, déclenche également un soin moindre 7 . Quatre récepteurs de dopamine ont été identifiés dans D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 . En utilisant la méthode de dosage de toilettage décrite dans ce protocole, nous avons déterminé un rôle pour le récepteur de Dopamine de type I DopR ( DopR, dDA1, stupide ) dans le comportement de toilettage des lèvres 15 .

Le soin de toilette peut être quantifié indirectement en examinant l'étendue de la propreté par laquelle un animal peut se toiletter complètement après avoir dépoussiéré le corps entier avec un colorant marqueur ou une poussière fluorescente 5 , 16 . Le reste de la poussière laissée sur le corps peut être utilisé comme marqueur relatif pour le comportement global. Les mouches en poudre après avoir eu suffisamment de temps pour se marier peuvent manifester un déficit spécifique dans le comportement de toilettage. Au fur et à mesure que les enquêtes de toilettage sont devenues plus étendues, les protocoles ont incorporé des pratiques telles que la décapitation pour ajouter des traitements pharmacologiques sur les nerfs conjonctifs du cou 10 , la stimulation tactile des poils pour susciter la réponse au groom 2 ,Et enregistrement vidéo de comportement 15 . L'observation directe du toilettage peut être facilement étudiée en utilisant l'observation visuelle et l'enregistrement manuel de la fréquence et de la durée des événements de toilettage spécifiques 4 .

Nous avons conçu une chambre de toilettage de quinze puits qui peut être construite avec une imprimante 3D ou un coupe-laser, et les modèles de modèles sont disponibles pour la reproduction 15 . La conception utilise deux plaques centrales jointes avec des ouvertures assorties et séparées par un maillage et deux plaques supérieures et inférieures, à partir desquelles les mouches et / ou le colorant sont chargés, respectivement. Après avoir autorisé le temps de mouches à épiler, nous les déposons dans de l'éthanol pour solubiliser le colorant et mesurer l'absorbance de cette solution à la longueur d'onde du colorant. Un lecteur de plaques peut être utilisé pour de multiples échantillons parallèles ou un spectrophotomètre à lecture unique peut être utilisé pour des échantillons individuels. Cette méthode minimise l'erreur induite par la manipulation et alDes tests de toilettage permettant d'exécuter une échelle plus petite et moins coûteuse. Cette méthode est dérivée et modifiée à partir des méthodes mises au point par Julie Simpson et Andrew Seeds, qui utilisent des chambres de toilettage plus grandes avec des éléments chauffants pour des manipulations de circuits sensibles à la température 5 . Le protocole suivant montre la quantification du soin du corps entier ainsi que des méthodes alternatives pour quantifier l'accumulation de colorant sur les parties du corps individuelles. Nous présentons également des exemples de données de comparaison entre les mutants WT et DopR , ainsi que des méthodes pour calculer un indice de performance simple pour le comportement de toilettage.

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Protocole

1. Préparation

  1. Préparez un aspirateur pour déplacer la Drosophile en direct d'un flacon de culture vers la chambre de toilettage. Les aspirateurs permettent le transfert d'animaux conscients aux chambres de comportement afin de s'assurer que l'anesthésie n'affecte pas l'observation comportementale ultérieure.
    1. À l'aide de ciseaux, coupez 1,5 pieds de l'ID du tube tygon ⅛ ", OD ¼". Coupez au moins 1 pouce de la pointe d'une pointe de micropipette jetable de 1 mL. Tenir un morceau de maille carré de 1 cm (ouverture 0,196 pouce) sur le bout coupé.
      REMARQUE: la plupart des conseils 1mL ont une ligne de gradation où la pointe se trouve dans la boîte de colis, généralement coupée sur cette ligne.
    2. Placer délicatement une pointe de micropipette de 1 ml sur la pointe de la maille / coupe. Observez le maillage comme une barrière étroite entre les deux pointes. L'intérieur de la nouvelle pointe crée une chambre de maintien pour les mouches.
    3. Couper le bout extrême de la nouvelle pointe de micropipette pour élargir l'ouverture suffisamment pour permettre le passage d'une seule mouche. The holE correspondra à peu près à l'ouverture de la chambre de toilettage (environ 1,5-2 mm de diamètre).
    4. Ajustez parfaitement les pointes imbriquées sur la fin du tube tygon. Poussez les pointes dans le tube pour assurer un ajustement serré pour permettre une pression de vide.
    5. À l'autre extrémité du tube, couper l'extrémité d'une pointe de micropipette de 200 μL et ajuster l'extrémité de coupe étroite dans le tube. C'est le côté "bouche" de l'aspirateur.
  2. Préparer des tubes aliquotes à poussière. Peser environ 5 mg de colorant Jaune Brillant sur du papier de pesée taré. Versez la poussière dans un tube de microcentrifugeuse de 0,6 mL et fermez fermement le capuchon.
    REMARQUE: Nous conseillons l'utilisation de gants nitrile lors de la préparation d'une aliquote, car certains gants en latex sont perméables au colorant.
  3. Répétez l'étape 1.2) pour tous les échantillons de l'expérience (un pour chaque mouche dans chaque chambre).
  4. Préparer des tubes d'éthanol (EtOH): Pipeter 1 mL d'EtOH 100% dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Tubes d'étiquettes pour génotypes ou conditions.
  5. Répétez l'étape 1.4) pour tous les échantillons de l'expérience (un pour chaque mouche dans chaque chambre). Capter et sauvegarder les tubes EtOH pour l'achèvement du dosage de toilettage. Incluez également au moins un échantillon "vierge" qui ne sera que de 1 mL d'EtOH sans mouche pour les témoins négatifs.
  6. Assemblez chaque chambre de toilettage en vissant la plaque supérieure coulissante (avec les plus petits trous), mais en laissant la plaque inférieure (avec les plus gros trous) enlever de la poussière.
  7. Placez chaque chambre de toilettage nécessaire à plat sur une table avec le haut face vers le bas. L'entrée de la mouche est orientée vers le bas.
  8. Chargez 5 mg d'une aliquote de colorant jaune brillant dans chaque chambre en tapotant le tube contre la surface de la chambre au-dessus du puits désiré. Appuyez sur la chambre contre la table pour vous assurer que toute la poussière tombe à travers le maillage sur la plaque supérieure.
  9. Vissez la plaque inférieure sur chaque chambre de sorte que les extrémités plus larges des ouvertures coniques soient vers l'extérieur et que les trous ne reposent pas sur les puits. Sécuriser le botTom plaque fermement afin qu'il ne glisse pas et ne libère pas de colorant.
  10. Retournez la chambre et la frappez à plat contre une table à plusieurs reprises afin que la poussière tombe dans le filet pour reposer sur la plaque inférieure.
  11. Faites glisser la plaque supérieure de la chambre dans la "position ouverte" afin que les petits trous s'alignent avec les quinze puits, ce qui permet l'introduction de mouches dans des puits individuels.

2. Mouillage et toilettage

  1. Chargez une volée dans l'aspirateur de la bouche en aspirant doucement à travers une extrémité de l'aspirateur comme s'il s'agissait d'une paille. Déposez les mouches en soufflant légèrement et en dirigeant l'ouverture vers la cible.
  2. Aspirez une volée dans chaque puits utilisé pour l'expérience. Après avoir chargé un puits, faites glisser la plaque supérieure afin que la mouche soit piégée dans la chambre et placez le ruban adhésif sur l'ouverture de ce puits pendant le chargement de la chambre entière afin d'éviter que la mouche n'échappe pendant le chargement d'autres puits. Si de multiples mouches sont aspirées en un seulEh bien, laissez cette ouverture découverte jusqu'à ce qu'une seule mouche reste.
  3. Après que tous les puits nécessaires sont remplis de mouches, basculer la chambre de façon à ce que la plaque inférieure soit vers le haut afin que la poussière puisse revêtir les mouches en tombant à travers le maillage.
  4. Fixez fermement les plaques supérieure et inférieure en serrant les vis et tourbillissez la chambre pour pousser les mouches pendant 4 s.
  5. Frappez la chambre (plaque supérieure vers le bas) contre une table deux fois pour que le colorant tombe sur l'autre côté. Ensuite, retournez la chambre (plaque supérieure face recto) et frappez la chambre deux fois pour s'assurer que le colorant se dépose sur le sol de la chambre inférieure à l'écart de la mouche dans la chambre supérieure.
  6. Pour contrôler les mouches qui ne sont pas autorisées à se marcher, passez immédiatement à l'étape 3 du protocole. Pour les mouches qui complètent l'analyse, passez à l'étape 2.7.
  7. Reposez la chambre à plat sur une table ou un comptoir avec la plaque supérieure vers le haut pendant trente minutes pour permettre aux mouches de se marier. Placez le chambDans un espace sans bruit et sans vibrations pour maintenir votre environnement constant pour toutes les expériences de toilettage (niveaux d'éclairage, humidité et température). Un incubateur de table à la RT ou à 25 ° C avec des contrôles d'humidité est idéal.

3. Préparation des échantillons et analyse de l'absorbance

  1. Garder le niveau de la chambre avec la plaque supérieure vers le haut, dévisser doucement la plaque inférieure et l'enlever de la chambre en prenant soin de ne pas perdre de colorant.
  2. Placez la chambre sur un tampon Fly CO 2 avec un faible débit d'air jusqu'à ce que les mouches soient anesthésiées.
  3. Dévissez la plaque supérieure de la chambre. Utilisez soigneusement une pince pour attraper une jambe et déplacer une mouche saupoudrée de chaque chambre et déposez-la dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL contenant de l'EtOH. Le temps de transfert pour 15 chambres contenant chacune une mouche est d'environ 3-5 minutes. Les expérimentateurs devraient tenir compte des temps de transfert si / lors d'expériences échelonnées avec de multiples chambres pour assurer une mise en scène efficace des expériences.
  4. Une fois que chaque tube de microcentrifugeuse contient 1 mouche, fermez le capuchon et inversez le tube trois fois pour agiter et mélanger la solution de colorant et d'éthanol.
  5. Incuber les tubes contenant de l'éthanol et les mouches pendant 5 h à la température ambiante pour assurer une élimination complète du colorant de la mouche en solution. Après les 5 h, tournez brièvement chaque tube (2 s) pour assurer le dégagement du colorant des mouches.
  6. Aliquote 50 μL du tube expérimental de 1,5 mL dans un puit d'une plaque à 96 puits si disponible, en prenant note de l'emplacement de chaque échantillon sur la plaque. Ajouter 200 μL d'EtOH pour diluer l'échantillon 5x. La dilution évite les effets de plafond des mouches fortement épissées ou de grands défauts de toilettage.
  7. Utilisez un lecteur de plaques pour analyser chaque échantillon à 397 nm. Alternativement, mesurer l'absorbance pour les échantillons individuels et les ébauches sur un spectrophotomètre standard dans le spectre visible si un lecteur de plaque n'est pas disponible.
  8. Lisez et enregistrez l'échantillon à travers le lecteur de plaques et enregistrez la feuille de calcul avec le recordeD échantillons sur la plaque.

4. Quantification des résultats

  1. Compilez les résultats pour tous les échantillons et mesurez la variance pour chaque génotype ou état.
    NOTE: L'accumulation de teinture au moment 0 min et au moment de 30 min sont considérées comme des conditions distinctes en utilisant une analyse statistique par une correction ANOVA et Bonferroni unidirectionnelle ou d'autres corrections pour de multiples comparaisons parallèles.
  2. Calculer la différence de pourcentage de toilettage pour chaque génotype / état en utilisant l'équation suivante: [(valeur moyenne d'accumulation de colorant au temps 0 '- valeur moyenne d'accumulation de colorant au temps 30') / valeur moyenne d'accumulation de colorant au temps 0] x 100.
  3. Exprimez le pourcentage pour chaque génotype et condition dans les diagrammes à barres et comparez les génotypes et les conditions.

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Résultats

Le test de toilettage produit des données quantitatives pour évaluer la performance comportementale en fonction du reste relatif de colorant accumulé laissé sur les corps des mouches après un temps de mesure pour le toilettage (30 min). Des exemples d'images de la conception de la chambre de toilettage coulissante et des étapes principales de l'analyse sont mis en évidence à la figure 1 . Les mouches agrégent une quantité significative de colorant provenant du dé...

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Discussion

Le test de toilettage est relativement simple, mais nous recommandons aux expérimentateurs d'accorder une attention particulière aux problèmes suivants. Le maintien d'un joint étanche en serrant les vis sur les plaques supérieure et inférieure après l'introduction des mouches et du colorant est essentiel pour des résultats reproductibles. Le colorant Jaune Brilliant est très fin et les joints lâches permettront des pertes de teinture des bords de la chambre. L'irrégularité de la teneur en teinture pour c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Nous souhaitons remercier Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon et Rose Hedreen pour les premiers travaux de test et d'établissement de cette méthodologie et des conceptions de chambre. Nous remercions Kelly Tellez et Graham Buchan pour la lecture et l'édition du manuscrit. Nous remercions Andrew Seeds et Julie Simpson pour leur travail pionnier et leurs conseils et leur soutien en suggérant l'utilisation de Brilliant Yellow Dye (Sigma). Ce travail est soutenu en partie par le Fonds de bienfaisance en recherche et en éducation médicale et chirurgicale Mary E. Groff, le Bronfman Science Centre et le Hellman Fellows Program.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube transparent en PVC Tygon haute flexibilitéMcMaster-Carr5229K54ID 1/8 », OD 1/4 », utilisé avec des pointes de micropipette et un treillis pour construire des aspirateurs buccaux Pointes
micropipette (1 mL et 200 μ ; L)Genesee Scientific24-165, 24-150R
Écran en maille de nylon, 2 x 2,6 "McMaster-Carr9318T44Utilisé pour construire des aspirateurs de chambre de toilettage et de bouche
Dumont #5 ForcepsRoboz Surgical InstrumentRS-5050
Colorant jaune brillantSigma-Aldrich201375-25Gnous recommandons l’utilisation de gants en nitrile lors de la manipulation de ce produit
VortexerFisher Scientific12-812réglé pour « toucher"
EthanolCarolina Biological Supply86-1282
Tubes à centrifuger 1,5 mLVWR International10025-726
Tubes à microcentrifuger 0,65 mLLes tubes VWR International20170-293peuvent être réutilisés avec des dosages successifs
Plaque UV à 96 puitsCorning
BioTek Synergy HTX PlatereaderBioTekdoit télécharger le catalogue pour accéder au numéro de produithttp://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview
Gen5 Microplate Reader and Imager SoftwareBioTek
Microsoft ExcelMicrosofthttps://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)()
Incubateur de drosophileTritechDT2-CIRC-TK
1/4 » en plastique acryliqueMcMaster-Carr8473K341
8 - 32 écrousMcMaster-Carr90257A009
8 - 32 x 1 » Vis à tête hexagonaleMcMaster-Carr92185A199la plaque inférieure doit être taraudée pour cette taille Vis
tête hexagonale 8 - 32 x 1/2 » Vis à tête hexagonaleMcMaster-Carr92185A194la deuxième plaque à partir du haut doit être taraudée
2 - 56 3/8 » vis à métaux Phillips à tête plateMcMaster-Carr91500A088celles-ci maintiennent les deux plaques du milieu ensemble
0,175 » ID, 1/4 » OD, 0,34 » tuyau en aluminiumMcMaster-Carr92510A044Fabriqué en interne ; Le produit répertorié a à peu près les mêmes dimensions et devrait fonctionner pour les vis de taille 8. Ceux-ci servent de gaines pour les vis de 1" et placent légèrement le capuchon hexagonal vers le haut à partir de la surface de la plaque supérieure
de 26014017 à

Références

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