Stimulation de Notch Signalisation dans Souris ostéoclastes Précurseurs

La voie de signalisation Notch mammifère est homologue à la même voie dans Drosophila melanogaster et se compose de quatre récepteurs transmembranaire de Notch (Notch1-4) et cinq ligands liés à la membrane du Jagged (JAG1 & JAG2) et Delta-like (DLL1, 3, & 4) familles ^1. Signalisation Notch est déclenchée lorsque le récepteur Notch dans une cellule réceptrice est liée par un ligand sur une cellule de transmission ^2. Au cours de cette trans-activation, le ligand Notch lié à la membrane produit une force d' étirement sur le récepteur Notch liée à la membrane ^{3, 4.} La force d'étirement de la liaison du ligand induit des changements de conformation dans le récepteur Notch qui facilitent le clivage extracellulaire du récepteur de TNF-alpha enzyme de conversion (TACE), suivie d'un événement de clivage intracellulaire médiée par une gamma sécrétase complexe (γ-sécrétase) contenant préséniline. γ-secrétase libère l'int Notchdomaine racellular (NICD) qui translocation dans le noyau où il forme un complexe d'activation transcriptionnelle avec CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), Mastermind-like (GAML), et les facteurs spécifiques de type cellulaire pour conduire l'expression de cibler des gènes ^5.

Les éléments mécaniques du résultat de l' activation de signalisation Notch dans le besoin de procédés uniques d'activation de la voie Notch in vitro. ligands de Notch solubles peuvent se lier à Notch récepteurs, mais ne parviennent pas à produire des forces d'étirement nécessaires à la libération NICD tout en même temps inhibition compétitive de liaison des ligands de Notch associés aux cellules. Ainsi, l' addition de ligands de Notch solubles dans le milieu de culture peut atténuer Notch normale de signalisation ^{6, 7.} Heureusement, les ligands de Notch peuvent induire une libération NICD si elles sont fixées à un substrat rigide approprié ^{5, 8, 9,10.} Ensemencer des cellules sur des substrats de culture revêtues de ligand ou de l'application des billes de ligand revêtu à des cellules peut aussi activer la signalisation Notch, et le choix entre les deux dépend essentiellement du temps désiré de stimulation de l'entaille. Pour une activation immédiate, temporaire signalisation Notch, comme cela serait souhaité au cours du point médian d'une analyse fonctionnelle ou de la différenciation, le ligand de Notch peut être lié à des billes d'agarose, appliqué à des cellules en culture, et on le lave à tout moment. Pour en savoir plus soutenue signalisation Notch à partir du début d'une période de culture, des plaques de culture tissulaire peuvent être enrobés avec le ligand avant l'ensemencement des cellules.

Aux fins du présent protocole, des procédés sont réalisés en utilisant des précurseurs d'ostéoclastes de souris, mais les méthodes et variations des procédés décrits ici sont applicables à une grande variété de types de cellules ^{6, 11, 12, 13,} 14. Les ostéoclastes sont des cellules terminalement différenciées lignage hématopoiétiques qui sont responsables de la résorption du tissu osseux, et ils sont impliqués dans de multiples troubles de la perte osseuse ^15. Ainsi, dans l' étude in vitro de la différenciation des ostéoclastes à partir de leurs précurseurs monocytes / macrophages-lignage et les mécanismes moléculaires contrôlant leur fonction est essentielle à une meilleure compréhension des ostéoclastes et le développement de nouvelles thérapies osseuses régénérant. Alors qu'il est maintenant généralement admis que la signalisation Notch joue un rôle positif dans la différenciation et la fonction des ostéoclastes, les variations dans les deux Notch signalisation stimulation et ostéoclastes culture précurseur et la différenciation ont conduit à des résultats contradictoires initialement ^{16, 17, 18, 19.} Un examen plus approfondi des différences dans les méthodes et l'utilisation des ressources génétiquesmodèles ont grandement clarifié le rôle de la signalisation Notch dans ostéoclastogenèse, mais l' application des méthodes de stimulation et de culture Notch standardisés pourraient empêcher de telles controverses dans les études futures de signalisation Notch dans d' autres types de cellules ^{20, 21, 22, 23.}

Il existe plusieurs méthodes pour la culture et la différenciation des précurseurs d'ostéoclastes de souris, et, comme avec les diverses méthodes de stimulation de la signalisation Notch, la meilleure méthode dépendra de la question d'expérimentation. Ici, notre méthode préférée de la culture de fractions adhérentes et non-adhérentes de cellules de la moelle rincés à partir des os longs de souris sera présenté. Cette méthode présente l'avantage de ne nécessiter pratiquement pas d'équipement spécialisé et pour produire des cellules qui sont applicables à une variété de procédés de différenciation.

Toute recherche impliquant des animaux vertébrés a été réalisée conformément aux protocoles approuvés par l'Université de Pennsylvanie Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC).

1. Culture Media Préparation

1. Préparer α-MEM par dissolution de milieu (MEM) en poudre essentiel minimum et 1,9 g de bicarbonate de sodium dans 900 ml d' H ₂ O et compléter avec 2 mM de L-glutamine, 100 unités / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 100 ml de chaleur sérum fœtal bovin inactivé. Stériliser en utilisant un 0,22 um polyéthersulfone (PES) filtre.
2. Préparer le milieu de macrophage en complétant α-MEM avec 35 ng / ml recombinant souris Macrophage-Colony Stimulating Factor (M-CSF)
3. Préparer le milieu des ostéoclastes en complétant milieu macrophage avec 100 RANKL ng / ml

2. moelle osseuse de cellules d'isolement

1. Remplir une seringue de 10 ml avec une aiguille de calibre 25⅝ par souris avec 10 ml d'α-MEM. Euthanasier souris via l' exposition de 10 min à CO ₂ à un taux de 1,3 L / min. Veiller à la mort des animaux en suivant CO ₂ exposition à la dislocation cervicale avant de procéder à la dissection.
2. En utilisant une technique propre, disséquer et séparer les tibias et les fémurs. Désinfecter la peau de souris avec 70% d' éthanol avant de faire une incision le long de la face antérieure de chaque patte arrière pour exposer le tibia et le fémur.
   1. Couper à travers l'articulation du genou afin de libérer l'extrémité distale du fémur, et de couper à travers le fémur le plus près possible du bassin que possible. Retirez le fémur et nettoyer autant tissus mous que possible. Pour enlever le tibia, couper à travers la cheville et enlever autant tissus mous que possible.
3. Tenir l'os avec une pince et affleurant osseuse dans un tube conique de 15 ml avec 2,5 ml température ambiante α-MEM combinant les bouffées de moelle à partir d'un simple clic de souris dans un seul tube.
   NOTE: Une quinte de moelle réussie va changer la coloration de til os du rouge au beige.
4. Laisser les débris de se déposer au fond du tube et transférer le surnageant dans un propre 15 ml tube conique en prenant soin d'éviter le transfert de tous les débris.
   NOTE: Certaines cellules peuvent également régler avec les débris de la moelle. Si un plus grand nombre de cellules est nécessaire, les bouffées de moelle osseuse peuvent être filtrés à travers un tamis cellulaire de 70 um dans un tube de 15 ml propre.
5. tube (s) Centrifuger à 300 xg pendant 5 minutes à température ambiante pour sédimenter les cellules.
6. Vide Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans la cellule 0,5 ml de chlorure d'ammonium-potassium (ACK) du tampon de lyse et incuber à 37 ° C pendant 3 minutes pour lyser les globules rouges.
7. Ajouter 10 ml de PBS directement à ACK-cell solution, et centrifuger à 300 g pendant 5 min.
   NOTE: Le culot cellulaire précédemment rouge devrait maintenant être beige.
8. Vacuum aspirer le surnageant et remettre le culot dans 10 ml α-MEM, et de la plaque dans une boîte de culture traitée 100 tissu mm. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C dans une humidifiéeincubateur de culture tissulaire.
   NOTE: Le comptage des cellules est pas nécessaire pour cette étape. Pendant ce temps, les cellules adhérentes de la moelle osseuse se fixer à la surface de culture; populations de cellules de moelle osseuse non adhérentes restent en suspension. MCSF ne sont pas présentes dans le milieu de culture au cours de cette incubation initiale.

3. Enrichissement des ostéoclastes Précurseurs

1. Après incubation pendant une nuit des bouffées de moelle, le transfert surnageant de culture contenant les cellules non adhérentes à un tube conique de 50 ml.
   NOTE: plats culture avec des cellules adhérentes, qui comprennent les cellules mésenchymateuses de la moelle progénitrices d'os, peut être jeté ou alimenté avec des produits frais α-MEM, si on le souhaite pour d'autres expériences.
   REMARQUE: Les ostéoclastes se différencient directement à partir de ces cellules de moelle osseuse non adhérentes en les plaquant dans des boîtes de culture traitées tissu à une densité de 4 x 10 ⁵ cellules / cm ² dans un milieu de ostéoclastes et moyenne rafraîchissant tous les jours pendant 5 jours. Ajouter α-MEM à la solution de cellules non-adhérentes à un volume final de 18 ml et ajouter du M-CSF à une concentration finale de 35 ng / ml.
2. Ajouter 3 ml de chaque suspension cellulaire à 6 mm 60 boîtes de culture en suspension.
3. Incuber les plaques pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié de culture tissulaire. Pendant ce temps, le M-CSF va stimuler la différenciation des macrophages, qui peuvent adhérer aux surfaces de la même culture traitée non tissulaires.
4. Après une nuit d'incubation, ré-alimentation ostéoclastes précurseurs avec 3 ml de milieu de macrophage frais. Cela permettra d'éliminer les cellules non-adhérentes qui ne sont pas différenciées en macrophages.
5. Continuer à la culture des précurseurs d'ostéoclastes à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 2 jours ou jusqu'à ce que les cultures atteignent environ 70% de confluence.

4. ostéoclastes Différenciation

1. Laver les précurseurs des ostéoclastes avec 5 ml de PBS et de traiter les cellules avec 1 ml marine d'origine protéolytique / enzyme collagénolytique à la température ambiante jusqu'à ce que le cells peuvent être délogées en tapotant doucement de la plaque.
   NOTE: ostéoclastes précurseurs ne peuvent être levées si elles sont cultivées dans des boîtes de suspension; les précurseurs se fixent aussi bien sur des surfaces de culture de tissus traités pour être soulevé. Trypsine peut activer des précurseurs d'ostéoclastes et doit être évitée.
2. Ajouter 4 ml α-MEM à chaque cellule de plat et de transfert à un tube conique de 50 ml. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et on dilue les cellules jusqu'à une densité de 5 x 10 ⁴ cellules / ml et ajouter du M-CSF à une concentration finale de 35 ng / ml et de RANKL à une concentration finale de 100 ng / ml.
3. Des cellules de semence à une densité de 2,6 x 10 ⁴ cellules / ^cm2 dans des plaques de culture de tissus traités et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié de culture tissulaire pendant 2 jours. La différenciation est typiquement effectuée dans des plaques à 24 puits, où 5 x 10 ⁴ cellules sont ensemencées dans chaque puits.
4. 2 jours après le début des cellules de différenciation, re-alimentation par le remplacement moyen avec 1 ml de osteoc fraisdernier moyen.
   REMARQUE: la différenciation des ostéoclastes sera habituellement complète en 3 jours. ostéoclastes résultant peut être TRAP teinté pour la quantification facile et l'analyse morphologique.

5. Stimulation continue de Notch Signaling avec Surface Jagged1 revêtue

1. Suspendre anticorps de chèvre anti-IgG humaine Fc dans du PBS à une concentration de 10 pg / ml (1: 1000 dilution de 10 mg / stock ml). Ajouter une solution anticorps à la surface de culture à une densité de 1,3 g / cm ² et incuber à température ambiante pendant 1 h. Dans le cas des plaques à 24 puits, ajouter 250 ul (2,5 ug) par puits.
2. Vacuum puits aspirés et recharge avec 1 ml de PBS. Répétez cette étape 2 fois.
3. Suspendre Jagged1-Fc protéine de fusion recombinante dans du PBS à une concentration de 10 pg / ml. Ajouter une solution Jagged1-FC à la surface de culture revêtue d' anticorps à une densité de 1,3 g / cm ² et incuber à température ambiante pendant 2 h. surfaces de culture revêtues d'anticorps ONLY peut être utilisé en tant que témoins.
4. Vacuum puits aspirés et recharge avec 1 ml de PBS. Répétez cette étape 2 fois. Gardez PBS dans les puits jusqu'à ce que juste avant la cellule ensemencement pour les empêcher de sécher.
5. Seed 2.6 x 10 ⁴ ostéoclastes précurseurs / cm ² sur des surfaces revêtues. signalisation Notch sera stimulée en continu pendant au moins 3 jours.

6. Stimulation temporaire de Notch Signaling avec perles Jagged1 enduites

1. Combiner les éléments suivants dans un tube de dimension appropriée: 0,5 ug / ^cm2 Jagged1-Fc, 21 pl / cm ² billes d'agarose protéine G et du PBS pour un volume final de 1,5 ml. Pour préparer un nombre suffisant de billes Jagged1 pour 1 puits d'une plaque de 24 puits, mélanger 1 pg Jagged1-Fc, 40 protéines G ul billes d'agarose, et PBS à 1,5 ml.
2. Incuber tube avec rotation à 4 ° C pendant 2 heures.
3. Tube à centrifuger à 300 g pendant 1 min à des billes de granulés. Remettre les billes dans 1,5 ml de PBS. Répéter ce lavage2 fois plus.
4. Perles Resuspendre Jagged1 dans 130 pl / cm ² milieu de culture et appliquent à des cellules en culture.
5. Incuber les cellules avec des billes à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant une période souhaitée. Retirer les perles avec plusieurs lavages de PBS ou de milieu de culture.
6. Vérifier Notch activation de signalisation par la mesure de la transcription de gènes cibles de Notch ^10.

Le but de cette méthode est de la culture et de stimuler la signalisation Notch dans les précurseurs des ostéoclastes. Lorsqu'il est correctement cultivés, les précurseurs d'ostéoclastes présentent une morphologie fusiforme essentiellement allongée avec cytoplasme lisse (figure 1A). Des précautions doivent être prises pour éviter l'activation immunologique des précurseurs d'ostéoclastes. Lors de l' activation, les précurseurs se propagent et deviennent aplaties avec mousseuse cytoplasme (figure 1B). Ces cellules "d'oeufs frits" sont résistants à la signalisation de RANK et ne se différencient pas efficacement en ostéoclastes matures. Aux termes de culture et de différenciation des conditions correctes, les précurseurs d'ostéoclastes enrichis se différencier et fusible en gros ostéoclastes multinucléaires TRAP-positives dans les trois jours (figure 1C).

Ensemencement précurseurs d'ostéoclastes sur des surfaces revêtues Jagged1-Fc régule à la hausse des gènes cibles Notch dans les 24 h(Figure 2). Des gènes spécifiques régulés à la hausse par la signalisation Notch varient selon le type de cellule. Dans le cas des précurseurs d'ostéoclastes, le gène le plus prédominant régulé à la hausse par Jagged1 est Hes1, bien Hey2 et Myc sont modérément régulée à la hausse, aussi bien. L'expression d'autres gènes cibles, tels que Notch Hey1 et p21 ne sont pas significativement altérée par Jagged1 stimulation des précurseurs d'ostéoclastes.

Lorsque des précurseurs d'ostéoclastes sont cultivées dans des plaques à 24 puits, un traitement avec des billes revêtues avec aussi peu que 600 ng Jagged1-Fc montrent une augmentation significative de l'expression Hes1 dans les 24 heures (figure 3). Quarante-huit h traitements montrent une augmentation similaire de l'expression Hes1, bien que dans une moindre mesure.

Figure 1: Culture et la différenciation des précurseurs des ostéoclastes. (A)précurseurs d'ostéoclastes Naïf cultivées avec 35 ng / ml MCSF et sans stimuli d'activation ont une morphologie en forme de broche lisse. Barre d'échelle = 25 pm. (B) Lors de l' activation immunologique, les précurseurs d'ostéoclastes adoptent une morphologie aplatie rempli de mousse et ne se différencier en ostéoclastes. Pour induire l'activation, les précurseurs d'ostéoclastes ont été traitées avec 10 ng / ml de lipopolysaccharide pendant 16 h. Barre d'échelle = 25 pm. (C) immunologiquement naïves précurseurs d'ostéoclastes adhérentes cultivées avec 35 ng / ml de M - CSF et 100 ng / ml pendant 3 jours se différencier en ostéoclastes matures. ostéoclastes matures sont grandes, multinucléaire et TRAP-positives. Barre d'échelle = 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Une régulation positive des gènes cibles de Notch dans les précurseurs d'ostéoclastes étalées sur immobilisé Jagged1-Fc. précurseurs d'ostéoclastes ont été étalées sur Jagged1-Fc immobilisée et mises en culture pendant 24 heures. Au cours de la période de culture, expression Hes1, Hey2 et Myc ARNm a été augmenté. D'autres gènes cibles de Notch, et Hey1 p21 n'a pas été modifiée. Les barres d'erreur sont une erreur standard de la moyenne, l'importance a été évaluée en utilisant le test t 1-queue de l'étudiant. *, P <0,05. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Une régulation positive de l' ARNm dans Hes1 précurseurs d'ostéoclastes traités avec des billes Jagged1-Fc. 600 ng Jagged-Fc liée à la protéine G des billes d'agarose-up régule l'expression Hes1 des précurseurs des ostéoclastes en culture dans le puits d'une plaque de 24 puitsdans les 24 h d'exposition. Hes1 induction par Jagged1-billes était comparable à des niveaux Hes1 induits par des plaques Jagged1-Fc revêtus. D'autres gènes cibles de Notch qui ne sont pas fortement induite par des plaques Jagged1-Fc enrobées n'a pas été évaluée. Les barres d'erreur sont une erreur standard de la moyenne, l'importance a été évaluée en utilisant le test t 1-queue de l'étudiant. *, P <0,05. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.