Article de méthode

MitoCeption: Transfert humain isolé MSC mitochondries à glioblastome cellules souches

DOI :

10.3791/55245

⸱

22 février 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine and Biotherapy (IRMB), INSERM U1183, Montpellier University, 2Institute of Neurosciences of Montpellier (INM), INSERM U1051, Montpellier University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, un protocole (MitoCeption) est présenté pour transférer les mitochondries, isolées à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC), des cellules souches de glioblastome (CGC), dans le but d'étudier leurs effets biologiques sur le métabolisme et les fonctions CGC. Un protocole similaire peut être adapté pour transférer des mitochondries entre les autres types de cellules.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les mitochondries jouent un rôle central pour le métabolisme cellulaire, la production d'énergie et le contrôle de l'apoptose. la fonction mitochondriale inadéquate a été trouvé responsable de la très diverses maladies, allant de pathologies neurologiques au cancer. Fait intéressant, les mitochondries ont été récemment démontré pour afficher la capacité d'être transféré entre les types de cellules, notamment de cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) pour des cellules cancéreuses dans des conditions de co-culture avec métaboliques et fonctionnels conséquences pour les cellules réceptrices des mitochondries, améliorant encore l'intérêt actuel pour les propriétés biologiques de ces organites.

L'évaluation des effets des mitochondries MSC transférés dans les cellules cibles est de première importance pour comprendre le résultat biologique de ces interactions cellule-cellule. Le protocole MitoCeption décrit ici permet le transfert des mitochondries préalablement isolées à partir des cellules du donneur aux cellules cibles, en utilisant MSC mitochondrieset les cellules souches de glioblastome (CGC) en tant que système modèle. Ce protocole a été précédemment utilisé pour transférer des mitochondries, isolée de cellules souches mésenchymateuses pour adhérentes cellules cancéreuses MDA-MB-231. Ce protocole de transfert de mitochondries est adapté ici pour GSCs qui présentent la particularité spécifique de plus en plus comme neurosphères in vitro. Le transfert des mitochondries isolées peut être suivie par les cellules activées par fluorescence (FACS) et la microscopie confocale en utilisant des colorants vitaux mitochondries. L'utilisation de cellules donneuses et cible mitochondries avec des haplotypes distincts (SNP) permet également la détection des mitochondries transférés en fonction de la concentration de l'ADN mitochondrial circulaire (ADNmt) dans les cellules cibles. Une fois que le protocole a été validé avec ces critères, les cellules hébergeant les mitochondries transférées peuvent être analysés plus avant pour déterminer les effets des mitochondries exogènes sur les propriétés biologiques telles que le métabolisme cellulaire, la plasticité, la prolifération et la réponse au traitement.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les mitochondries sont des organites présents dans les cellules eucaryotes où ils jouent un rôle central dans l'absorption des nutriments, ainsi que dans l'énergie et métabolite production. Ces organites contiennent circulaire de l' ADN mitochondrial (ADNmt), 16,6 kb, qui code pour les protéines des complexes de la chaîne de transport d'électrons, ARNt et ARNr 1. La fonctionnalité de ces organites est essentielle pour l' homéostasie cellulaire et de nombreuses pathologies sont associées à une dysfonction mitochondriale 1, 2, 3. L&#....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

jour 1

1. Le marquage de la cellule souches mésenchymateuses (MSC) mitochondries (Facultatif)

  1. Deux jours avant la préparation des mitochondries, des semences MSCs humaines dans une boîte de culture de 100 mm, dans 10 ml aMEM / FBS 10%, de manière à avoir 4 x 10 5 MSCs en culture le jour 1.
  2. Rincer avec du PBS MSCs (4 ml) et on ajoute 4 ml d'aMEM / FBS à 1% (préchauffée à 37 ° C).
  3. Ajouter la quantité requise de mitochondries colorant vital et laisser incuber les cellules pendant 30 minutes dans l'incubateur à 37 ° C.
  4. Retirer la solution mitochondries de colorant, rincer les cellules d....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les étapes de la procédure décrivant l'isolement des mitochondries à partir de cellules souches mésenchymateuses (MSC) et leur transfert vers les cellules souches de glioblastome ciblées (CGC) par MitoCeption sont représentés sur la figure 1. GSCs sont des cellules souches cancéreuses cultivées en neurosphères pour préserver leurs propriétés de cellules souches. Pour le protocole, les CSS sont ensemencées comme des cellules individuelles d' un couple d'heures avant le tr.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un nombre croissant d'études montrent que les cellules peuvent échanger des mitochondries et que ces mitochondries ont des effets profonds sur le métabolisme et les fonctions de la cellule cible. Par conséquent, il est essentiel de maîtriser les outils pour transférer quantitativement dans les mitochondries des cellules du donneur à ces cellules cibles afin de permettre une étude précise de leurs effets biologiques.

Le protocole décrit ici a été initialement élaboré pour transférer des m.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), avec lequel CJ et ML.V. sont affiliés, a déposé une demande de brevet sur la technique de MitoCeption (de EP14306154.7).

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Andrea Parmeggiani (L2C et DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), ainsi que des membres du laboratoire pour des discussions utiles, Christophe Duperray pour l'aide avec l'analyse FACS, l'installation d'imagerie RIO Montpellier (IRM) pour fournir le environnement adéquat pour FACS et microscopie confocale. BNM a été soutenue par une bourse d'études supérieures du LabEx Numev (convention ANR-10-LabX-20). AB a été soutenu par une bourse de premier cycle de l'Université de Varsovie et de l'Union européenne (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV est un scientifique du personnel du Centre national de la recherche s....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit d’isolement des mitochondries pour les tissus  ;Fisher Scientific  ;
N-2 Supplement (100x)Fisher Scientific11520536
B-27 Supplement W/O VIT A (50x)Fisher Scientific  ;
HBSS sans Ca2+ sans Mg2+. SigmaH4385
poly Hême  ;Sigma  ;P3932
aMEM sans glutamineOzymeBE12-169F
DMEM/F-12 sans glutamineFisher Scientific  ;
L-Glutamine  ;Invitrogen  ;25030-024  ;
Glucose  ;Sigma  ;G7021
Insuline  ;Sigma  ;I 1882  ;
Humain  ; bFGF  ;R& D Systems233-FB-025
EGF humain  ;Peprotech  ;AF-100-15  ;
HéparineSigmaH3149° ;
CaCl2MERCK2382
Inhibiteur de la trypsineSigma  ;T9003
DNase ISIGMA  ;
Trypsine 0,25 % / EDTA 1 mMInvitrogen  ;
TrypsineGibco  ;15090-046
Inhibiteurs de protéase sans EDTASigma4693159001
Ciprofloxacine  ;Sigma17850-5G-F
Fongique  ;Invivogenant-fn-1
Fungizone  ;Thermofisher15290018
GentamycinEuromedexEU0410
MitoTracker GreenFM Sondes moléculairesM7514
MitoTracker Red CMXRosMolecular Sondes  ; M7512
Sondes moléculaires FM rouge foncé MitoTracker  ; M22426  ;
Sondes moléculairesCellTracker Green CMFDAC7025
Sondes moléculairesCellTracker Blue CMF2HCC12881
RIPASanta Cruzsc-24948
FluoroDish Boîte de culture stérileWorld Precision InstrumentsFD35-100
HémacytomètreFisher Scientific267110
Tubes FACSBeckman Coulter2 523 749
Appareil FACSGallios  ;  ; 3L 10C
LC DÉMARRAGE RAPIDE DNA MASTER PLUS  ;Roche3515885001
1057966311500446115405661010415900125200056

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  3. Chandel, N. S.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Transfert mitochondrialcellules souches m senchymateusesisolation des mitochondriestri cellulaire activ par fluorescenceimagerie confocaleanalyse de l ADN mitochondrialvaluation du m tabolisme cellulaireculture de neurosph resnanotubes tunnelisants

Articles connexes