Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Cartographie des interactions ARN-ARN à l'échelle mondiale à l'aide de psoralène biotinylé

11.9K vues

⸱

DOI :

10.3791/55255

⸱

24 mai 2017

 ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR, 2Computational and Systems Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR

Dans cet article

Résumé

Ici, nous détaillons la méthode de l'équation de S de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH), ce qui permet une cartographie génomique des interactions intra-moléculaires et intermoleculaires d'ARN-ARN in vivo . SPLASH peut être appliqué pour étudier les interactions de l'ARN des organismes, y compris la levure, les bactéries et les humains.

Résumé

Savoir comment les ARN interagissent avec eux-mêmes et avec d'autres sont essentiels à la compréhension de la régulation des gènes basée sur l'ARN dans la cellule. Bien que des exemples d'interactions ARN-ARN telles que les interactions entre ARNm et ARNm aient montré qu'ils régulent l'expression des gènes, la mesure dans laquelle les interactions ARN se produisent dans la cellule est encore inconnue. Les méthodes antérieures pour étudier les interactions de l'ARN ont principalement porté sur des sous-groupes d'ARN qui interagissent avec une protéine particulière ou des espèces d'ARN. Ici, nous détaillons une méthode appelée S équation de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH) qui permettent une capture intégrale des interactions de l'ARN dans le génome in vivo de manière impartiale. SPLASH utilise une réticulation in vivo , une ligature de proximité et un séquençage à haut débit pour identifier globalement les partenaires intramoléculaires et intermoleculaires de base d'ARN. SPLASH peut être appliqué à différents organismes, y compris des bactéries, des levures et des cellules humaines, ainsi qu'uneDes conditions cellulaires diverses pour faciliter la compréhension de la dynamique de l'organisation de l'ARN dans divers contextes cellulaires. L'ensemble du protocole SPLASH expérimental prend environ 5 jours pour être complété et le flux de travail informatique prend environ 7 jours pour être complété.

Introduction

Étudier comment les macromolécules se plient et interagissent entre elles est la clé pour comprendre la régulation des gènes dans la cellule. Bien que de nombreux efforts aient été concentrés au cours de la dernière décennie pour comprendre comment l'ADN et les protéines contribuent à la régulation des gènes, on connaît relativement moins de la régulation post-transcriptionnelle de l'expression des gènes. L'ARN porte des informations à la fois dans sa séquence linéaire et dans sa structure secondaire et tertiaire 1 . Sa capacité à baser la paire avec elle-même et avec d'autres est importante pour sa fonction in vivo . Les progrès récents dans la sondage de la structure secondaire de l'ARN à haut débit ont fourni des informations précieuses sur les emplacements des régions à double et simple brin dans le transcriptome 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , HoweLes informations sur les partenaires d'interaction d'appariement manquent encore. Pour déterminer quelle séquence d'ARN interagit avec une autre région d'ARN dans le transcriptome, nous avons besoin d'informations globales en paire.

La cartographie par paire d'interactions ARN d'une manière globale et impartiale a traditionnellement été un défi majeur. Alors que les approches antérieures, telles que CLASH 9 , hiCLIP 10 et RAP 11 , sont utilisées pour identifier les interactions de l'ARN à grande échelle, ces techniques classent généralement l'association de base d'ARN pour un sous-ensemble d'ARN qui interagissent avec une protéine particulière ou des espèces d'ARN. Les développements récents dans l'étude des interactions globales de l'ARN comprennent la méthode RPL 12 , qui ne stabilise pas les interactions de l'ARN in vivo et ne peut donc capturer qu'un sous-ensemble d'interactions in vivo . Pour surmonter ces défis, nous et d'autres avons développé des stratégies à l'échelle du génome et impartiales à maP ARNA interagère in vivo , en utilisant des versions modifiées du réticulant psoralen 13 , 14 , 15 . Dans ce protocole, nous décrivons les détails pour effectuer l'équation de S de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH), qui utilise du psoralène biotinylé pour reticuler l'association des ARN in vivo , suivie d'une ligature de proximité et d'un séquençage à haut débit pour Identifiez les partenaires de base de l'ARN au niveau du génome ( Figure 1 ) 15 .

Dans ce manuscrit, nous décrivons les étapes pour effectuer SPLASH à l'aide de cellules adhérentes cultivées, dans ce cas, des cellules HeLa. Le même protocole peut être facilement adapté aux cellules de mammifères en suspension et aux cellules de levure et de bactéries. En bref, les cellules HeLa sont traitées avec du psoralène biotinylé et irradiées à 365 nm pour paires de bases d'ARN interactives par liaison croisée in vivo. Les ARN sont ensuite extraits des cellules, fragmentés et enrichis pour les régions de réticulation en utilisant des billes de streptavidine. Les fragments d'ARN interagissant sont ensuite ligaturés ensemble en utilisant une ligature de proximité et transformés en une banque d'ADNc pour un séquençage profond. Lors du séquençage, les ARN chimériques sont mappés sur le transcriptome / génome pour identifier les régions qui interagissent avec l'ARN qui sont couplées l'une à l'autre. Nous avons utilisé SPLASH avec succès pour identifier des milliers d'interactions d'ARN in vivo dans la levure et différentes cellules humaines, y compris le couplage intramoléculaire et intermoleculaire de base d'ARN dans diverses classes d'ARN, tels que snoRNAs, lncRNAs et mRNAs, pour apercevoir l'organisation structurelle et les modèles d'interaction Des ARN dans la cellule.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Traitement des cellules HeLa avec extraction du psoralène biotinylé et de l'ARN

  1. Culture Les cellules HeLa dans le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) complétées par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de streptomycine pénicilline (PS) dans une plaque de 10 cm.
  2. Lavez les cellules HeLa deux fois avec 5 mL de 1x PBS. Égoutter l'excès de PBS complètement du plat en plaçant le plat verticalement pendant 1 min.
  3. Ajouter 1 ml de PBS contenant 200 uM de psoralène biotinylé et digitonine à 0,01% p / v, uniformément aux cellules et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Bien que le psoralène biotinylé puisse pénétrer dans la cellule, sa perméabilité est beaucoup plus élevée lorsque les cellules sont exposées à de faibles quantités de digitonine (0,01%) pendant 5 min
  4. Retirez le couvercle de la plaque de 10 cm contenant les cellules HeLa traitées et placez le plat à plat sur de la glace. Irradiate le plat contenant les cellules avec 365 nm UV pendant 20 min sur glace, à une distance de 3 cm des ampoules UV, en utilisant l'agent de réticulation UV.
  5. Isoler tARN d'Otal provenant de cellules HeLa par extraction au thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme selon le protocole du fabricant. Ajouter un volume 1: 1 d'isopropanol pour précipiter l'ARN à température ambiante pendant 30 min.
    Point de pause: l'ARN peut être conservé à -20 ° C dans l'isopropanol indéfiniment. Un point blot peut être effectué à cette étape pour vérifier que le psoralène biotinylé est entré avec succès dans les cellules et a réticulé des ARN in vivo ( figure 2 ).
  6. Centrifuger l'ARN précipité à 20 000 xg pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer l'ARN. Retirer le surnageant et ajouter 1 ml d'éthanol à froid à 70% à la pastille d'ARN pour laver l'ARN.
  7. Centrifuger les échantillons à 20 000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et sécher à l'air le pastillolet pendant 5 minutes à température ambiante.
  8. Ajouter de l'eau libre de nuclease à la pastille d'ARN et quantifier la concentration d'ARN en utilisant un spectromètre UV.
    Point de pause: l'ARN peut être stocké à -80 ° C après fCoup de fouet dans l'azote liquide.

2. Fragmentation de l'ARN

  1. Préchauffer 15 μL de tampon de fragmentation d'ARN 2x et 10 μL d'échantillon d'ARN (1 μg / μL) individuellement dans des tubes de PCR de 0,2 ml, à 95 ° C pendant 1 min. Mélanger 10 μl du tampon de fragmentation d'ARN 2x chauffé avec 10 μL d'échantillon d'ARN en pipetant vers le haut et vers le bas. Incuber l'échantillon à 95 ° C pendant 5 min. Arrêtez la réaction en refroidissant instantanément la réaction sur de la glace.
  2. Transférer et regrouper les 2 réactions de fragmentation à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 40 μL d'eau libre de nuclease à la réaction, 10 μl d'acétate de sodium 3 M, 1 μL de glycogène et 300 μL d'éthanol à 100% à la réaction de fragmentation. Incuber l'ARN à -20 ° C pendant au moins 1 h pour précipiter l'ARN.
  3. Centrifuger l'ARN précipité à 20 000 xg pendant 30 min, enlever le surnageant et laver l'ARN en utilisant 1 ml d'éthanol à 70%.
  4. Centrifuger l'ARN à 20 000 xg pendant 15 min, remOve le surnageant et dissolvez l'ARN dans 20 μL d'eau libre de nuclease.

3. Sélection et élution de la taille de l'ARN

  1. Ajouter 20 μL de colorant de chargement d'ARN à l'ARN récupéré dans le tube de microcentrifugeuse. Chauffer l'ARN avec le colorant de chargement de l'ARN à 95 ° C pendant 3 min et le placer sur de la glace pendant 2 min.
  2. Ajouter 3 μL de colorant de chargement d'ARN à 0,25 μL d'échelle d'ADN de 10 nt dans un tube à microcentre. Chauffer l'échelle à 95 ° C pendant 3 min et la placer sur de la glace pendant 2 min.
  3. Charger l'échelle dénaturée et les échantillons sur un gel d'urée TBE de 6,6 cm x 6,8 cm et un fractionnement de la taille par électrophorèse pendant 40 minutes à 180 V. Tacher le gel dans 10 ml de tampon TBE contenant 1: 10 000 de taches de gel d'acide nucléique pour 5 Min. Dans l'obscurité.
  4. Percez un tube de microcentrifugeuse propre de 0,6 mL au fond en utilisant une aiguille de 24 G et placez-le dans un tube de microcentrifugeuse de 2 mL.
  5. Visualiser les bandes sur le gel post-teint en utilisant un transilluminateur et couper une tranche de gel correspondant à 90-110 nt. Transférer la tranche de gel dans le tube de microcentrifugeuse 0,6 mL perforé dans le tube de microcentrifugeuse de 2 mL. Cette sélection de taille est effectuée pour permettre aux fragments chimériques d'avoir une longueur minimale à mapper au transcriptome et à distinguer entre les produits ligaturés de proximité contre les produits non liés dans les étapes de sélection de taille en aval.
  6. Centrifuger les tranches de gel à 12 000 xg à température ambiante pendant 2 minutes pour déchiqueter la tranche de gel et la recueillir dans le tube de microcentrifugeuse de 2 mL. Jeter le tube de microcentrifugation vide de 0,6 mL. Ajouter 700 μL de tampon d'élution à la tranche de gel déchiquetée dans le tube de microcentrifugeuse de 2 mL et incuber à 4 ° C pendant la nuit avec une rotation constante, pour permettre la diffusion des échantillons dans le tampon.
  7. Transférer les tranches de gel et le tampon d'élution dans un filtre à centrifuger et centrifuger à 20 000 xg pendant 2 min. Les tranches de gel seront piégées dans le compartiment supérieur du filtre. Jeter les tranches de gel et le compartiment supérieur.
  8. Ajouter 1 μl de glycogène et 700 μL d'isopropanol à 100% dans le filtrat dans le tube de microcentrifugeuse et précipiter l'ARN à -20 ° C pendant au moins 1 h ou pendant une nuit.
    Point de pause: l'ARN peut être précipité dans l'isopropanol indéfiniment à -20 ° C.
  9. Centrifuger l'ARN précipité à 20 000 xg pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer l'ARN. Retirez le surnageant et ajoutez 1 ml d'éthanol à froid à 70% pour laver la pastille d'ARN. Centrifuger la pastille lavée à 20 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
  10. Retirez le tampon de lavage et ajoutez 20 μL d'eau libre de nuclease pour ré-endiguer l'ARN. Quantifier la concentration d'ARN à l'aide d'un spectromètre UV.
    Point de pause: l'ARN peut être conservé à -80 ° C après la congélation instantanée dans l'azote liquide.

4. Enrichissement des régions de réticulation de l'ARN

  1. Vortex streptavidine a revêtu des billes magnétiques vigoureusement pour remettre en suspension les billes de manière homogène dans le tube. Transférer 100 μL de perles à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL et le placer sur un aimantIc repose pendant 1 min pour permettre aux perles de s'en tenir au côté magnétique du tube. Retirez le tampon de stockage des perles et retirez le tube du support d'aimant.
  2. Ajouter 1 ml de tampon de lyse sur les perles dans le tube de microcentre et la pipette de haut en bas. Placez la microcentruche contenant des perles sur le support magnétique pendant 1 minute pour séparer les billes du tampon de lavage. Répétez ceci pour un total de 3 lavages.
  3. Retirez le tampon de lavage des perles en plaçant la microcentre contenant des perles sur le support magnétique pendant 1 min. Ajouter un inhibiteur de RNase (1: 200) dans le tampon de lyse et ajouter 100 μL de tampon de lyse aux billes lavées dans le tube de microcentrifugeuse.
  4. Ajouter 2 mL de tampon d'hybridation fraîchement préparé, 1 mL de tampon de lyse supplémenté, 1,5 μg d'ARN fractionné en taille et 100 μL de billes resuspendues à un tube à centrifuger conique de 15 mL. Vortez le tube doucement.
  5. Incuber le tube de centrifugation conique de 15 mL à 37 ° C pendant 30 minutes avec une rotation de bout en bout.Préchauffer le tampon de lavage à 37 ° C.
  6. Placer les tubes centrifuges coniques de 15 mL sur un support magnétique pour 15 mL de tubes pendant 2 minutes pour séparer les grains du tampon. Pipettez le tampon prudemment hors du tube et jetez-le.
  7. Ajouter 1 ml de tampon de lavage pré-réchauffé sur les perles, pipeter vers le haut et vers le bas et transférer les perles dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Incuber aux perles à 37 ° C pendant 5 min, avec une rotation de bout en bout.
  8. Centrifuger brièvement le contenu du tube à microcentrifugeuse. Placez les perles lavées de 1,5 ml dans des tubes à microcentrifugeuse sur un support magnétique pour des tubes de 2 ml pendant 1 min, afin de séparer les billes du tampon de lavage. Retirez le tampon des billes en faisant pipeter doucement le tampon hors du tube de microcentre.
  9. Ajouter 1 ml de tampon de lavage préchauffé sur les perles et la pipette vers le haut et vers le bas pour répéter le lavage. Effectuez un total de 5 lavages. À la fin du 5ème lavage, retirer le tampon de lavage en plaçant le microfuge contenant des billes sur le support d'aimants pour1 minute.

5. Ligature de proximité

  1. Ajouter 1 ml de tampon de polynucléotide kinase T4 froid (PNK) aux perles lavées et incuber les perles pendant 5 min à 4 ° C, avec une rotation de bout en bout. Placez le tube de microcentre contenant les perles sur la bande magnétique pendant 1 min et retirez doucement le tampon T4 PNK. Répétez cette étape pour un total de 2 lavages et retirez le tampon T4 PNK après le dernier lavage.
  2. Ajouter les tampons aux perles, selon le tableau 1 . Pour permettre aux extrémités 3 'du fragment d'ARN d'être ligaturées à des adaptateurs 3' ci-dessous, incuber les perles dans le tampon à 37 ° C pendant 4 h avec agitation constante pour convertir le groupe phosphate cyclique 3 'à la fin de l'ARN en 3 'OH.
  3. Ajouter les tampons à la réaction précédente, selon le tableau 2 . Pour permettre à la fin 5 'des fragments d'ARN d'être compétente pour la ligature, incuber la réaction à 37 ° C pendant 1 h avec une agitation constante en présence d'ATP, Pour convertir 5 'OH sur l'ARN en 5' phosphate.
  4. Ajouter un tampon à la réaction précédente pour effectuer une ligature de proximité, selon le tableau 3 . Incuber la réaction à 16 ° C pendant 16 h, avec une agitation constante,
  5. Placez la microcentruche contenant l'ARN ligaturé sur un support d'aimant pendant 1 min. Retirez soigneusement le surnageant et ajoutez 1 ml de tampon de lavage à température ambiante sur les perles. Resuspendre en pipetant vers le haut et vers le bas.
  6. Placez le tube de microcentre sur le support d'aimant pendant 1 min et retirez le tampon de lavage avec précaution. Effectuez un total de 2 lavages et retirez le tampon de lavage des billes à la fin du deuxième lavage.
  7. Ajouter 100 μL de tampon RNA PK sur les billes et resuspendre par pipettage vers le haut et vers le bas. Chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 10 minutes sur un bloc de chaleur.
  8. Refroidir l'échantillon sur de la glace pendant 1 min et ajouter 500 μl de thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme à l'échantillon. Mélanger en vortexant vigoureusement pendant 10 s. Incuber le mixtuÀ température ambiante pendant 10 min.
    Point de pause: l'ARN peut être stocké dans du thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme à -80 ° C pendant quelques mois.
  9. Ajouter 100 μL de chloroforme aux échantillons de guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme extraits. Vortex vigoureusement pendant 10 s. Centrifuger les échantillons à 20 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
  10. Transférer 400 μL de la couche aqueuse à un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 800 μL (2 volumes) d'éthanol à 100% et mélanger en pipetant vers le haut et vers le bas.
  11. Transférer la solution d'ARN aux colonnes de nettoyage d'ARN et récupérer l'ARN suivant les instructions du fabricant, en veillant à ce que même les petits ARN soient retenus. Eluisez l'ARN dans 100 μL d'eau exempte de nuclease.
    Point de pause: l'ARN peut être conservé à -80 ° C après la congélation instantanée dans l'azote liquide.

6. Réticulation inverse du psoralène biotinylé

  1. Transférer les 100 μL des échantillons élués dans un puits de 24 puits pla mangé. Retirer le couvercle et irradier l'échantillon sous UV 254 nm, pendant 5 minutes sur de la glace.
  2. Transférer l'échantillon réticulé inversé à un tube de microcentrifugeuse propre. Ajouter 10 μl d'acétate de sodium, 1 μl de glycogène et 300 μL d'éthanol à 100% et précipiter l'ARN à -20 ° C pendant au moins 1 h ou toute une nuit.
    Point de pause: l'ARN peut être précipité dans l'éthanol indéfiniment à -20 ° C.
  3. Centrifuger l'ARN précipité à 20 000 xg pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer l'ARN. Retirez le surnageant et ajoutez 1 ml d'éthanol à froid à 70% pour laver la pastille d'ARN.
  4. Centrifuger la pastille lavée à 20 000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Retirez le tampon de lavage et ajoutez 4,25 μL d'eau libre de nucléase pour ré-endiguer l'ARN. Transférer l'ARN à un tube PCR de 0,2 ml.
    Point de pause: l'ARN peut être conservé à -80 ° C après la congélation instantanée dans l'azote liquide.

7. Transcription inverse et circulatoire d'ADNc

  1. Ajouter 0,75 μLDe liaison à l'ARN (0,5 μg / μL) à l'échantillon ressuscité dans le tube PCR et à la chaleur à 80 ° C pendant 90 s. Placez l'échantillon sur de la glace pendant 2 min.
  2. Ajouter les tampons à l'échantillon dénaturé pour la ligature d'adaptateur 3 ', selon le tableau 4 . Incuber la réaction à 25 ° C pendant 2,5 h.
  3. Transférer la réaction à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 90 μL d'eau libre de nuclease à la réaction, suivie de 10 μl d'acétate de sodium, 1 μL de glycogène et 300 μL d'éthanol à 100%. Précipiter l'ARN à -20 ° C pendant au moins 1 h ou pendant une nuit.
    Point de pause: l'ARN peut être précipité dans l'éthanol indéfiniment à -20 ° C.
  4. Centrifuger l'ARN précipité à 20 000 xg pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer l'ARN. Retirez le surnageant et ajoutez 1 ml d'éthanol à froid à 70% pour laver la pastille d'ARN.
  5. Centrifuger la pastille lavée à 20 000 g pendant 15 minutes à 4 ° C. Retirer le tampon de lavage remettre à nouveau le culot dans 5 μL de w libres de nucleaseAter.
  6. Ajouter 5 μL de colorant de chargement d'ARN à l'ARN récupéré dans le tube de microcentrifugeuse. Chauffer l'ARN avec le colorant de chargement de l'ARN à 95 ° C pendant 3 min et le placer sur de la glace pendant 2 min.
  7. Ajouter 3 μL de colorant de chargement d'ARN à 0,25 μL d'échelle d'ADN de 10 nt dans un tube à microcentre. Chauffer l'échelle à 95 ° C pendant 3 min et la placer sur de la glace pendant 2 min.
  8. Effectuer le fractionnement de la taille en utilisant un gel d'urée TBE de 8,6 cm x 6,8 cm, comme dans les étapes 3.3 et 3.4.
  9. Visualiser le gel coloré avec une tache d'acide nucléique en utilisant le transilluminateur et couper une tranche de gel correspondant à 110-140 nt sur l'échelle. Transférer la tranche de gel dans le tube de microcentrifugation 0,6 mL perforé dans le tube de microcentrifugeuse de 2 ml et suivre le protocole à partir des étapes 3,6 à 3,9.
  10. Ajouter 5 μl d'eau libre de nuclease pour ré-endiguer la pastille d'ARN. Transférer l'ARN à un tube PCR de 0,2 ml.
    Point de pause: l'ARN peut être conservé à -80 ° C après la congélation instantanée dans l'azote liquide.
  11. Ajouter 1 μL d'amorce RT à 1,2581; M à l'ARN dans le tube PCR et la chaleur à 80 ° C pendant 2 min. Placez l'échantillon sur de la glace pendant 2 min.
  12. Ajouter les tampons pour la transcription inverse selon le tableau 5 . Incuber la réaction à 50 ° C pendant 30 min.
  13. Ajouter 1,1 μl de NaOH 1 N à la réaction et chauffer à 98 ° C pendant 20 min. Placez la réaction sur la glace.
  14. Transférer la réaction à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 90 μL d'eau libre de nuclease à la réaction, suivie de 10 μl d'acétate de sodium, 1 μL de glycogène et 300 μL d'éthanol à 100%. Précipiter l'ADN à -20 ° C pendant au moins 1 h ou pendant une nuit.
    Point de pause: l'ADN peut être précipité dans l'éthanol indéfiniment à -20 ° C.
  15. Centrifuger l'ADN précipité à 20 000 g pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer l'ADN. Retirer le surnageant et ajouter 1 mL d'éthanol à froid à 70% pour laver le culot d'ADN. Centrifuger la pastille lavée à 20 000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Retirer le tampon de lavage remettre en suspension le pelLaisser entrer 5 μL d'eau libre de nuclease.
  16. Effectuer le fractionnement de la taille en utilisant un gel d'urée TBE de 8,6 cm x 6,8 cm, comme dans les étapes 3.3 et 3.4.
  17. Visualisez le gel post-teint en utilisant le transilluminateur et coupez une tranche de gel correspondant à 200-240 nt sur l'échelle. L'ADNc transcrit inverse est maintenant de 96 bases plus long que le fragment d'ARN en raison de l'addition de l'amorce RT à 96 bases. Transférer la tranche de gel dans le tube de microcentrifugeuse 0,6 mL perforé dans le tube de microcentrifugeuse de 2 mL.
  18. Centrifuger les tranches de gel à 12 000 xg à température ambiante pendant 2 minutes pour déchiqueter la tranche de gel et la recueillir dans le tube de microcentrifugeuse de 2 mL. Jeter le tube de microcentrifugation vide de 0,6 mL.
  19. Ajouter 700 μl de tampon d'élution à la tranche de gel déchiquetée dans le tube de microcentrifugeuse de 2 mL et incuber à 37 ° C pendant 2 h avec une rotation constante. Suivez le protocole comme décrit aux étapes 3.7 à 3.8.
  20. Ajouter 6 μl d'eau libre de nuclease pour ré-endiguer la pastille d'ADN. Transférer l'ADN à un tube PCR de 0,2 ml.
    Point de pause: l'ADN peut être stocké à -80 ° C après la congélation instantanée dans l'azote liquide.
  21. Ajouter les tampons à la réaction pour la circularisation d'ADNc, selon le tableau 6 . Incuber la réaction à 60 ° C pendant 1 h et chauffer à 80 ° C pendant 10 minutes pour inactiver la réaction.
  22. Transférer la réaction à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Purifier l'ADNc circulant à l'aide d'une colonne de nettoyage d'ADN suivant les instructions du fabricant. Ajouter 20 μL d'eau libre de nuclease à la colonne pour éluer l'ADNc purifié.
    Point de pause: l'ADN peut être stocké à -20 ° C pendant quelques mois.

8. Amplification par PCR (PCR à petite échelle)

  1. Ajouter les tampons à la réaction selon le Tableau 7 pour l'amplification PCR pour tester le nombre minimal de cycles nécessaires pour l'amplification de la bibliothèque.
  2. Mettre en place les conditions de cyclage PCR selon le tableau 8 . Pause la réaction et transfert 5 μL deLa réaction de PCR à 10, 15 et 20 cycles, dans des tubes séparés de microcentrifugation de 1,5 mL.
  3. Ajouter 1 μL de colorant de chargement de gel d'ADN 6x à chacune des 5 μL de réaction de PCR aux différents cycles. Effectuer une électrophorèse sur gel sur un gel d'agarose à 3%, à 120 V, pendant 1 h pour visualiser les produits de PCR.
    1. Utilisez le plus petit nombre de cycles de PCR (Y) qui montrent une amplification à environ 250 bases (à la Figure 3 , il existe une bande forte à 15 cycles d'amplification et une bande faible à 10 cycles. 12 cycles d'amplification PCR à grande échelle sont susceptibles de Génère suffisamment de matériel pour le séquençage profond car la quantité d'ADNc utilisée est 10 fois supérieure à celle de l'amplification PCR à petite échelle.

9. Amplification par PCR (PCR à grande échelle) et purification

  1. Ajouter les tampons à la réaction selon le tableau 9 pour l'amplification par PCR pour la PCR à grande échelle.
  2. Mettre en place les conditions de cyclage PCR selonTableau 10 .
  3. Ajouter 5 μL de colorant de chargement de gel d'ADN 6x aux 25 μL de réaction de PCR et charger dans un puits d'un gel d'agarose à 3%. Chargez 1 kb plus l'échelle d'ADN dans un puits séparé. Effectuer une électrophorèse sur gel à 100 V pendant 1,5 h.
  4. Visualisez le gel complet en utilisant un transilluminateur UV.
  5. Taille extrait une tranche de gel contenant des produits de PCR de 200 à 300 bases et transférez le gel à un tube de microcentrifugeuse propre de 2 mL.
  6. Ajouter 1 ml de tampon de solubilité dans le gel, d'un kit d'extraction au gel d'ADN, jusqu'à la tranche de gel et incuber à température ambiante pendant 30 min, ou jusqu'à dissolution du gel, avec une agitation constante.
  7. Ajouter 200 μL d'isopropanol au gel dissous et bien mélanger en pipettant. Transférer 700 μL de l'échantillon dans une colonne de nettoyage d'extraction de gel d'ADN et centrifuger à 13 000 xg pendant 30 s. Continuez à transférer l'échantillon dissous sur la colonne jusqu'à ce que tout l'échantillon ait été chargé sur la colonne.
  8. Ajouter 500 μL de tampon de solubilité dans le gel,Suivi de 700 μL de tampon de lavage de colonne, à la colonne, selon le protocole du fabricant. Ajouter 12 μl d'eau libre de nuclease au centre de la colonne pour échapper à l'ADN. Point de pause: l'ADN peut être stocké à -20 ° C.
  9. Quantifier la concentration de l'ADN en utilisant la quantification fluorométrique. Si plusieurs bibliothèques sont construites et regroupées pour le séquençage, ajoutez une quantité égale de chaque échantillon au pool, pour un séquençage à haut débit.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

La figure 1 représente le schéma du flux de travail SPLASH. Lors de l'addition de psoralène biotinylé en présence de 0,01% de digitonine et de réticulation UV, l'ARN total est extrait des cellules et un point-tache est réalisé pour s'assurer que la réticulation du biotinylé à l'ARN s'est produite efficacement ( figure 2 ). Nous utilisons des oligos biotinylés de 20 bases comme témoins positifs pour titrer la ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Ici, nous décrivons en détail le flux de travail expérimental et informatique pour SPLASH, une méthode qui nous permet d'identifier les interactions ARN en paire d'une manière généreuse. Nous avons utilisé avec succès SPLASH dans les cultures bactériennes, de levure et humaines et prévoyons que la stratégie peut être largement appliquée à divers organismes sous différents états cellulaires. L'une des étapes critiques du protocole consiste à commencer par au moins 20 μg d'ARN réticulé pour avoir un matéri...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire Wan et du laboratoire Nagarajan pour des discussions informatives. N. Nagarajan est soutenu par un financement de A * STAR. Y.Wan est soutenu par le financement de A * STAR et Society in Science-Branco Weiss Fellowship.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux


Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 kb Plus Échelle d’ADNLife Technologies Holdings Pte LtdÉchelle d’ADN10787026
10 pb Échelle d’ADNLife Technologies Holdings Pte Ltd10821-015Échelle d’ADN
20 % Solution SDSPremière BASEBUF-2052-1L  ;   ;
20x SSCFirst BASEBUF-3050-20X1L
3.0 M Solution d’acétate de sodiumFirst BASEBUF-1151-1L-pH5.2  ;   ;Requis pour la précipitation des acides nucléiques
Solution d’acrylamide/Bis à 40 %, 19:1Bio-Rad1610145TBE Composant de gel d’urée
Kit tampon Ambion LifeTechnologies Holdings Pte LtdAM9010
Persulfate d’ammonium, qualité moléculaire.   ;PromegaV3131° ;TBE Composant gel d’urée
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126-25G
ChloroformeMerck1.02445.1000Extraction d’ARN
Simple brin DNA ligaseEpicentreCL9025KCircLigase II ssDNA Ligase
Filtres à tube centrifugeSigma-AldrichCLS8160-96EAFiltres à tube centrifuge Costar Spin-X
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINESigma-AldrichD5628-1GPour le traitement cellulaire
Dark Reader Transilluminator  ;Clare Chemical ResearchDark Reader DR89X Transilluminateurlumière bleue Colorant
de chargement de gel d’ADN (6x)Life Technologies Holdings Pte LtdR0611Requis pour l’électroporation de gel d’agarose
Dulbecco’s Modified Eagle MediumPan BioTechP04-03500Pour la culture cellulaire Hela
Perles magnétiques de streptavidineLife Technologies Holdings Pte Ltd65002Dynabeads MyOne Streptavidin C1  ;
Support magnétique pour 15 mL tubesLife Technologies Holdings Pte Ltd12301DDynaMag-15
Support magnétique pour 15  ; mL tubesLife Technologies Holdings Pte Ltd12321DDynaMag-2
ThermoMixerEppendorf5382 000.015Eppendorf ThermoMixer  ; C
Psoralène biotinyléLife Technologies Holdings Pte Ltd29986EZ-Link Psoralène-PEG3-Biotine
F8T5/BL  ;HitachiF8T5/BL  ;Ampoule UV 365 nm
Fetal Bovine SerumLife Technologies Holdings Pte Ltd10270106  ;   ;Composants de Hela medium
FormamidePromegaH5052° ;   ;Composant dans le tampon d’hybridation
G8T5Sankyo-DenkiG8T5254 nm Bulbe UV
GlycogenLife Technologies Holdings Pte Ltd10814010Nécessaire pour la précipitation des acides nucléiques
NanodropLife Technologies Holdings Pte LtdNanodrop 2000Spectrophotomètre pour la quantification des acides nucléiques
Eau sans nucléases  ;Première BASEBUF-1180-500ml  ;   ;
Pénicilline Streptomycine  ;   ;Life Technologies Holdings Pte Ltd15140122  ;   ;Composants de Hela medium
ADN polymérase haute-fidélité (2x)Life Technologies Holdings Pte LtdF531L  ;Mélange maître PCR haute fidélité Phusion avec tampon HF (2x)
Set d’amorces 1New England BiolabsE7335L  ;Amorces PCR
Kit d’extraction de gel d’ADNQIAgen28106QIAquick Kit d’extraction de gel
Kit de quantification fluorométriqueLife Technologies Holdings Pte LtdQ32854Qubit dsDNA HS Assay Kit
de nettoyage de l’ARNQiagen74106RNeasy Mini Kit Colonne de membrane de silice
Inhibiteur de RNASELife Technologies Holdings Pte LtdAM2696SUPERase In
Transcriptase inverseLife Technologies Holdings Pte Ltd18080400SuperScript III Synthèse du premier brin SuperMix
Gel d’acide nucléique StainLife Technologies Holdings Pte LtdS11494SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucléotide kinaseNew England BiolabsM0201LEnzyme de réparation finale
T4 ARN Ligase 1New England BiolabsM0204LEnzyme pour ligature de proximité
T4 ARN Ligase 2, tronqué KQNew England BiolabsM0373LEnzyme pour ligature adaptatrice
TemedBio-Rad1610801TBE Composant de gel d’urée
Guanidinium thiocyanate-phénol-chloroformeLife Technologies Holdings Pte Ltd15596018TRIzol® ; Réactif pour l’extraction de l’ARN
UréeFirst BASEBIO-2070-5kg  ;   ;
Réticulant UVStratagene400072UV Stratalinker 1800
Transilluminateur UVUVP95-0417-01Pour la visualisation des bandes
Xylene Cyanol FFSigma-AldrichX4126-10G
Nettoyage de l’ADN itZymo Research  ;D4004Concentrateur d’ADN Zymo-5  ;
Liste des logiciels requis
Logiciel FastQC0.11.4http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
Logiciel SeqPrep1.0.7https://github.com/jstjohn/SeqPrep
Logiciel BWA0.7.12http://bio-bwa.sourceforge.net/
Logiciel SAMTOOLS1.2.1http://www.htslib.org/
Logiciel PULLSEQ1.0.2https://github.com/bcthomas/pullseq
Logiciel STAR2.5.0chttps://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py Script PYTHONPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py Script PYTHONPYTHON 2.7.11
pickJunctionReads.awk ScriptAWK AWK GNU 4.1.2https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M sodium acetate
< Tampon >lyse fort
50 mM Tris-Cl pH 7,0
10 mM EDTA
1 % SDS
Ajouter toujours Superase-in frais avant utilisation, sauf lors du lavage des billes
Proteinase K  ;
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7,0
1 mM EDTA
0,5 % SDS
Tampon d’hybridation
750 mM NaCl
1 % SDS
50 mM Tris-Cl pH 7,0
1 mM EDTA
15 % formamide (stocker dans l’obscurité à 4 ° ; C)
Ajoutez toujours Superase-in frais avant utilisation
< fort >2x tampon de lavage SSC
2x NaCl et citrate de sodium (SSC) (dilué à partir de 20x stock d’Invitrogen SSC)
0,5 % SDS
fort>2x tampon de fragmentation d’ARN
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8,3
2x charge d’ARN Colorant
95 % Formamide
0,02 % SDS
0,02 % bleu
0,01 % Xylène Cyanol
1 mM EDTA
RT séquence d’amorces :
AGATCGGAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG
à Kit https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src< de bromophénol<td colspan="4">3' Séquence adaptatrice d’ARN : 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC

Références

  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Méthode SPLASHréticulation aux UVligation de proximitéséquençage à haut débitextraction d'ARNélectrophorèse sur gelbilles magnétiquespipeline informatique
Cartographie des interactions ARN-ARN à l'échelle mondiale à l'aide de psoralène biotinylé
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.