La caractérisation régulière des cellules souches pluripotentes induites (CSPi), afin de déterminer le maintien de leur état pluripotent, est une étape importante avant que ces cellules ne soient utilisées pour d’autres applications. Nous décrivons ici une méthode de propagation à petite échelle des iPSC humaines, spécialement conçue pour permettre leur caractérisation facile et routinière par immunocytochimie.
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Article de méthode
Propagation à petite échelle des CSPi humaines dans des conditions sans sérum pour la caractérisation immunocytochimique Routine
Dans cet article
Résumé
Résumé
Il y a un grand intérêt à utiliser les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) pour la modélisation de maladies et les thérapies cellulaires en raison de leur spécificité pour le patient et de leur souche caractéristique. Cependant, la pluripotence des iPSC, essentielle à leur fonctionnalité, doit être confirmée avant que ces cellules puissent être utilisées dans de telles applications. Bien qu’une caractérisation rigoureuse des iPSC, par différents tests cellulaires et fonctionnels, soit nécessaire pour établir leur pluripotence, l’évaluation régulière du maintien de la pluripotence peut être réalisée plus simplement et plus efficacement grâce à des techniques immunocytochimiques. Ici, nous présentons un protocole systématique de culture des hiPSC, de manière réduite, afin de faciliter particulièrement la vérification de leur état pluripotent par immunocytochimie. Plus précisément, cette méthodologie englobe un moyen efficace et rentable de cultiver des iPSC dans des conditions sans sérum et de les plaquer sur de petites lames de chambre ou des lamelles de verre idéales pour l’immunocytochimie.
Introduction
Reprogrammation cellules somatiques humaines adultes en cellules souches pluripotentes induites (CSPi) fournit un moyen d'obtenir une offre potentiellement illimitée de cellules spécifiques au patient pour étudier les maladies 1, 2. Récapitulant un phénotype de la maladie in vitro , il serait plausible d'examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires associés à la maladie, et d' améliorer la découverte de médicaments et la médecine 3 personnalisé. En outre, CSPi humaines (hiPSCs) offrent la possibilité de dériver des types cellulaires spécifiques qui peuvent ê....
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Protocole
hiPSCs ont été obtenues à partir de fibroblastes dermiques humains isolés à partir de 4 mm biopsies de la peau et reprogrammées dans la maison via Sendai virus médiée reprogrammation 11. L'Université de l'Arizona Institutional Review Board a approuvé toutes les procédures pour le sujet du recrutement et de collecte de biopsie.
1. Préparation de la matrice extracellulaire Surface revêtu pour iPSC Culture
- Un jour avant la confluence des cultures hiPSC poussent sur iMEFs, préparer la matrice extracellulaire (Matrigel) des plaques enduites.
- dégel lent une aliquote de la matrice ext....
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Résultats
Ce protocole fournit une description étape par étape de la façon dont CSPi humaine peut être transférée de la couche d'alimentation à des conditions feeder-libre, et par la suite propagée de façon limitée pour permettre spécifiquement immunocytochimie rentable pour confirmer le maintien de la pluripotence. La figure 1 montre une représentation schématique de ce protocole. La figure 2A montre des colonies poussant sur hiPSC iMEFs dans des plaques 6 pu.......
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Discussion
Le protocole systématique présenté ici offre un gain de temps et la méthode rentable, sous la forme d'une technique de culture à échelle réduite, spécifiquement conçu pour soutenir une analyse efficace de la pluripotence via immunocytochimie.
Les principaux avantages de la méthode décrite sont les suivantes. Traditionnellement plus de 3 à 4 passages sont nécessaires pour la transition CSPi de couches nourricières de feeder-libres conditions de culture afin d'éliminer les iMEFs résidu.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Sources de financement : L’Université de l’Arizona, la Fondation Jim Himelic et le Centre de biologie des maladies complexes de l’Arizona.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Inhibiteur de ROCK humain recombinant FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 R | & D | 1254 | |
| Collagénase de type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Tampon de dissociation cellulaire douce | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0,1 M PO4 Tampon | interne | n/a | |
| Paraformaldéhyde, prill | Microscopie électronique Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Tamponné Saline | n/a | n/a n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Anticorps monobloc pour lapin, Sox2 (D6D9) Anticorps monobloc pour lapin, SSEA4 (MC813) Anticorps monobloc pour souris, TRA-1-60(S)) Anticorps monobloc pour souris | Signalisation cellulaire Signalisation cellulaire Signalisation cellulaire Signalisation cellulaire | 2840 3579 4755 4746 | Alternativement, une combinaison de 6 anticorps primaires de pluripotence peut être achetée ensemble sous forme de kit dans le catalogue #9656 |
| Chèvre anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Chèvre anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Chèvre anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Plaques | de culture cellulaire multipuitsFisher Scientific ; | 0720080/0720081 | Disponible en 6, 12, 24, 48, 96 tailles |
| de puits Lames de chambre | Fisher Scientific ; | 12 565 21 | Disponible en verre ou en plastique Permanox en 1, 2, 4, 8, 16 tailles |
| de puits Couvre-cœur pour la croissance | Fisher Scientific ; | 12 545 82 | Disponible en tailles 12, 15, 18, 22 et 25 mm |
Références
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, ....
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Réimpressions et autorisations
