Une chambre de mesure de la migration des cellules personnalisable

Summary

Ce protocole décrit en détail une méthode personnalisable pour mesurer la migration cellulaire en réponse à des chimioattracteurs qui peuvent également être utilisés pour déterminer le débit d'un médicament par diffusion hors d'une matrice de polymère.

Abstract

La migration cellulaire est une partie essentielle de la réponse immunitaire, la croissance et la cicatrisation des plaies. La migration cellulaire est un processus complexe qui fait intervenir des interactions entre les cellules, la matrice extracellulaire et des facteurs chimiques solubles et non solubles (par exemple, chemoattractants). méthodes standard pour la mesure de la migration des cellules, telles que le dosage de la chambre de Boyden, le travail en comptant les cellules de part et d'autre d'un diviseur. Ces techniques sont faciles à utiliser; cependant, ils offrent peu de modification géométrique pour différentes applications. En revanche, les dispositifs microfluidiques peuvent être utilisés pour observer la migration des cellules avec des gradients de concentration personnalisables des facteurs solubles ^{1, 2.} Cependant, des procédés de fabrication des tests microfluidique à base peuvent être difficiles à apprendre.

Ici, nous décrivons une méthode simple pour la création de chambres de culture cellulaire pour mesurer la migration cellulaire en réponse à des gradients de concentration du produit chimique. Nos mi cellulairesMéthode de la chambre gration peut créer différents gradients de concentration linéaire, afin d'étudier la migration des cellules pour une variété d'applications. Cette méthode est relativement facile à utiliser et est généralement effectuée par des étudiants de premier cycle.

La chambre de microcanaux a été créée en plaçant un insert acrylique en forme de la chambre de microcanaux finale bien dans une boîte de Pétri. Après cela, le poly (diméthylsiloxane) (PDMS), a été versé sur le dessus de l'insert. Le PDMS a été autorisé à durcir, puis l'insert a été retiré. Cela a permis la création de puits dans toute forme ou taille souhaitée. Les cellules peuvent ensuite être ajoutés à la chambre à micro-canaux, et des agents solubles peuvent être ajoutés à l'un des puits par trempage d'un bloc d'agarose à l'agent désiré. Le bloc d'agarose est ajouté à l'un des puits, et les images en accéléré peut être pris de la chambre de microcanaux afin de quantifier la migration cellulaire. Les variations de cette méthode peut être faite pour une application donnée, ce qui rend cette méthode highly personnalisable.

Introduction

Pour que des processus vitaux tels que la cicatrisation des plaies, les réponses immunitaires et le développement embryonnaire se produisent, la migration cellulaire doit avoir lieu. La migration cellulaire implique l’interaction entre les cellules et les cellules voisines, la matrice extracellulaire et les signaux chimiques solubles (attractifs ou répulsifs). À titre d’exemple, dans le processus de cicatrisation des plaies, les fibroblastes jouent un rôle essentiel dans la fibrogenèse et la contraction de la plaie, où les cellules sont recrutées sur le site de la lésion pour synthétiser le collagène afin de former la matrice extracellulaire ³. De nombreux mécanismes à l’origine de la migration des fibroblastes vers un site de plaie ont été étudiés, et ils comprennent différents facteurs mécaniques, physiques, électriques et chimiotactiques ⁴. Les fibroblastes réagissent particulièrement bien aux différents gradients de concentration des facteurs de croissance. Ces différents facteurs de croissance travaillent ensemble pour optimiser la régénération tissulaire⁵. Tout en observant la réponse chimiotactique des fibroblastes aux concentrations de facteurs de croissance, on peut étudier le modèle de migration directionnelle des fibroblastes et comment ils s’orientent autour des obstacles physiques afin d’atteindre leur destination. Par conséquent, les objectifs de cette étude étaient d’abord de développer un système dans lequel la croissance des fibroblastes pourrait être suivie sous la direction de barrières physiques, puis de modéliser la croissance des fibroblastes lorsqu’ils naviguent dans le système.

Actuellement, le test en chambre de Boyden est le système le plus largement utilisé pour mesurer la migration des cellules⁶. La chambre Boyden se compose d’une plaque multipuits à deux chambres où chaque puits peut contenir un milieu avec ou sans chimioattractants⁷. Une membrane filtrante assure une interface poreuse entre les deux chambres de chaque puits ; Cela crée une barrière qui empêche les cellules de passer à moins que ce ne soit par migration active. Typiquement, pour la chambre de Boyden, un chimioattractant est ajouté à la chambre inférieure, et le système est autorisé à s’équilibrer pour former un gradient entre les puits supérieur et inférieur⁴. L’un des problèmes de l’essai en chambre de Boyden est que des gradients abrupts finissent par se former le long d’un seul axe perpendiculaire à la surface de la membrane. Cela fait en sorte que la différence de concentration de chimioattractant entre les puits supérieur et inférieur est inférieure à ce qui était prévu à l’origine. En raison de cette contrainte, le test en chambre de Boyden rend difficile la corrélation entre des réponses cellulaires spécifiques et des caractéristiques de gradient particulières, telles que la pente et la différence de concentration. Sans ces mesures, il est difficile d’étudier l’intégration de signaux multi-gradients.

Pour répondre à certaines des contraintes du test traditionnel en chambre de Boyden, des tests microfluidiques ont été développés pour former des gradients de concentration personnalisables¹. Les méthodes standard de création de systèmes microfluidiques nécessitent des salles blanches pour les techniques lithographiques. Ces techniques peuvent être difficiles à apprendre, surtout dans une salle de classe standard. Ainsi, nous avons conçu un système de chambre pour mesurer la migration cellulaire qui peut être effectué sans utiliser de salle blanche. À l’aide de notre système, les puits de l’essai peuvent être ajustés à la taille souhaitée et un gradient de concentration linéaire de pente personnalisée peut être produit. Cela permet une mesure précise de la chimiotaxie à partir de mouvements aléatoires. Il s’agit d’un système peu coûteux et facile à utiliser pour modéliser la croissance cellulaire en réponse à différents stimuli chimiques.

Protocol

1. Produire une chambre Microchannel pour créer un gradient de concentration

1. Couper une pièce de moule acrylique
   1. Obtenir une feuille acrylique de la largeur souhaitée. Typiquement utiliser 1 feuilles acryliques / 16 pouces d'épaisseur. feuilles épaisses sont difficiles à couper ainsi et très minces feuilles ne pas la résistance mécanique, qui se cassent ou se déformer au cours du processus.
   2. Créer un fichier CAO avec la forme désirée de la pièce acrylique pour produire une cavité à l'intérieur du polydiméthylsiloxane (PDMS). Ajuster la largeur du canal et la longueur pour obtenir le gradient désiré correspondant à des protocoles expérimentaux individuels.
      1. Ici, utiliser une pièce acrylique des dimensions suivantes: deux carrés (0,254 cm x 0,254 cm) reliés par un canal large de 0,127 cm (0,254 cm de long) (Figure 1).
   3. Importer le fichier CAO dans l'appareil de découpe au laser et à placer la pièce acrylique dans une découpeuse à laser selon la fabrile protocole cant.
      REMARQUE: Vous pouvez également 3D imprimer la pièce à partir de la conception CAO. L'avantage de cette méthode est que les matériaux alternatifs peuvent être utilisés pour le moule; Cependant, la résolution et la reproductibilité peut être réduit grâce à l'impression en 3D par rapport à la découpe au laser.

Figure 1: Conception assistée par ordinateur (CAD) Représentation de Microchannel Chambre. Cette image représente le dessin CAO de l'insert acrylique nécessaire pour créer la chambre de microcanaux. 1 A) Vue de dessus dessin CAO, 1B) Vue latérale du CAD dessin avec dimensions en pouces, 1C) Vue de dessus CAD dessin avec dimensions en pouces S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Verser le polydiméthylsiloxane (PDMS)
   1. Dans un bateau peser, mélanger 10 parties en poids de base de Elastomer commerciale (par exemple Sylgard 184) avec 1 partie en poids d'élastomère commercial Agent de polymérisation (par exemple Sylgard 194). Typiquement, mélanger 10 g de Elastomère base à 1 g de Elastomer Agent de polymérisation.
   2. Bien mélanger la base et l'agent de durcissement avec une micropipette pendant 5 min.
   3. Mettre en place une cloche à vide et placer le bateau avec PDMS peser dans le vide pendant 30 minutes pour éliminer les bulles d'air piégées.
   4. Éteignez l'aspirateur et enlever le bateau peser. Verser le PDMS sur le dessus de la découpe acrylique dans une petite boîte de Pétri. Assurez-vous que les PDMS couvre complètement l'insert.
   5. Laisser les PDMS pour guérir la nuit (au moins 18 h) à la température ambiante.
3. Retrait de l'insert de PDMS
   1. Après le durcissement du PDMS, retirer l'insert en coupant soigneusement les PDMS autour de la pièce acrylique avec un scalpel.

2. Placage les cellules dans une chambre Microchannel

1. Stériliser la chambre pour le placage des cellules.
   REMARQUE: Pendant PDMS peuvent être stérilisés à l'oxyde d'éthylène ou d'autres techniques, un traitement UV rapide est rapide, peu coûteuse et suffisante pour les études de culture cellulaire. La durée du traitement UV courte n'a pas porté atteinte à l'intégrité de la structure ou mécanique de la pièce PDMS.
   1. Dans une armoire de culture cellulaire standard, couvrir complètement la chambre avec 70% d'éthanol.
   2. Mettez la boîte de Pétri dans une hotte à flux laminaire avec les couvercles hors.
   3. Fermez le capot et allumer la lumière UV. Exposer à la lumière UV pendant 1-2 h.
   4. Ouvrez le hotte à flux laminaire et attendre 15 min pour rétablir l'écoulement.
   5. Éliminer l'éthanol à 70%.
   6. Laver les chambres à deux reprises avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Utiliser 1 ml de PBS pour chaque lavage. Retirer du PBS et permettent chambres sécher toute la nuit avec les couvercles de congé.
      REMARQUE: Vous pouvez également, à la placed'utiliser une hotte à flux laminaire, utilisez une boîte de chambre UV pour la stérilisation, si l'on est disponible. Faire une boîte UV en plaçant une source de lumière UV dans le fond d'une boîte en carton doublée de papier d'aluminium. La feuille d'aluminium réfléchit la lumière pour permettre un éclairage uniforme de l'échantillon.
2. Placage des cellules dans la chambre
   1. Compter les cellules à l'aide de bleu Trypan et un hémocytomètre.
      1. Ajouter 100 ul de la suspension cellulaire à 400 pi de 0,4% Trypan bleu et mélanger doucement. Appliquer 100 pi de cette solution à l'hémocytomètre en remplissant les deux chambres doucement sous la lamelle couvre-objet en verre.
      2. Utiliser un microscope avec un objectif 10X à se concentrer sur la grille à l'hémocytomètre. Utilisez un compteur à main pour compter les cellules non colorées en direct au sein d'un ensemble de 16 places sur la hémocytomètre.
      3. Compter les cellules dans toutes les 4 séries de 16 cases. Prenez le nombre de cellules moyenne des 4 séries de 16 cases et multiplier par 5x10 ^4. Ce nombre final est le number des cellules / ml dans la suspension de cellules.
   2. Ajouter 2.500 cellules à un puits dans chaque chambre. Cela se traduit par une densité quasi-confluente de cellules ~ 30 000 / ^cm2.
   3. Laisser les cellules à siéger dans la chambre pendant 60 minutes avant d'ajouter les médias (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, 10% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline-streptomycine).

3. Blocs Agarose Dextran Soaked

1. Création d' un bloc d' agarose
   1. Verser 3% d'agarose dans le moule 3D imprimé (2 mm x 2 mm x 2 mm).
   2. Permettre à l'agarose se solidifie dans une chambre à vide pendant 30 minutes pour éliminer les bulles.
   3. Retirer le bloc d'agarose du moule.
      REMARQUE: Vous pouvez également verser 3% d'agarose dans petite boîte de Petri à une épaisseur de 2 mm. Découper un bloc x 2 mm x 2 mm 2 mm à l'aide d'un scalpel ou d'un autre outil de coupe. Ce ne sont pas aussi précis que le système de moule, mais il peut être un peu plus facile à faire.
2. Complètement submerge bloc d'agarose dans une solution de concentration voulue du facteur chimiotactique. Pour évaluer la formation de gradient de concentration, rincer la première chambre avec dextran fluorescent. La concentration et la masse moléculaire du dextrane doit correspondre à celui d'un facteur ou d'un médicament d'intérêt soluble.
3. Faire tremper le bloc nuit agarose.

4. Time-lapse de la Diffusion Dextran pour évaluer le gradient de concentration du facteur soluble

1. Placez le bloc d'agarose dextran trempé dans un petit puits carré de la chambre de microcanaux.
2. Placez la chambre de microcanaux dans un système d'imagerie cellulaire ou utiliser un autre microscope à fluorescence avec une capacité time-lapse. Commencez le time-lapse selon les instructions du fabricant.
   NOTE: Les résultats présentés sont prises avec filtre GFP, 50% de lumière, 4/10 pH et 4X grossissement.

5. Time-lapse de la croissance cellulaire

1. cellules de la plaque dans la chambre de microcanal à une extrémité de lachambre. Ici, utiliser des fibroblastes 3T3. Ajouter 2500 cellules à un puits dans la chambre à micro-canaux. Compter les cellules comme décrit au point 2.2.1.
   1. Laisser les cellules à siéger dans la chambre pendant 60 minutes avant d'ajouter les médias (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, 10% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline-streptomycine). Maintenir la chambre à micro - canaux avec des cellules étalées à 37 ° C dans 5% de _CO2. La migration des cellules à travers le canal peut être vu avec un microscope.
   2. Ajouter un marqueur ou d'utiliser un défaut microscopique dans la chambre comme un marqueur afin de servir comme point de départ pour quantifier la distance du front de la cellule se déplace.
2. Établir un gradient en plaçant un gel d'agarose à 8 mm ⁽³ à blocs) contenant le facteur de croissance concentré, chimio-attractant, un médicament ou un autre facteur à tester (ici 40% de FBS est utilisé comme exemple) à une extrémité du microcanal chambre.
3. Prenez des photos time-lapse de la face avant de la cellule en mouvement. Ici, les résultats montrent des images de la cellule front qui ont été prises toutes les 12 h en utilisant un système d'imagerie.
4. Utiliser des images de la face avant de la cellule pour quantifier le taux de croissance cellulaire. Calculer le taux en utilisant d'abord la fonction de polyfit MATLAB (roipoly) pour créer un masque polygonal défini par l'avant de la cellule, les parois du canal, et le marqueur de référence croissance. Les dimensions de ce masque donnent la distance de migration du front à partir de laquelle la vitesse du front de cellule moyenne est calculée. D' autres études ont utilisé une méthode similaire ^8.
   REMARQUE: comparer l'arête du front de croissance des cellules sur chaque trame de la concentration du facteur soluble à cette même distance. Soluble dans le gradient de concentration de facteur est calculée en utilisant un modèle de diffusion approximation 1D.
5. Prenez des images fluorescentes des cellules en utilisant phalloïdine et coloration DAPI.
   1. Fixer les cellules avant coloration avec phalloïdine.
      1. Chaud paraformaldéhyde 4% à 37 ° C.
      2. Ajouter suffisamment paraformaldéhyde 4% pour couvrir les cellules. Gardez les cellules dans leparaformaldéhyde pendant 10 min.
      3. Rincer deux fois avec PBS pendant 15 min à chaque fois. Utilisez suffisamment de PBS pour couvrir les cellules.
   2. Retirer du PBS à partir des cellules et ajouter une solution de perméabilisation suffisante (0,1% de Triton X-100 dans du PBS) pour recouvrir les cellules. Laisser la solution pendant 10 min.
   3. Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min à chaque fois. Utilisez suffisamment de PBS pour couvrir les cellules.
   4. Retirer du PBS à partir des cellules et ajouter la solution (1% d'albumine de sérum bovin dans du PBS) de blocage pendant 20 min.
   5. Retirer la solution de blocage et laver 2 fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois. Utilisez suffisamment de PBS pour couvrir les cellules.
   6. De ce point, protéger les cellules de la lumière avec une feuille d'aluminium lorsqu'ils ne sont pas utilisés. Retirer du PBS à partir des cellules et ajouter 488 phalloïdine dilué 1:50 dans du PBS pendant 1 h.
   7. Laver 2 fois dans du PBS pendant 5 min pour chaque lavage. Utilisez suffisamment de PBS pour couvrir les cellules. Ensuite, retirer PBS à partir de cellules.
   8. Ajouter le DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) dilué 1: 1000 dans du PBS à des cellules pendant 15 min.
   9. Retirer DAPI etlaver les cellules deux fois avec du PBS pendant 5 min pour chaque lavage.
   10. Retirez dernier lavage et ajouter suffisamment de PBS pour couvrir les cellules. Les cellules peuvent maintenant être imagés avec un microscope à fluorescence.

Results

La figure 2 montre le déplacement du front de la cellule à travers le canal en réponse à un gradient de sérum de veau fœtal placé à l'extrémité opposée du canal à partir duquel les cellules sont plaquées. La face avant de la cellule est représentée à 48 h (figure 2A), 72 h (figure 2B), 96 h (figure 2C), et 120 h (figure 2D) après placage. Le mouvement de l'avant de la cellule a été suivi avec ces images ...

Discussion

Notre chambre à micro-canaux peut être utilisé pour une multitude de fins, y compris la détermination du taux de migration cellulaire en réponse à des facteurs de croissance et chimioattractifs et en mesurant le taux d'un médicament par diffusion à partir d'une matrice de polymère. Il est possible d'utiliser notre chambre à microcanaux pour cultiver des cellules et placer un facteur chimiotactique à une extrémité de la chambre. Les cellules se développent en réponse à la chimiotactique, et la migration des c...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone	Sigma-Aldrich	761036	poly(diméthylsiloxane) Kit en 2 parties comprenant une base en élastomère de silicone et un agent de durcissement en élastomère de silicone
Feuilles acryliques	US Plastic	44200
Boîtes de Pétri jetables  ;	Faucon  ;	25373-041
Isothiocyanate de fluorescéine&ndash ; dextran	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Agarose, type I, faible EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Dulbecco’s Eagle’s Medium	Fisher Scientific	11965092	Composants des milieux cellulaires
Sérum de veau fœtal	Fisher	Scientific 16000036	Composants des milieux cellulaires
Pénicilline-streptomycine	Fisher Scientific	15140148	Composants des milieux cellulaires
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Fisher Scientific	BP24384
Système d’imagerie cellulaire EVOS XL	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Instrument utilisé pour la prise d’images en accéléré
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	Numéro de modèle VLS2.30	Découpeuse laser utilisée pour la découpe du plastique