Article de méthode

Une procédure exhaustive pour évaluer la

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DOI :

10.3791/55271

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4 mars 2017

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1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Translational and Molecular Imaging Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Dans cet article

Résumé

La mauvaise compréhension des performances in vivo des nanomédicaments entrave leur traduction clinique. Les procédures d’évaluation du comportement in vivo des nanomédicaments anticancéreux aux niveaux systémique, tissulaire, unicellulaire et subcellulaire chez des souris immunocompétentes porteuses de tumeurs sont décrites ici. Cette approche pourrait aider les chercheurs à identifier des nanomédicaments anticancéreux prometteurs pour l’application clinique.

Résumé

Inspiré par le succès de la nanomédecine cancéreuses précédentes dans la clinique, les chercheurs ont généré un grand nombre de nouvelles formulations dans la dernière décennie. Cependant, seul un petit nombre de nanomedicines ont été approuvés pour une utilisation clinique, alors que la majorité des nanomedicines en cours de développement clinique ont donné des résultats décevants. Un obstacle majeur à la traduction clinique réussie de nouveaux nanomédicaments de cancer est le manque d'une compréhension précise de leurs performances in vivo. Cet article propose une procédure rigoureuse pour caractériser le comportement in vivo des nanomedicines chez des souris portant une tumeur chez systémique, un tissu, une seule cellule, et les niveaux intracellulaires par l'intégration de la tomographie par émission de positons, la tomographie par ordinateur (PET-CT), les méthodes de la radioactivité de quantification , cytométrie en flux et la microscopie de fluorescence. En utilisant cette approche, les chercheurs peuvent évaluer avec précision de nouvelles formulations à l'échelle nanométrique dans les modèles de souris pertinentes de cationr. Ces protocoles peuvent avoir la capacité d'identifier les nanomédicaments de cancer les plus prometteurs avec un potentiel de translation élevée ou pour aider à l'optimisation des nanomédicaments de cancer pour la traduction future.

Introduction

Nanomédecine se déplace le paradigme du développement du traitement du cancer 1. Inspiré par l'impact clinique énorme de nanomédicaments cancéreuses précédentes, telles que liposome et nanotherapies à base d' albumine 2, 3, de nombreuses nouvelles formulations ont été produites dans la dernière décennie. Cependant, les récentes analyses de la réussite de la traduction clinique de ces nanomédicaments de cancer indiquent que seulement quelques - uns d'entre eux ont été approuvés pour une utilisation clinique 4, 5. Un obstacle majeur à la traduction clinique de nouveaux nanomédicaments cancéreuses est leur amélioration limitée de l'indice thérapeutique par rapport à l'administration directe des composés thérapeutiques libres 6. En tant que tel, l' évaluation précise de la performance in vivo de la nanomédecine à systémique, les tissus et les niveaux cellulaires dans des modèles animaux précliniques est essentielle pour identify ceux qui ont des indices thérapeutiques optimaux pour la traduction clinique future.

Nanomatériaux peuvent être radiomarqués pour la caractérisation quantitative des animaux vivant avec la tomographie par émission de positrons (TEP), qui est excellente sensibilité et la reproductibilité entre toutes les modalités d'imagerie clinique 7. Par exemple, 89 Zr marqué longue durée de circulation nanomedicines ont été caractérisés dans des modèles murins de cancer 8, 9, 10, ainsi que dans d' autres modèles de maladie 11. En outre, la demi-vie dans le sang et la biodistribution des nanomedicines peuvent être largement évalués en utilisant ex vivo des mesures de radioactivité dans les tissus individuels 8. Par conséquent, radiomarquage permet l'évaluation quantitative de la nanomédecine à des niveaux systémiques et de tissus.

Surtout, radiolabelenanomédicaments d ne peuvent généralement pas être analysées à la seule cellule ou niveaux subcellulaire en raison de la résolution spatiale limitée du signal radioactif. Par conséquent, un marquage fluorescent se révèle être une modalité complémentaire pour l'évaluation des nanoparticules avec des techniques d'imagerie optiques , telles que la cytométrie en flux et la microscopie de fluorescence 12. A cet effet, les nanoparticules marquées avec des radio - isotopes et les étiquettes fluorescentes peuvent être évalués de façon quantitative in vivo par imagerie nucléaire et ex vivo par comptage de la radioactivité, et ils peuvent également être caractérisées largement au niveau cellulaire par l' imagerie optique.

Auparavant, nous avons mis au point des procédures modulaires pour incorporer des marqueurs radioactifs et des nanoparticules fluorescentes diverses, y compris des lipoprotéines de haute densité (HDL) 11, 9, 10 des liposomes, des nanoparticules polymères, des fragments d' anticorps, et nanoemulsions 10, 13. Ces nanoparticules marquées ont permis pour la caractérisation quantitative dans des modèles animaux pertinents à différents niveaux, qui ont guidé l'optimisation de ces nanomatériaux pour leurs applications spécifiques. Dans l'étude actuelle, l'objectif est d'utiliser des nanoparticules-la liposomales plate - forme de nanomédecine le plus établi 14 -comme un exemple pour démontrer des procédures complètes pour générer une nanoparticule à double marquage et de caractériser soigneusement dans un modèle de souris classique de mélanome syngénique B16-F10 15 . D'après les résultats, nous sommes convaincus que cette approche de caractérisation des nanoparticules peut être adapté pour évaluer d'autres nanomédicaments de cancer chez les souris modèles pertinents.

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Protocole

La procédure consiste en la double étiquetage radioactif et fluorescent de nanoparticules, in vivo PET-CT imagerie, ex vivo mesures de biodistribution, et ex vivo immunocoloration et cytométrie en flux des analyses. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation Commission institutionnelle animale du Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

1. Préparation de liposomes à double marquage

REMARQUE: syngéniques des tumeurs de mélanome B16 peut être induite par l'injection de 300.000 cellules B16-F10 dans les flancs arrières des souris C57BL / 6, sous anesthésie à l'inhalation de 2% -isoflurane contenant de l'oxygène. Utiliser des réactifs et des outils stériles dans un espace de travail stérile pendant la chirurgie. Après la chirurgie, observer attentivement les animaux jusqu'à leur récupération de l'anesthésie. Mettez les animaux de retour dans leurs cages seulement quand ils retrouvent la pleine conscience et la mobilité. Maison-les dans des chambres stériles pour les animaux atteints de tumeurs xénogreffes. Tumeurs avec une taillede 300 mm 3 sont idéales pour la caractérisation des nanoparticules en raison de leur perméabilité et de rétention améliorées effets prononcés (EPR), ce qui peut augmenter l' accumulation de nanoparticules. Les protocoles détaillés sont fournis ci-dessous.

  1. Dans un ballon à fond rond, on dissout un mélange de 20 mg de lipides dans 2 ml de chloroforme contenant du 1,2-dipalmitoyl- sn - glycéro-3-phophocholine (DPPC), le cholestérol, le 1,2-sn disearoyl- -glycero- 3-phosphoéthanolamine-poly (éthylène glycol) 2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-déféroxamine (DFO-DSPE) 8, et de l' acide 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-disulfonique ( DiIC12 [5] -DS) à des taux de 61,3%, 33,4%, 5, 0,2% et 0,1%, respectivement molaires.
    Remarque: Cette composition lipidique est très similaire à la formulation liposomique de doxorubicine actuellement utilisés en clinique 2. Les liposomes résultants de notre procédure imitent étroitement la performance in vivo de l'nanomedic cliniqueine.
  2. Utiliser un évaporateur rotatif pour éliminer le solvant organique et former un mince film de lipides à température ambiante. Ajouter 20 ml de PBS et sonication pendant 30 min pour produire des nanoparticules liposomiales en utilisant une pointe de sonication de 3,8 mm et une amplitude de 30 W, avec un refroidissement suffisant sur la glace.
  3. Centrifuger la solution de liposomes à 4000 xg pendant 10 min pour éliminer les agrégats et laver les nanoparticules avec du PBS en utilisant une filtration centrifuge (poids moléculaire de coupure (MWCO:. 100 kDa) pour éliminer les lipides libres et solvant organique résiduel concentrer les liposomes, qui sera restent dans la chambre supérieure, et les transférer vers un nouveau tube. les liposomes peuvent être stockés dans un réfrigérateur dans du PBS pendant 1 semaine avant les étapes ultérieures.
  4. Pour le contrôle de la qualité, de caractériser les liposomes par diffusion de lumière dynamique (DLS). Plus précisément, mélanger 50 pi de liposomes avec 950 pi de PBS, puis transférer le mélange dans la cuvette de calibrage. Placez la cuvette dans l'analyseur et de mesurer la particuletailles et leur distribution de taille. La taille des particules et leur distribution granulométrique (indice de polydispersité (PDI)) devraient être 90-120 nm et 0,1-0,2, respectivement.
  5. Pour le marquage radioactif, mélanger les liposomes purifiés, ce qui équivaut à 2 mg de lipides dans du PBS à un pH compris entre 6,9 et 7,1 avec 1 mCi de 89 Zr-oxalate à 37 ° C pendant 2 h dans un tube de 1,5 ml (volume total: ~ 100 ul). Retirez le libre, qui n'a pas réagi 89 Zr par filtration centrifuge (MWCO = 100 kDa), similaire à l' étape 1.3. Laver le rétentat avec du PBS stérile et on dilue au volume désiré. Le rendement radiochimique devrait être de 80 - 95%.
    MISE EN GARDE! Travailler avec des matières radioactives est très réglementé. Les institutions doivent être certifiés et de fournir les installations nécessaires, la formation du personnel et le contrôle strict de l'utilisation de la radioactivité. Les chercheurs ont besoin de recevoir une formation adéquate et porter un équipement de protection personnelle et bagues dosimétriques / badges lors de la manipulation de la radioactivité.
  6. Déterminer la pureté radiochimique des liposomes radiomarqués par exclusion de taille radio HPLC, qui devrait généralement être supérieur à 98% 10. puretés radiochimiques inférieures à 95% sont indicatifs de lavage insuffisant à l'étape 1.5.
  7. Après radiomarquage, déterminer la taille des nanoparticules par diffusion de lumière dynamique. La taille et de préparation sont censés se trouver dans la même plage que les mesures effectuées dans l' étape 1.4 10.
    NOTE: Si les échantillons radioactifs ne sont pas autorisés dans le cytomètre de flux ou un microscope à fluorescence, nat non radioactif Zr-oxalate peut être utilisé pour marquer des liposomes à l' étape 1.5. Ces liposomes non radioactifs ont des caractéristiques identiques à leurs analogues radioactifs. Une description de cette procédure est présenté à la figure 2.

2. In Vivo PET-CT Imaging et biodistribution des liposomes à double marquage

  1. Injecter environ 100 pi de liposomes à double marquage wi - ième environ 300 uCi de radioactivité dans les souris de mélanome retenus (C57BL / 6, femelle, 10 - 16 semaines) dans les veines de la queue, à environ 10 mCi de 89 Zr / kg de poids corporel.
  2. Pour déterminer la demi-vie, prélever du sang de la veine de la queue des animaux anesthésiés moins de 2% d'oxygène isoflurane contenant en utilisant 28-G seringues à insuline. Recueillir le sang (10 - 20 pi) dans des tubes préalablement pesés à 2 min, 15 min, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h et 48 h après l'injection. Peser le sang par différence, de déterminer la teneur en radioactivité en utilisant un compteur gamma, et calculer la concentration en radioactivité en pourcentage de la dose injectée par gramme (% ID / g).
    REMARQUE: Effectuez la procédure dans une salle équipée d'un système d'anesthésie, des cages de récupération, le chauffage et une hotte de biohazard. Assurez-vous que les animaux se rétablir et à acquérir une mobilité normale après la procédure avant de les transférer à partir des cages de récupération à la tenue des cages entièrement. Maison les animaux Les porteurs de tumeurs dans les salles désignées pour les animaux administrés avecmatériaux radioactifs.
  3. 24 ou 48 heures après l'injection du liposomes, l' image des souris dans un petit animal microTEP-CT scanner 10. Placez l'animal anesthésié horizontalement sur le ventre et le garder anesthésié. Administrer 2% d'isoflurane-oxygène à travers un cône de nez. Appliquer une pommade ophtalmique à ses yeux avant de l'analyse pour les empêcher de sécher.
  4. Effectuer une TEP du corps entier statique enregistrement de balayage d'au moins 50 millions d'événements qui coïncident avec une durée approximative de 15 minutes. Réglez la fenêtre de temps et d'énergie au hasard 350-700 keV et 6 ns, respectivement. Ensuite, effectuez 5 min tomodensitométrie (TDM). Réglez le tube à rayons X à une tension de 80 kV et un courant de 500 uA; le scanner utilise 120 étapes de rotation pour un total de 220 degrés, avec environ 145 ms par image 10.
  5. Après l'analyse PET-CT, sacrifier immédiatement les souris par le dioxyde de carbone et l'asphyxie confirmer les décès par pinching les pattes des animaux. Une fois confirmé, effectuer des dislocations cervicales.
  6. Retirez le sang dans les tissus de la souris par la première coupe ouverte l'oreillette droite puis en injectant 20 ml de PBS dans le ventricule gauche, et ensuite recueillir les tissus pertinents tels que la tumeur, le foie, la rate, les poumons, les reins, les muscles et les autres 16.
  7. Peser les tissus, de mesurer leur teneur en radioactivité par comptage gamma 8, 9, et calculer l'accumulation de radioactivité des tissus en pourcentage de la dose injectée par gramme (% ID / g).

3. Ex Vivo cytométrie de flux et immunocoloration

REMARQUE: Injecter 100 ul de liposomes fluorescents dans des souris de mélanome par leur veine de la queue à une dose de 0,5 mg de colorant par kg de poids corporel. Si des échantillons radioactifs ne sont pas autorisés dans la cytométrie de flux et de microscope à fluorescence, les liposomes non radioactifs doivent être utilisés.

  1. Sacrifiez l'injection post-souris 24 h, comme à l'étape 2.5, et de recueillir les tumeurs, qui doivent être stockés dans du PBS froid.
  2. Pour cytométrie de flux, procédez comme suit 17:
    1. Préparer un cocktail enzymatique consistant en un mélange de purifié collagénase I et II (4 U / ml), de la hyaluronidase (60 U / ml) et de la DNase I (60 U / ml) dans cytométrie en flux tampon (PBS avec 0,5% de BSA et 1 mM EDTA).
    2. Mélanger 100 mg de tissu tumoral avec 200 ul de tampon de cocktail enzymatique dans un tube de 1,5 ml et couper le tissu en petits morceaux avec des ciseaux fins. Ajouter un autre 1,3 ml de cocktail enzymatique dans le tube et transférer son contenu à une plaque de 6 puits.
    3. Agiter la plaque à 6 puits sur un agitateur horizontal placé dans un four à 37 ° C pendant 60 min à 60 tours par minute.
    4. Laver l'homogénat de tissu avec une cytométrie en flux tampon 3 fois pour obtenir une suspension cellulaire unique.
    5. Colorer les cellules avec un cocktail d'anticorps spécifiques aux biomarqueurs, y compris CD45, CD11b, Ly6C, CD11c,CD64, CD3, MHCII, et CD31 (dilution 1: 200 pour l'ensemble des anticorps, des informations de clonage est prévu dans la feuille de matériau). Identifier les types de cellules pertinentes et de déterminer leur intensité de fluorescence moyenne (MFI) de DiIC12 (5) -ds dans chaque population de cellules avec un débit approprié cytométrie logiciel d'analyse.
  3. Pour immunocoloration, procédez comme suit:
    1. Placez une tumeur dans une cassette remplie de milieu de coupe optimale (OCT) et le congeler sur glace sèche.
    2. Faire des coupes congelées 6 um de tissu tumoral et les placer sur des lames de verre d'histologie; les sections devraient couvrir les plus grandes sections transversales de la tumeur, qui fournissent les informations les plus représentatives sur le tissu.
    3. Colorer les biomarqueurs (par exemple, CD31 pour les cellules endothéliales) d'intérêt avec les anticorps (par exemple, anti-CD31, clone MEC13.3) correspondant. Fixer les sections avec paraformaldéhyde; les bloquer avec du sérum correspondant à l'origine des espèces des anticorps secondaires; Incubate avec des anticorps primaires pendant 12 h à 4 ° C, puis avec des anticorps secondaires pendant 2 h; et enfin, laver avec du PBS et couvrir avec des lamelles. Image Les lames colorées avec un Leica confocal debout SP5 microscope 13, 16.

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Résultats

La figure 1 montre une vue d' ensemble de la procédure. La figure 2 présente un mode opératoire de synthèse schématique des liposomes à double marquage décrites à l' étape 1 10. La figure 3 montre un représentant PET-CT d' image (Figure 3a), la radioactivité quantification de l' imagerie TEP (Figure 3b), la demi-vie dans le sang (Figure 3c), et bio...

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Discussion

Étapes critiques au sein du Protocole:

La haute qualité des liposomes à double marquage est la clé pour produire des résultats cohérents sur une longue période de temps. Colorants fluorescents gratuites ou 89 ions Zr peuvent générer totalement différents modèles de ciblage et doivent être complètement enlevés lors de l'étape de purification. En outre, si le système immunitaire affecte de manière significative les performances du expérimental nanomedicine du cancer, l'utilisat...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune divulgation à faire.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les Dres Helene Salmon et Miriam Merad de l’Icahn School of Medicine du Mount Sinai pour avoir fourni les cellules B16-F10-YFP et pour leurs conseils d’experts sur les modèles murins de mélanome. Les auteurs remercient également la plateforme d’imagerie animale, la plateforme de radiochimie et de sondes d’imagerie moléculaire et la plateforme de cytologie moléculaire du Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) pour leur soutien. Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) et P30 CA008748 (MSK Center Grant). Les auteurs remercient également le Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT) de MSK pour leur soutien financier (T.R.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DPPCAvantilipids850355
CholestérolSigma-AldrichC8667
DSPE-PEG2000Avantilipids880120P
DSPE-DFOFait maison110634Perez-Medina et al., JNM, 2014
DiIC12[5]-DSAAT Bioquest22051
Filtre centrifugeVivaproductsVS2061
Évaporateur rotatifBuchiR-100
Radio-HPLCShimadzu HPLC avec 2 pompes LC-10ATN/A
89Zr-oxalateMSKCCSynthétisé en interneTR19/9 cyclotron à faisceau variable (Ebco Industries Inc.)
Micro TEP-CTSiemensInveon Micro-TEP/CT
Compteur gammaPerkinElmer2470-0150
Cytométrie en fluxBD BiosciencesFortessa N’importequel analyseur de cytométrie en flux multiparamétrique suffirait
C57BL/6 sourisJackson Laboratories
B16-YFP Cellules de mélanomeFabrication maisonN/ASaumon et al., Immunité, 2016
Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7128025Biolegend
MHCII (M5/114/152)--APC107613Biolegend
CD45 (30-F11)--BV510103137Biolegend
CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7139313Biolegend
CD11b (M1/70)--BV605101237Biolegend
CD3 (17A2)--BV711100241Biolegend
CD31 (13.3)--PE561073Biolegend
CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5117327BD Biosciences
CD31 (13.3) sans fluorophore550274BD Biosciences

Références

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Mots-clés

Imagerie TEP TDMcytom trie en fluxmicroscopie fluorescencequantification de la radioactivitsouris porteuses de tumeursformulation de liposomesmarquage au zirconium 89biodistribution ex vivo

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