Méthodes pour l'auto-intégration de Megamolecular biopolymères sur le séchage à l'air-LC Interface

Résumé

Procédé pour l'auto-intégration de séchage induite par des biopolymères megamolecular sur l'interface air-liquide cristallin est fournie ici. Cette méthodologie sera utile non seulement pour comprendre les potentiels macroscopiques de biopolymères, mais aussi comme une méthode d'évaluation des matériaux souples dans les domaines biomédical et environnemental.

Résumé

Les organismes vivants qui utilisent de l'eau sont toujours sujettes à sécher dans l'environnement. Leurs activités sont caractérisées par des structures macro-micro et à base de biopolymères, comme on le voit dans le cas de l'eau en mouvement dans les faisceaux vasculaires et de l'eau dans l'hydratation des couches de la peau. Dans cette étude, nous avons développé un procédé pour évaluer l'effet des solutions à cristaux liquides aqueux (LC) composées de biopolymères sur le séchage. Comme LC biopolymères ont un poids megamolecular, nous avons choisi d'étudier les polysaccharides, les protéines du cytosquelette, et l'ADN. L'observation des solutions de biopolymère au cours du séchage sous lumière polarisée révèle auto-intégration milliscale à partir de l'interface air-LC instable. La dynamique des solutions aqueuses de biopolymères LC peuvent être contrôlées par évaporation de l'eau à partir d'une cellule d'un côté ouvert. En analysant les images prises en utilisant une lumière à polarisation croisée, il est possible de reconnaître les changements spatio-temporels dans le paramètre d'ordre d' orientation. Ceméthode peut être utile pour la caractérisation non seulement des matériaux artificiels dans divers domaines, mais aussi les tissus vivants naturels. Nous croyons qu'il fournira une méthode d'évaluation des matériaux souples dans les domaines biomédical et environnemental.

Introduction

En se concentrant sur les structures rigides, en forme de tige de biopolymères, matériaux souples dynamiques ont été utilisées pour diverses applications, y compris les matrices de biofilm de polysaccharide ^1, « gels actifs » composés de protéines du cytosquelette ² et « ADN origami » des formes souhaitées ^3. Pour clarifier les propriétés structurelles, de nombreuses stratégies ont été explorées, telles que microscopie électronique à transmission, microscopie électronique à balayage, microscopie à force atomique et la microscopie à fluorescence confocale. Cependant, ces méthodes sont principalement effectuées dans un état statique ou séché, il est difficile d'expliquer les comportements dynamiques dans les échelles macroscopiques, comme on le voit dans les systèmes vivants réels. Récemment, nous avons observé avec succès le comportement dynamique de biopolymères sur l'interface air-LC aqueuse à travers une lumière polarisée ^4. Au cours de la visualisation de la structure orientée pendant le séchage du biopolymèresolution, les changements temporels indiqués auto-intégration de biopolymères sur l'interface air-LC instable.

Ici, nous décrivons un protocole pour le séchage des solutions LC biopolymères à l'interface air-LC en utilisant des instruments polarisés. Par opposition à d' autres analyses de la phase à cristaux liquides qui ne tient pas compte de séchage ^{5, 6,} la dynamique LC au cours du processus de séchage ont été étudiés ici en évaluant le paramètre d'ordre d' orientation dans la vue latérale de la phase fluide dans une cellule ouverte d' un côté . La combinaison de l'évaporation de la cellule et l'utilisation d'instruments à polarisation autorisées pour la surveillance macroscopique avec une direction d'évaporation contrôlée. De plus, il est possible de valider les dossiers de séchage en mettant l' accent sur les structures cristallines des microdomaines adsorbées, qui ont été affectées par le poids moléculaire, la concentration, etc. Pour démontrer l'efficacité de la méthode, le pro de séchagecessus de biopolymères de base avec des formes de tiges rigides, telles que des polysaccharides, des microtubules (MT), et de l'ADN, ont été étudiés. Nous avons choisi ces biopolymères parce qu'ils sont des exemples typiques de macromolécules hiérarchiques avec des poids megamolecular, et leurs interactions intermoléculaires leur permettent de former des états LC.

Protocole

1. Instruments

1. Dispositif de Polarisation
   1. Pour construire un dispositif de polarisation, une source de lumière avec une lampe à halogène, un guide de lumière, des polariseurs, un étage d'échantillon, un rail optique, la tige se tient, et un appareil photo reflex mono-objectif numérique (voir la figure 1C et les matériaux de la liste pour la polarisation parties du dispositif).

2. Préparation de la solution de biopolymère

1. Solutions polysaccharidiques
   1. Dissoudre Sacran ⁷ (0,5 g) dans de l' eau pure (100 ml) , on a agité à ~ 80 ° C pendant plus de 12 h. Au cours de la dissolution, recouvrir le récipient avec une pellicule de plastique pour empêcher l'évaporation. Préparer une solution aqueuse de gomme xanthane de la même manière.
   2. Refroidir les solutions à ~ 25 ° C pour obtenir 0,5% en poids de solutions aqueuses.
   3. Centrifuger la solution pour éliminer les impuretés Sacran (48400 xg, 4 ° C, 1 h, 3 times).
2. solution MT
   1. Préparer une solution de tubuline 0,5% en poids (1 ml) dans un tampon de Britton-Robinson (80 mM pipérazine N, N '-bis (2-éthanesulfonique) (PIPES), 1 mM d' éthylène glycol-bis (éther β-aminoéthyl) - N, N, N 'N' acide tétraacétique (EGTA), et 5 mM de _MgCl2, pH 6,8) sur de la glace ^8.
   2. Utiliser 0,5% en poids de solution de tubuline (50 pi) et la guanosine-5' - [(α, β) -methyleno] triphosphate (GpCpp) (5 pi) pour préparer une solution de tubuline contenant GpCpp (50 ul). Incuber à 37 ° C pendant 3 h pour obtenir un noyau MT stable.
      NOTE: Le rôle de GpCpp est de soutenir la formation MT et de supprimer complètement la dépolymérisation de MT à la tubuline.
   3. Mélanger la solution de tubuline 0,5% en poids (950 ul) et la solution de tubuline contenant GpCpp (50 ul) à ~ 25 ° C pendant 1 jour pour obtenir une solution stable de MT 0,5% en poids.
3. Solution d'ADN
   1. Préparer une solution d'ADN de 0,5% en poids (1 ml) dans une solution tampon Tris-EDTA (Tris 10 mM, pH 8,0, 1 mM EDTA).
4. Garder les à 25 ° C 0,5% en poids de solutions d'échantillon de biopolymère pour l'expérience de séchage.

3. Les expériences de séchage et d'observation sous la lumière de polarisation croisée

1. Solutions dans une cellule d' un côté ouvert (figure 1A)
   1. Couper une feuille de silicium (voir Matériaux List) dans une forme appropriée d'une épaisseur de 1 mm (dimension intérieure de 15/05 mm, 1 mm, et ~ 20 mm; la figure 1A).
      1. Assembler une cellule ouverte d'un côté constitué d'une entretoise de silicium à dimension intérieure de 15/05 mm, 1 mm, et ~ 20 mm et de deux lames de verre non modifiées (76 mm x 1 mm x 26 mm). Fixer les deux côtés de la cellule avec deux clips à l'avance afin de maintenir la solution d'échantillon de fuir.
   2. Lentement ajouter chacune de la solution de biopolymère à 0,5% en poids (100-300 ul) en utilisant une taille de pores de ~ 1 mm pipettete pointe à chaque cellule à ~ 25 ° C. Éliminer les bulles d'air à partir des cellules en utilisant une aiguille de seringue.
   3. Placer les cellules dans un four avec une circulation d'air à 60 ° C sous pression atmosphérique pour l'évaporation; la direction d'évaporation est opposée à celle de la gravité.
2. Observations sous une lumière à polarisation croisée (figure 1B-1C)
   1. Fournir de la lumière directement visible par l'intermédiaire d'une lampe halogène de 100 W avec une source de lumière de surface plane sur une grande surface (80 mm x 80 mm). Ajuster les polariseurs à 45 ° et 135 ° à l' aide des supports (Figure 1C).
   2. Fixer les positions de la source de lumière, des polariseurs, l' étape d'échantillonnage, et la caméra à l' aide d' un rail supports optiques et de tige (figure 1c). Placez la scène de l'échantillon entre les deux polariseurs (la distance entre les polariseurs doit être ~ 5 cm). Placez l'appareil photo ~ 20 cm de la scène de l'échantillon pour permettre mise au point.
   3. A certains moments, placez les échantillons de l'étape 3.1.3 entre le polarizers sur la scène parallèle au plan XZ et couvrir l'appareil avec un rideau noir; le dispositif proprement dit est représenté sur la figure 1C.
   4. Photographier les échantillons à travers des polariseurs croisés linéaires en utilisant un appareil photo reflex mono-objectif numérique avec un objectif zoom standard (voir Matériaux List). Contrôlez les réglages de l'appareil, comme la distance focale, en utilisant un logiciel informatique (voir la liste des matériaux).
3. Analyse spatio-temporelle de l'intensité lumineuse transmise (Figure 1C)
   1. Pour évaluer le changement du paramètre d'ordre dans le processus orientationnel de séchage, de recueillir des photos toutes les heures pendant 24 h.
   2. Mesurer l'intensité de la lumière transmise le long de la ligne centrale dans la direction Z en tant que valeur de gris en utilisant un programme de traitement d'image (par exemple, ImageJ).
   3. Tracer la courbe de la valeur de gris en fonction de la distance de la face supérieure ouverte.
4. Les observations microscopiques de moins ligh polarisation croiséet (Figure 1D)
   1. Pour vérifier les méthodes, faire des observations microscopiques avec un microscope de polarisation équipé d'une caméra CCD ^9. Maintenir une première plaque de retard ordre dans le trajet lumineux. Contrôler les conditions pour les photos à l'aide d'un logiciel PC.

Résultats

Utilisation du dispositif tel que représenté sur la figure 1, l'auto-intégration de microdomaines à macrodomain sur une interface air-LC séchage a été évaluée (Figure 2A). Comme la première démonstration de l'expérience de séchage, deux types de polysaccharides megamolecular, Sacran (M _w = 1,9 x 10 ⁷ g mol ^-1) et la gomme de xanthane (4,7 x 10 ⁶ g mol ^-1), ont été comparés. La figure...

Discussion

Il était parfois difficile pour la caméra de se concentrer sur l'échantillon en raison de l'intensité lumineuse transmise étant trop faible. Dans de tels cas, en plaçant un film de matière plastique transparente étendue sur la scène a aidé à organiser la mise au point. La limitation de la résolution observable dépendait de l'objectif de la caméra, ~ 10 um dans ce cas. La limite observable de l'épaisseur de l'échantillon, Ay, est fonction de l'intensité lumineuse maximale de la lampe, ~ 10 mm dans...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
sacran	Green Science Materials Inc., Japon		De Aphanothece sacrum. Mw = 1,9 & times ; 107 g mol-1
gum xanthane	Taiyo Kagaku Co., Japon	Neosoft XC	De Xanthomonas campestris. Mw = 4,7 × ; 106 g mol-1
tubuline	Cytoskeleton, Inc., États-Unis	T240	Du cerveau porcin.
GpCpp	Jena Bioscience, Allemagne	NU405L
pipérazine-N,N&prime ; -bis(2-éthanesulfonique)	Sigma-Aldrichi, Co. LLC.	P6757-500G	TUYAUX
éthylène glycol-bis(&beta ;-aminoéthyl éther)-N,N',N'-acide tétraacétique	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	342-01314	EGTA
MgCl2-6H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	135-15055
KOH	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	162-21813	granule
d’ADN	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	D1626	D’après les testicules de saumon. Mw = 1,3 & times ; 106 Da (~2 000 pb)
Solution tampon Tris-EDTA	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	T9285-100ML	10 mM Tris, pH 8,0, avec 1 mM
de verre à lame	Matsunami Glass Ind., Ltd., Japon	S1111
feuille de caoutchouc de silicium	Asone Co.	6-611-32	Epaisseur : centrifugeuse de 1 mm
	Beckman-Coulter, Inc.,	États-Unis Avanti J-25	équipée d’une source lumineuse à rotor JA-20
	Sumita Optical Glass, Inc., Japon	LS-LHA
	Sumita Optical Glass, Inc., Japon	GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)	80 mm & times ; 80 mm
	Ushio Inc., Japon	JCR 15V150WBN
titulaire	Sigmakoki, Co., Ltd.	KMH-80
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Porte-échantillon TARW-25503L
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Tige SHA-25RO
	Sigmakoki, Co., Ltd.	ROU-12-40
porte-tenons	Sigmakoki, Co., Ltd.	Support de poteaux RS-6-40
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Support de poteaux RS-12-60
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Porte-poteaux RS-12-80
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Transporteur RS-12-130
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Support d’appareil photo CAA-25LS
	Sigmakoki, Co.,Ltd.	CMH-2
rail optique moyen	Sigmakoki, Co., Ltd.	OBA-500SH
Lenstube	Tomytech, Tube d’objectif BORG	BK	80&phi ;, L25 mm  ;
tube d’objectif	Tomytech, tube d’objectif BORG	BK	80&phi ;, L50 mm  ;
	multibande Tomytech, BORG		80&phi ;   ;
Plaque en V	Tomytech, BORG	Plaque en V 60S
porte-plaque	Viexen, Co., Ltd.	porte-plaque SX
EOS Kiss X7i  ;	Canon Inc., Japon	8594B001	avec un objectif zoom standard,  ; Logiciel photographique EFP 18-55 mm
	Canon Inc., Japon	EOS Utility
PC	Microsoft	de surface
	Olympus	BX51
Plaque de retard de premier ordre	Olympus	U-TP530	&lambda ; = 530 nm
Appareil photo CCD	Olympus	DP80
Logiciel photographique	Olympus	cellSens Standard
Programme de traitement d’images basé sur Java	des National Institutes of Health	ImageJ