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Article de méthode

Mesure et Altération Mating Drive à Male

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⸱

DOI :

10.3791/55291

⸱

15 février 2017

 ,  ,  , 
1F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, 2Harvard NeuroDiscovery Center, Harvard Medical School, 3Department of Neurobiology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit un test de comportement qui utilise entraînement d'accouplement mâle chez la drosophile melanogaste r pour étudier la motivation. En utilisant cette méthode, les chercheurs peuvent utiliser la mouche des techniques avancées neurogénétiques pour découvrir les mécanismes génétiques, moléculaires et cellulaires qui sous-tendent cette motivation.

Résumé

Malgré des décennies de recherche, les bases neuronales et moléculaires des états de motivation demeurent mystérieuses. Nous avons récemment développé un roman, réductionniste et système évolutif pour une enquête approfondie de la motivation à utiliser le disque d'accouplement du mâle Drosophila melanogaster (drosophile), les méthodes pour lesquelles nous détaillons ici. Le paradigme comportemental centré sur la constatation que le lecteur d'accouplement mâle diminue aux côtés de la fécondité au cours des copulations répétées et récupère plus de ~ 3 d. Dans ce système, les outils neurogénétiques puissants disponibles dans la mouche convergent avec l'accessibilité génétique et putative schéma de câblage disponible pour le comportement sexuel. Cette convergence permet l'isolement rapide et l'interrogation des petites populations neuronales avec des fonctions spécifiques de motivation. Ici, nous en détail la conception et l'exécution de l'essai de satiété qui est utilisé pour mesurer et modifier la cour motivation dans la mouche mâle. En utilisant cettetest, nous démontrons aussi que le faible entraînement d'accouplement mâle peut être surmonté en stimulant les neurones dopaminergiques. Le dosage de la satiété est simple, abordable et robuste aux influences des origines génétiques. Nous prévoyons que le test de satiété pour générer beaucoup de nouvelles connaissances sur la neurobiologie des états de motivation.

Introduction

Work in Drosophila a donné un aperçu profond et pionnier dans de nombreux phénomènes biologiques, y compris la nature du gène 1, les principes du développement embryonnaire 2, les rythmes circadiens 3, ainsi que le développement et le câblage du système nerveux 4, 5, 6. La motivation reste beaucoup moins bien compris que ces phénomènes, peut-être à cause des limitations sur les systèmes qui ont été étudiés jusqu'à présent. Motivation à la volée est principalement étudiée dans le contexte de la faim, ce qui présente de nombreux défis en raison de leur consommation par bout d'alimentation et exosquelette qui exclut des signes manifestes de dépôt de graisse infinitésimale alimentaire. Par conséquent, il est nécessaire d'élargir les systèmes utilisés pour étudier la motivation dans la mouche.

Nous décrivons un cadre comportemental pour l'étude de l'entraînement d'accouplement dansDrosophile. Ce système tire parti des outils neurogénétiques à la volée, ainsi que l'accessibilité 7, 8, 9, 10, 11, 12 et connectome putatif de son circuit dimorphisme sexuel 8, 13. En outre, une grande partie de l'inné 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 et appris 22, 23, 24 circuits sensori-moteur parade contrôle a été élaboré en détail, offrant une occasion rarepour localiser le noeud de circuit exact sur lequel la motivation frappe. Nous avons récemment rapporté que, dans la volée, comme chez les humains, les niveaux de dopamine sont au cœur de l' accouplement d' entraînement 25, 26, 27. Nous avons obtenu l' accès génétique au niveau circuit molecular- et pertinent dopamine produisant et recevant des neurones dans la mouche, ce qui facilite l' analyse détaillée de ce phénomène conservé en utilisant les essais que nous décrivons ici 25.

Nous ajoutons aux tests comportementaux dans Zhang et al. 25 une nouvelle arène de comportement plat qui permet à la vidéo notation, que nous appelons 2 dimensions (2-D) Essai de satiété, une amélioration importante par rapport aux méthodes précédentes. Par conséquent, le nouveau test est plus évolutive et quantifiable, et donc plus approprié pour les écrans génétiques des gènes et des neurones impliqués dans la motivation. Nous utilisons ce nouveau test, ainsi que des essais de séduction et neurogemanipulations nétiques, pour démontrer comment mesurer et modifier l'accouplement d'entraînement à la volée.

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Protocole

NOTE: Ce protocole décrit la préparation (Sections 1 - 3), l'exécution (article 4), et l'analyse (section 4) de 2-D des essais de satiété. Ensuite, en utilisant une stimulation dopaminergique, par exemple, l'article 5 montre comment combiner la stimulation avec thermogénétique 2-D des essais pour induire la satiété hypersexuality. Section 6 décrit 3 façons de vérifier les résultats de 2-D des essais de satiété. Enfin, la section 7 montre comment mesurer la reprise de l'accouplement d'entraînement dans les mouches mâles.

1. Fabricating 8- et 32-chambre Arenas Behavioral

NOTE: Chaque arène comportementale se compose de plusieurs couches de feuilles de plastique découpées au laser maintenus ensemble par des vis à tête hexagonale et les écrous de pouce à chacun des quatre coins (figure 1A).

  1. Fabriquez les couches de l'arène. Fabriquez chaque couche en utilisant un cutter laser pour découper des feuilles de plastique acrylique à la forme appropriée (voir Figure 1B, 1C pour les produits).
    NOTE: Beaucoup institutio de recherchens ont découpe au laser dans leurs ateliers d'usinage ou des espaces de fabricant. Si l'institution a accès à une coupe au laser, continuez avec les étapes suivantes. Sinon, suivez les instructions à l'étape 1.2 à la place.
    1. Pour chaque couche, ouvrez le modèle de conception dans le logiciel de la découpe au laser.
      REMARQUE: Les dessins peuvent être trouvés dans les fichiers PDF nommés de manière appropriée (par exemple, 8 Chambre Arena - Couche 2 - Doors.pdf) en matériel supplémentaire 1. Ce fichier contient également des annotations pour le type de plastique utilisé (par exemple, 1 / 8 pouces (soit 3,175 mm) acrylique clair). L'épaisseur exacte de chaque couche ne soit pas critique. La principale exigence est de permettre 0,12 pouces (3 mm) ou plus d'espace vertical libre dans les chambres.
    2. Réglez les paramètres du laser (puissance, mise au point, etc.) pour le type et l' épaisseur de plastique à utiliser. Placez en plastique dans le lit de coupe laser et exécuter la découpe au laser.
      REMARQUE: ces paramètres varie largement en fonction de la cutte lasermodèle de r et la force de son laser. Trouver les paramètres appropriés en fonction de l'expérience passée ou en faisant des coupes d'essai sur les débris de plastique. Les gravures hexagonales profondes sont inclus dans la conception de suspendre les têtes de vis à tête hexagonale. Cette fonctionnalité permet de serrage d'une seule main les écrous de pouce et permet aux arènes de se reposer à plat sur le banc (sans dépasser les têtes de vis). Néanmoins, ce qui rend les gravures profondes est souvent difficile à réaliser, et de temps, en utilisant un cutter laser. Cette étape est facultative et peut être ignoré sans affecter les résultats comportementaux.
    3. Lors de la coupe du cadre de porte (couche 2, la figure 1A), utiliser également des paramètres laser appropriés pour graver les numéros de chambre inclus dans la conception (comme dans la figure 1B, 1C).
  2. Placer une commande avec un fabricant de découpe au laser en ligne. Télécharger tous les fichiers de conception PDF pour l'arène 8 et / ou 32-chambre et préciser le type de matériau (par exemple, 1/8 de pouce (soit 3,175 mm) clear acrylique) sur la base des annotations dans les fichiers. Les résultats apparaîtront comme sur les figures 1B (arène 8 chambre) et 1C (ARENA 32-chambre).
  3. Assembler les arènes en utilisant quatre vis à tête hexagonale et quatre écrous de pouce pour aligner et maintenir ensemble les couches de matière plastique (Figure 1A). Les arènes apparaîtront comme dans la figure 1D, 1E (8 chambre) et la figure 1F, 1G (32-chambre).
    REMARQUE: La paroi des aliments (couche 4 sur la figure 1A) est utilisé pour des essais de satiété 2-D uniquement et est omise dans les arènes 32 à chambres, qui sont utilisés dans des essais de cour.

2. Préparation des aliments pour le 2-D Satiety Assay

NOTE: En raison d'un test de satiété 2-D couvre 4,5 h, voler la nourriture est utilisée dans l'arène pour fournir la nutrition et de l'eau. Ce protocole utilise, mais ne se limite pas à la semoule de maïs-agar classique voler la nourriture.

  1. assembler partiellement la satiété arena 2-D (8-chambre) avec des couches 3-6(voir la figure 1A pour des affectations de couche) et le serrer avec les écrous de pouce et vis à tête hexagonale.
  2. Placez les aliments à la mouche fraîche dans une bouteille propre, micro-ondes. Ajouter juste assez d' eau pour couvrir la surface inférieure de la bouteille (figure 2A).
  3. Micro-ondes aliments à haute température pendant 30 - 45 s. Contrôler la progression et remuer toutes les 15 s jusqu'à ce que fondu (figure 2B). MISE EN GARDE! Fly alimentaire se résume facilement sur.
  4. Utilisez un 1000 pi pointe de la pipette émoussée (figure 2C) pour transférer lentement ~ 1 mL fondre la nourriture dans chaque chambre (figure 2D).
  5. Laissez les aliments resolidifier à 4 ° C pendant environ 10 min (Figure 2F) avant d' assembler complètement l'arène (figure 2F).
  6. Utilisez l'arène remplie pour les expériences (voir la section 4) ou conserver à 4 ° C.
  7. Conservez les restes de nourriture à 4 ° C et la réutilisation.

3. Préparer Vierges femelles pour comportement Assays

NOTE: 2-D des essais de satiété utilisent un grand nombre de mouches femelles vierges (~ 120 - 160 pour une arène comportementale complète) qui sont difficiles à recueillir en utilisant des méthodes standard. Cette section décrit une approche alternative en utilisant le transgène hs-hid sur le chromosome Y 28, qui a été utilisé avec succès dans des essais de séduction 25, 29. Le stock utilisé pour générer des femelles vierges aux yeux blancs a le w1118 génotype (X) / hs-hid (Y); + / +; + / + (Bloomington stock number 24638).

  1. Flip vole dans une nouvelle bouteille une fois 20-50% des pupes ont éclos (voir la figure 3A par exemple) et il y a suffisamment de mâles (5 - 10) pour propager le stock.
  2. Choc thermique la bouteille d' origine dans un bain d'eau chaude à 37 ° C pendant 1 h pour activer suffisamment hs-hid pour tuer les hommes (figure 3B). Après le choc thermique, que les femelles Eclose de ces bouteilles et ainsi resteront vierge jusqu'à ce que ledosages.
    REMARQUE: Assurez - vous que tous les côtés de la bouteille sont uniformément chauffés (voir la figure 3A pour la ligne d'eau). Etendre cette fois pour un maximum de 2 h si 1 h ne suffit pas à euthanasier tous les hommes.
  3. Isoler les femelles recueillies pendant au moins 3 j avant des expériences pour veiller à ce qu'ils soient assez vieux pour être sexuellement réceptive 25, 29.
    NOTE: Y chromosome moins hommes surgissent de temps à partir de ce stock. Ces hommes ont des yeux blancs et ne sont pas affectés par le choc thermique, car ils ne contiennent pas le transgène hs-hid. Ils ne peuvent pas produire du sperme et donc ne peut pas diminuer la réceptivité chez les femelles 30, 31.

4. Performing et notation de 2-D Satiété Assays

NOTE: Il est important de contrôler l'âge du mâle vole comme entraînement d'accouplement change avec l'âge. Ce protocole utilise les mâles qui sont 3 - 4 d , âgé de 25 .

  1. Régler l'incubateur à la température souhaitée (par exemple 23 ° C pour la norme, les expériences RT) et d' humidité (> 30%). Pour les incubateurs sans contrôle de l'humidité, laissant une tasse d'eau dans l'incubateur est suffisante.
  2. Placer un essai satiétogène arène 2-D dans l'incubateur pendant environ 30 minutes pour équilibrer la température et pour empêcher la condensation dans les chambres au cours de l'expérience. Les portes tournantes doivent être en position ouverte.
  3. Utilisez un aspirateur de mouche 32 pour aspirer 15 - 20 femelles vierges dans chaque chambre de l'arène (Figure 4).
    Remarque: il est important que les femelles et les mâles anesthésiés ne sont pas sur le même jour que le dosage. Dans notre expérience, cela peut avoir un impact réceptivité féminine et comportement d'accouplement mâle.
  4. Aspirer 1 mâle dans chaque chambre.
  5. Placez l'arène chargée dans l'incubateur sous un caméscope grand public standard (Figure 5) et le film pendant 4,5 h.
  6. Note des vidéos en notant quand chaque mâle mouche commence et se termine chaque accouplement (c. -à- copulation). Cette étape peut prendre du temps au début. Avec la pratique, on peut marquer les vidéos à vitesse 5x ou plus.
    NOTE: Puisque les mouches accouplent pour ~ 20 min à ~ 23 ° C (durée plus courte à des températures plus élevées) 29, on peut parcourir les 15 premières minutes de chaque accouplement.
  7. Une fois connecté tous les temps d'accouplement, additionner le nombre d'accouplements pour chaque mouche (voir les résultats représentatifs).
  8. Utilisez le code fourni pour générer un éthogramme. Voir Matériel supplémentaire 2 pour le code, les instructions et données d'exemple.
  9. Utilisez CO 2 ou de la température froide pour anesthésier les mouches avant de les retirer.

5. Utilisation Manipulation thermogénique pour inverser Satiety en 2-D Satiété Assays

NOTE: Ce protocole teste si la stimulation thermogénétique d'une population neuronale définie peut surmonter la satiété. La fli expérimentalees exprimer le cation canal sensible à la chaleur TRPA1 dans des populations définies de neurones (UAS-TRPA1). Les étapes suivantes sont valables pour la stimulation des neurones dopaminergiques (TH-Gal4), qui ont été montrés pour favoriser l' accouplement d' entraînement 25. Ces étapes peuvent être utilisées en conjonction avec d'autres pilotes neuronales pour découvrir d'autres populations qui favorisent la route de l'accouplement.

  1. Pour induire thermogenetically comportements d'accouplement chez les mouches repus, augmenter la température dans l'incubateur (par exemple, de 23 ° C à 28,5 ° C) après avoir terminé un 4,5 h 2-D expérience de la satiété complète.
  2. Après l'incubateur atteint la température désirée, continuer la stimulation de la chaleur et de marquer les conjugaisons (ie. Copulations) des mâles pendant 1 h (voir résultats représentatifs).
    NOTE: La température et la durée de la stimulation peuvent varier selon le génotype de sorte qu'il est nécessaire de résoudre les conditions optimales qui empêchent hyperstimulation des neurones tout en produisant un robust phénotype.

6. Utilisation Courtship et Locomotion pour vérifier Satiety

NOTE: Cette section décrit 3 méthodes optionnelles qui peuvent être utilisées pour vérifier les résultats de 2-D des essais de satiété. Ils ne sont pas nécessaires pour chaque essai.

  1. Utiliser des tests de cour pour vérifier la satiété.
    1. Aspirer un mâle et une femelle vierge dans chacune des 32 chambres dans une arène de cour.
    2. Film vol pour ~ 20 min à l'aide d'un caméscope grand public standard.
    3. Score de l'indice de cour (CI) pour quantifier la cour 25; c'est la fraction du temps passé effectuant le comportement de cour (chant, suivant, etc.) et l' accouplement (c. -à- copulation) sur une fenêtre de 5 min. Cette fenêtre commence à partir de la première instance de comportement de cour. Si une mouche mâle ne démarre pas la cour dans les 15 premières minutes, la CI est 0. Naïf WT mouches devraient montrer un CI supérieur à 0,9, alors qu'une mouche entièrement assouvi devrait avoir un CI bElow 0,2. D' autres mesures de séduction peuvent également être considérés comme 23, 33.
  2. Marquer la cour en 2-D des essais de satiété
    1. Marquer la quantité de temps qu'une mouche mâle passe poursuite, au cours d' une période de temps d'un essai de satiété 2-D (par exemple la première heure). Courtship est défini comme étant le mâle d' effectuer toute étape du rituel (chant, à la suite, etc.). Contrairement à la section 6.1.3, cette étape ne comprend pas le mâle passe l'accouplement.
    2. Divisez le temps de la cour ci - dessus par le temps total le mâle n'a pas été l' accouplement (ie pas copuler) dans la même période. Par exemple, si un homme mouche courts pendant 15 min et accouple pendant 20 minutes au cours de la première heure, le rapport est de 15 min / (60 min - 20 mn) = 0,375. Le rapport est présenté comme «Fraction du temps dans la cour nonmating" en résultats représentatifs.
  3. Utilisation de test de locomotion pour évaluer l'épuisement
    1. Partiellement assembler le 32-arène de chambre avec toutes les parties, mais la feuille de contraste.
    2. Aspirer une mouche mâle (pas de mouches femelles) dans chacune des 32 chambres dans une arène de cour.
    3. Film vol pour ~ 10 min à l'aide d'un caméscope grand public standard.
    4. Suivre les mouches avec le plugin MTrack2 dans ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).

7. Récupération Mating entraînement après 2-D Satiety Assay

  1. Effectuer un test de satiété 2-D comme décrit dans la section 4, mais aspirer le mâle vole à la fin de l'essai.
  2. Isoler les mouches mâles à 23 ° C pour le nombre de jours souhaité.
  3. Effectuer un test de satiété 2-D avec les mâles récupérés et marquer leurs conjugaisons (ie copulations) pour seulement 1 h (voir résultats représentatifs).

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Résultats

Pour caractériser la drosophile accouplement d' entraînement, 3-day-old, WT Canton-S mâles ont été testés dans un essai de satiété 2-D. Au cours de l'essai (4,5 h), les mâles s'accouplent une moyenne de 4,8 ± 0,3 (moyenne ± écart-type de la moyenne, SEM) fois. Accouplements initient la plupart du temps dans les 2 premières h (78%) (figure 6A, 6B) et deviennent moins fréquentes que le test progresse (figure 6A, 6B). Cette diminution e...

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Discussion

États de motivation peuvent être rassasiées, maintenus et récupérés 34. Nous présentons une analyse 2-satiété D qui mesure rapidement et vigoureusement tous ces aspects de l'accouplement d'entraînement à la volée. Cet essai donne la possibilité d'utiliser braguette avancé manipulations génétiques pour étudier les composants moléculaires et de circuit d'un comportement motivé.

Le dosage de la satiété repose sur la capacité du mâle avec succès devant les...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Mike Crickmore, Dragana Rogulja et Michelle Frank pour leurs commentaires sur le manuscrit. Pavel Gorelik a fourni un soutien technique pour la fabrication des arènes comportementales. Ce travail a été mené dans le laboratoire de Mike Crickmore et est également soutenu par la Fondation Whitehall (chercheuse principale : Dragana Rogulja). S.X.Z. est titulaire d’une bourse Stuart H.Q. et Victoria Quan à la Harvard Medical School.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acrylique transparent de 1/16 de pouceMcMaster-Carr8589K12Utilisé pour fabriquer des arénas ; voir le matériel supplémentaire 1 pour les motifs.
Acrylique transparent de 1/8 de pouceMcMaster-Carr8589K42Utilisé pour fabriquer des arénas ; voir le matériel supplémentaire 1 pour les motifs.
Acrylique transparent 3/16 pouceMcMaster-Carr8560K219Utilisé pour fabriquer des arénas ; voir le matériel supplémentaire 1 pour les conceptions.
1/32 pouce delrin noirMcMaster-Carr8575K132Utilisé pour fabriquer des arénas ; voir le matériel supplémentaire 1 pour les conceptions.
Vis hexagonales, 1 pouce de long (50x)McMaster-Carr92314A115  ;Utilisé pour faire des arènes. Peut être remplacé par des vis de 3/4 de pouce (92314A113, McMaster-Carr) pour les arénas de 32 chambres.
Écrous à oreilles (25x)McMaster-Carr92741A100Utilisé pour fabriquer des arénas. Peut être remplacé par des écrous hexagonaux ordinaires (90480A005, McMaster-Carr).
CaméscopeCanonVixia HF R700Peut être remplacé par n’importe quel comméscope grand public.

Références

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