Article de méthode

Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

6.5K vues

⸱

DOI :

10.3791/55297

⸱

26 juin 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Università degli Studi di Milano, 2Department of Neuroscience; Department of Cell Biology, Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, 3Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair, Yale University School of Medicine, 4Department of BioSciences, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les protocoles décrits ici permettent d’étudier les propriétés électriques des cellules excitables dans les conditions physiologiques les moins invasives en utilisant des embryons de poisson-zèbre dans un système in vivo associés à un indicateur de tension génétiquement codé (GEVI) basé sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) exprimé sélectivement dans le type de cellule d’intérêt.

Résumé

Les protocoles décrits ici sont conçus pour permettre aux chercheurs d’étudier la communication cellulaire sans altérer l’intégrité de l’environnement dans lequel les cellules se trouvent. Plus précisément, ils ont été développés pour analyser l’activité électrique des cellules excitables, telles que les neurones spinaux. Dans un tel scénario, il est crucial de préserver l’intégrité de la cellule vertébrale, mais il est également important de préserver l’anatomie et la forme physiologique des systèmes impliqués. En effet, la compréhension de la manière dont le système nerveux - et d’autres systèmes complexes - fonctionne doit être basée sur une approche systémique. Pour cette raison, l’embryon vivant de poisson-zèbre a été choisi comme système modèle, et les changements de tension de la membrane des neurones spinaux ont été évalués sans interférer avec les conditions physiologiques des embryons.

Ici, une approche combinant l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre avec un biocapteur basé sur FRET est décrite. Les embryons de poisson-zèbre sont caractérisés par un système nerveux très simplifié et sont particulièrement adaptés aux applications d’imagerie grâce à leur transparence, permettant l’utilisation d’indicateurs de tension basés sur la fluorescence au niveau de la membrane plasmique pendant le développement du poisson-zèbre. La synergie entre ces deux composants permet d’analyser l’activité électrique des cellules dans des organismes vivants intacts, sans perturber l’état physiologique. Enfin, cette approche non invasive peut coexister avec d’autres analyses (par exemple, les enregistrements de mouvements spontanés, comme le montre ici).

Introduction

L'analyse in vivo des composants systémiques permet aux scientifiques d'étudier le comportement cellulaire de la manière la plus fiable. Cela est particulièrement vrai lorsque l'activité sous contrôle est fortement influencée par les interactions cellule-cellule (dépendantes en contact et sans contact), comme dans le système nerveux, où les changements de tension membranaire entraînent la communication entre les cellules excitables. La compréhension de l'information codée par ces signaux électriques est la clé pour comprendre comment fonctionne le système nerveux dans les états physiologiques et pathologiques.

Afin d'étudier les propriétés électriques cellulaires dans les conditions physiologiques les plus non invasives, plusieurs indicateurs de tension génétiquement codés ont récemment été développés 1 . Par opposition aux générations précédentes de capteurs de tension optique (principalement des colorants sensibles à la tension) 2 , les GEVI permettent des analyses in vivo du système nerveux intact, etLeur expression peut être limitée à des types ou populations de cellules spécifiques.

L'embryon de poisson zèbre est le «substrat» in vivo de choix pour tirer parti du grand potentiel attribué aux GEVI. En fait, grâce à sa clarté optique et à son système nerveux simplifié mais progressivement conservé, le modèle du poisson zèbre permet une identification et une manipulation simples de chaque composant cellulaire dans un réseau. En effet, l'emploi du GEVI Mermaid 3 à base de FRET a permis d'identifier des altérations pré-symptomatiques du comportement des neurones moteurs de la moelle épinière dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique (ALS) 4 .

Le protocole in vivo suivant décrit comment surveiller les propriétés électriques des neurones moteurs vertébraux dans des embryons de poissons zèbres intacts exprimant la sirène d'une manière spécifique aux neurones. En outre, il démontre comment Chan pharmacologiquement induitCes propriétés électriques peuvent être associées à des altérations de la fréquence des bobines spontanées embryonnaires, l'activité motrice stéréotypée qui caractérise le comportement de mouvement du poisson zèbre à des stades de développement très précoces.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. pHuC_Mermaid Plasmid Generation

NOTE: Mermaid est un biocapteur développé en associant le domaine de détection de tension (VSD) de Ciona intestinalis (maintenant Ciona robusta ) 5 capteur de tension contenant de la phosphatase (Ci-VSP) avec les fluorophores partenaires de FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: donneur) et une version monomère de la protéine fluorescente émettrice d'orange Kusabira Orange (mKOk: accepteur). Pour ce biocapteur, les changements conformationnels du domaine VSD, induits par la dépolarisation de la membrane, augmentent la proximité des protéines fluorescentes donneuses et acceptrices, ce qui augmente le transfert d'énergie entre elles (en augmentant le rapport FRET) 3 . La VSD assure la localisation efficace du biocapteur à la membrane plasmique. L'expression neuronale du biocapteur (dans la moelle épinière, le signal est détectable chez les interneurones et les neurones moteurs) est obtenue par clonage de l'opérateur MermaidEn cadre de lecture (ORF) sous le promoteur pan-neural Zebrafish HuC 6 .

  1. Amplifier par PCR (polymerase chain reaction) la Mermaid ORF à partir du pCS4 + Mermaid plasmid 3 avec Pfu (proofreading) DNA polymerase en utilisant l'amorce T3 Universal et l'amorce Mermaid Sma I (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) afin d'insérer un site de restriction Sma I en amont De l'ORF Mermaid.
    1. Utiliser le mélange de PCR suivant: 0,5 μl d'ADN polymérase de Pfu, 7,5 μL du tampon 10x spécifique, 1 μL de dNTP 10 mM, 2,5 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO), 0,5 μL (50 ng) de la préparation de plasmide et 1 ΜL de solutions stock de 20 μM de chaque amorce dans un volume total de 50 μL.
    2. Chauffer le mélange de PCR pendant 15 s à 95 ° C, l'amorcer pendant 15 s à 50 ° C et l'allonger pendant 4 min à 72 ° C pour un total de 35 cycles.
  2. Gel-purifie le brouilleur spécifiqueProduit de PCR utilisant un kit de purification de gel commercial, suivant le protocole du fabricant.
  3. Cloner le fragment d'ADN dans le vecteur flasque pCMV-SC suivant le protocole du fabricant.
  4. Linéariser le plasmide positif Mermaid (appelé pCMV-SC_Mermaid) avec l'enzyme de restriction Sma I pour l'insertion suivante du promoteur HuC.
    1. Configurez la réaction de restriction comme suit: 0,5 μL (10 U) d'enzyme de restriction Sma I, 2 μL du tampon kit 10x et 5 μg d'ADN plasmidique dans un volume total de 20 μL. Incuber la réaction à 25 ° C pendant 1 h.
  5. Gel-purifier le plasmide digéré en utilisant un kit de purification de gel commercial suivant le protocole du fabricant.
  6. PCR-amplifier le promoteur HuC (pHuC), avec l'ADN polymerase de Pfu et l'ADN génomique du poisson zèbre en tant que modèle, en utilisant une paire d'amorces spécifiques HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA et HuCproM-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) et couvrant une région de 3,150 pb en amont de l'ATG.
    1. Mettre en place le mélange de PCR en utilisant le schéma suivant: 0,5 μL d'ADN polymerase de Pfu, 7,5 μL du tampon 10x spécifique, 1 μL de dNTP 10 mM, 2,5 μL de DMSO, 200 ng d'ADN génomique et 1 μL de 20 μ M Stock de solutions de chaque amorce dans un volume total de 50 μL.
    2. Après une étape initiale de 2 min à 95 ° C, chauffer le mélange PCR pendant 15 s à 95 ° C, l'amorcer pendant 15 s à 50 ° C et l'allonger pendant 4 min à 72 ° C pour un total de 35 cycles .
  7. Gel-purifiez le produit de PCR brut spécifique en utilisant un kit de purification de gel commercial suivant le protocole du fabricant.
  8. Liaiser une quantité équimolaire du pCMV-SC_Mermaid purifié (étape 1.5) et de l'ADN de pHuC (étape 1.7) en utilisant 1 μL d'ADN ligase T4 et 1 μL du tampon spécifique 10X dans un volume total de 10 μL. Incuber la réaction pendant 16 h à4 ° C.
  9. Transformer une aliquote de cellules compétentes avec 5 μL de la réaction de ligature (étape 1.8) en suivant les instructions du fabricant.
  10. Sélectionnez les clones pHuC-positive (pHuC_Mermaid) avec le promoteur inséré dans l'orientation appropriée par une double digestion Sal I- Eco RV (le site de restriction Sal I a été inséré en amont du fragment promoteur à l'étape 1.6, tandis que le site de restriction Eco RV Est positionné en aval de la région de polyadénylation, PolyA, du plasmide pCMV-SC).
    1. Réglez la réaction de restriction comme suit: 0,5 μL (10 U) des enzymes de restriction Sal I et Eco RV, 2 μL du tampon kit10X et 1 μg d'ADN de pHuC_Mermaid dans un volume total de 20 μL. Incuber la réaction à 37 ° C pendant 1 h. Exécutez les réactions sur un gel d'agarose.

2. Micro-injection d'embryons

  1. Transférer les engrais par exempleGs obtenus à partir d'une espèce de type sauvage (souche AB) ou Sod1-G93R poisson zèbre adultes 4 à une boîte de Pétri 10 mm à l'aide d'une pipette en plastique.
  2. Rincer les embryons dans de l'eau de poisson froide (4 ° C) et les microinjecter immédiatement dans le jaune d'oeuf avec 200 pg de plasmide pHuC_Mermaid à l'aide d'un micro-injecteur (pour une description globale et détaillée de la procédure de microinjection, voir les références 7 et 8).
  3. À l'aide d'une pipette en plastique, transférer les embryons dans une boîte de Petri et les incuber dans de l'eau de poisson à 28 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade de développement souhaité (20-24 h après la fertilisation, hpf) pour les analyses suivantes.

3. Analyse spontanée de la queue d'enroulement

NOTE: Évaluez le comportement spontané de l'enroulement de la queue dans des embryons de 20 à 24 hpf avec ou sans le médicament riluzole.

  1. Transférer un embryon dans une boîte de Petri ronde de 90 mm remplie d'eau de poisson contenant 0,2% de DMSO (véhicule riluzole) et le déchifférer manuellement en utilisant deuxPince à bijoux avec pointes pointues. Incuber l'embryon pendant 5 min.
  2. Détectez l'enroulement de la queue à la RT pendant un enregistrement vidéo de 1 min à l'aide d'un appareil photo numérique monté sur un stéréomicroscope. Acquérir des séries chronologiques à une résolution de temps de 30 images / s.
  3. Calculez la fréquence des bobines spontanées de la queue en comptant le nombre de virages (à la fois contralatéral et ipsilatéral) par unité de temps.
  4. Pour évaluer l'effet du médicament riluzole, utilisez doucement une pipette Pasteur en plastique pour transférer l'embryon dans une nouvelle boîte de Petri de 90 mm remplie d'eau de poisson contenant 5 μM de riluzole.
    1. Incuber l'embryon pendant 5 min avant d'enregistrer une vidéo de 1 min et d'effectuer l'analyse comportementale comme ci-dessus.

4. Configuration de l'imagerie pour la visualisation du biocapteur de la sirène dans les embryons vivants: détection simultanée des signaux du donneur et de l'accepteur

  1. Monter les embryons de 20 à 24 hpf dans 1% d'agarose à faible point de fusion dans de l'eau de poisson à37 ° C dans un plat d'imagerie à fond de verre de 35 mm. Orientez les embryons sur leurs côtés. Attendre que l'agarose se solidifie à température ambiante.
  2. Transférer le plat d'imagerie au stade d'un confocal inversé monté sur un microscope inversé. Identifiez les neurones moteurs exprimant le biocapteur avec un objectif 20X (0,7 ouverture numérique, NA) en excitant le mUKG avec la ligne laser argon 488 nm et en enregistrant son émission entre 495 et 525 nm.
  3. Pour une mesure FRET, exciter mUKG, le donneur de la paire FRET, avec la ligne laser 488 nm. Détecte simultanément, avec un scanner résonnant fonctionnant à 8 000 Hz en mode bidirectionnel, la fluorescence émise par le donneur (entre 495 et 525 nm) et la fluorescence émise par l'accepteur mKOk (entre 550 et 650 nm, canal FRET). Si disponible, utilisez le laser 473 nm.
    NOTE: L'efficacité d'excitation du donneur sera légèrement réduite (85% au lieu de 93% avec 488 nm), mais l'excitation croisée de l'accepteur seraÊtre réduit aussi (de 17% avec 488 nm à 9% avec une ligne laser 473 nm).
  4. Pour réduire la phototoxicité et le blanchiment des fluorophores, minimisez l'illumination de l'échantillon en réduisant la puissance de la ligne laser (sur la fenêtre du chemin de faisceau du logiciel d'acquisition).
  5. Optimisez l'excitation pour faire correspondre les paramètres de gain et de décalage qui sont définis au début de l'expérience et maintenus constants tout au long de la session. Pour définir le décalage, modifiez la couleur des valeurs de l'image en intensité (en utilisant la table de recherche Q) et, lors de la numérisation avec le laser éteint, tournez le bouton de décalage (décalage intelligent) afin que les pixels de fond aient légèrement une intensité Supérieur à zéro. Avec la même table de consultation, en allumant le laser pendant la numérisation, tournez le bouton de gain (gain intelligent) pour maximiser le rapport signal sur bruit, en prenant soin d'éviter les pixels saturés.
  6. À l'aide d'un trou d'œil ouvert (2 unités aériennes), acquérir des images 16 bits pour fournir une gamme dynamique suffisante pour quantitatifE analyse. Évitez la moyenne pour augmenter la vitesse d'acquisition et pour minimiser le photoblanchage.
  7. Dans la fenêtre d'acquisition du logiciel, sélectionnez une taille de champ d'image de 512 x 64 pixels (taille de pixel: 605 nm) dans le menu déroulant.
  8. Dans la fenêtre du mode d'acquisition, sélectionnez xyt (time lapse sur un seul plan xy) dans le menu déroulant et enregistrez les changements dans la tension des neurones de la colonne vertébrale embryonnaire en acquérant un seul plan xy, en définissant les paramètres d'acquisition pour enregistrer une image tous les 30 Ms pendant 1 min.
  9. Pour évaluer l'effet de l'administration du riluzole sur la dépolarisation de la membrane dans le même neurone, acquérir un nouveau jeu de données 5 min après l'addition d'eau de poisson contenant 5 μM de riluzole.
  10. Pour les analyses FRET, utilisez la macro macro ImageJ BIS (ce qui implique les biosensors FRET à une seule chaîne).
  11. Évaluer le rapport FRET de la membrane basale de chaque neurone à t 1 comme ((moyen FRET - fond FRET) / (Donor mean - Donor background)), où FRET et DonOu l'intensité moyenne est l'intensité de fluorescence moyenne calculée dans la même région d'intérêt (ROI) dessinée autour de la cellule pour chaque canal acquis et le fond de FRET et Donor est l'intensité de fluorescence moyenne calculée dans un ROI du champ de vision sans l'échantillon fluorescent.
    REMARQUE: une description détaillée étape par étape de l'utilisation du plugin se trouve sur le site www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret .
  12. Utilisez un logiciel graphique pour comparer la fréquence, l'amplitude et la durée de la dépolarisation entre différents paradigmes expérimentaux. Comparez deux groupes en utilisant un t- test Student non accompagné et considérez les valeurs moyennes comme étant statistiquement différentes lorsque P <0,05.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Un vecteur d'expression portant la séquence de codage du biocapteur Mermaid à base de FRET sous le contrôle du promoteur pan-neuronal pHuC, qui conduit la synthèse de la protéine exclusivement dans le système nerveux, a été administré dans des oeufs fertilisés à une seule cellule au moyen d'une micro-injection dans Afin d'obtenir des embryons transgéniques transitoires ( figure 1 , Panneau de gauche). Après avoir maîtrisé la technique de mi...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Le protocole présenté ici nous a permis d'explorer l'association entre les propriétés électriques des neurones moteurs de la colonne vertébrale du embryon de poisson zèbre et le comportement d'enroulement spontané, l'activité motrice stéréotypée la plus ancienne, qui apparaît autour de 17 hpf de développement embryonnaire et dure jusqu'à 24 hpf 10 .

Notre approche fournit aux chercheurs un outil pour étudier le système nerveux des embryons intacts,...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Simona Rodighiero pour son soutien inestimable dans l’analyse d’imagerie FRET.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Agarose à bas point de fusion  ;Sigma-AldrichA9414
DMSO  ;Sigma-AldrichW387520
RiluzoleSigma-AldrichR116
Pfu Ultra HQ ADN polymérase  ;Agilent Technologies - Division des produits Stratagene600389
T3 Universal primer  ;Sigma-Aldrich
Wizard SV Système de nettoyage en gel et PCRPromegaA9280
Universal SmaI.mammifères Eurofins
StrataClone / vecteur contondant pCMV-SC  ;Agilent Technologies - Division des Produits Stratagene
SmaI  ;New England BiolabsR0141S
T4 ADN ligasePromegaM1801
SalINew England BiolabsR0138S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
35 mm, antenne parabolique d’imagerie à fond de verre  ;Ibidi81151
pinceSigma-AldrichF6521
StéréomicroscopeLeica MicrosystemsM10 F
Appareil photo numériqueLeica MicrosystemsDFC 310 FX
Leica Application Suite 4.7.1 logiciel  ;Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4Apple
Microscope confocal (inversé)Micro-injecteur Leica MicrosystemsTCS SP5
  ;Eppendorf  ;Femtojet
ImageJ macro Biosensor_FRET
GraphPad Prism 6.0c  ;GraphPad Software, Inc
Système de vecteurs d’expression de 240228

Références

  1. Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
  2. Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
  4. Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515(2016).
  5. Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).
  6. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
  7. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
  8. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  9. Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
  10. Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
  11. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
  12. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).
  13. Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566(2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Biosenseur FRETneurones spinauxmicroscopie confocaleimagerie de fluorescencecodage g n tiqueindicateurs de tensiontraitement au riluzoleanalyse de l enroulement de la queue

Articles connexes