Identification de séquences de localisation Plasmodesmal en protéines In Planta

Summary

Usine de connexions intercellulaires, les plasmodesmes (DP), jouent un rôle central dans l’usine des interactions plante-virus et physiologie. Critique de transport Pd sont tri signaux qui dirigent les protéines à Pd. Cependant, nos connaissances sur ces séquences est encore à ses balbutiements. Nous décrivons une stratégie visant à identifier les signaux de localisation de Pd dans les protéines ciblées Pd.

Abstract

Plasmodesmes (DP) sont des connexions de cellule-cellule qui fonctionnent comme des passerelles à travers lequel les petites et grosses molécules sont transportées entre les cellules végétales. Considérant que le transport de Pd de petites molécules, telles que des ions et l’eau, est censé se produire passivement, cellule-cellule transport des macromolécules biologiques, ces protéines, se produit probablement via un mécanisme actif qui implique des signaux spécifiques de ciblage sur les molécule transportée. La rareté des signaux de localisation des plasmodesmes identifiés (DP) (PLSs) a sévèrement restreint la compréhension du tri des protéines impliquées dans les voies des plantes transport macromoléculaire de cellule-cellule et de la communication. D’une multitude de plantes protéines endogènes et virales connues pour le trafic par le biais de Pd, PLSs seulement trois ont été signalés à ce jour, tous de protéines végétales endogènes. Ainsi, il est important d’élaborer une stratégie expérimentale fiable et systématique afin d’identifier une séquence PLS fonctionnelle, c'est-à-dire à la fois nécessaire et suffisante pour cibler les Pd, directement dans la vie cellules végétales. Nous décrivons ici une telle stratégie en utilisant comme un paradigme de la protéine de la cellule-cellule mouvement (MP) du virus de la mosaïque du tabac (TMV). Ces expériences, qui a identifié et caractérisent la première plante PLS virale, peuvent être adaptés pour la découverte de séquences PLS en protéines plus ciblées Pd.

Introduction

Plasmodesmes (DP) fonctionnent comme des conduites de transport intercellulaire des régulateurs clés du développement de la plante et morphogenèse, allant de facteurs de transcription de l’ARNm et de petites molécules d’ARN. En outre, cette capacité de transport macromoléculaire de Pd est utilisée par la plupart des virus végétaux pour leur propagation intercellulaire au cours de l’infection ; pour vous déplacer dans Pd, virus de plantes ont évolué des protéines spécialisées, appelées protéines de mouvement (MPs), visant spécifiquement les Pd^1,2,3,

Protocol

1. matériel végétal

1. Choix des espèces végétales
2. Utiliser les espèces de plantes indigènes à la protéine d’intérêt, c'est-à-dire, celui qui code cette protéine des protéines endogènes ou qui représente l’hôte naturel de l’agent pathogène pour les protéines virales. En outre, les espèces de plantes choisies doivent être favorable à la méthode choisie de transformation génétique transitoire.
   Remarque : Les études emploient couramment Nicotiana benthamiana, qui représente un bon hôte pour TMV et se transforme efficacement par la technique de la transformation par Agrobacterium génétique, c'est-à-dire, agroinfiltration (voi....

Results

Les données représentatives, qui fidèlement illustrent les résultats attendus des protocoles décrits et identifient le TMV MP PLS, constituent des adaptations de Yuan et al. ²¹. figure 1 a tout d’abord résume les principales constructions exprimant la pleine longueur TMV MP (1-268), MP de TMV PLS (comprenant les 50 premiers résidus d’acides aminés de la protéine, 1-50), et ses alanine numérisation V4A dérivés fusionnée à la CFP (généré com.......

Discussion

Ce protocole a quatre constituants de base : le concept d’identifier une séquence qui est nécessaire et suffisant pour le ciblage de Pd, division systématique de la protéine d’intérêt en fragments qui diminuent progressivement de longueur, fusionnant la testé fragments d’une protéine auto-fluorescente qui sert comme balise et comme cargaison macromoléculaire et test fonctionnel pour Pd ciblant la vie des plantes tissus après une expression transitoire des protéines de fusion testé. Notez que l’expression transitoire par .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope confocal à balayage laser (CLSM)	Zeiss	LSM5	Tout CLSM ayant des capacités similaires est approprié
Logiciel Zen pour l’imagerie au microscope confocal	Zeiss	2009	Le logiciel doit être compatible avec le
kit de mutagénèse dirigée Quickchange II utilisé par CLSM  ;	Agilent	200523
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
MES	Sigma-Aldrich	69892
Seringues sans aiguilles	BD	309659
MgCl2	FisherScientific	M33-500
Spectinomycin  ;	Sigma-Aldrich	S4014
Rifampicine	Sigma-Aldrich	R3501
Ampicilline  ;	Sigma-Aldrich	A0166