Identification de séquences de localisation Plasmodesmal en protéines In Planta

Plasmodesmes (DP) fonctionnent comme des conduites de transport intercellulaire des régulateurs clés du développement de la plante et morphogenèse, allant de facteurs de transcription de l’ARNm et de petites molécules d’ARN. En outre, cette capacité de transport macromoléculaire de Pd est utilisée par la plupart des virus végétaux pour leur propagation intercellulaire au cours de l’infection ; pour vous déplacer dans Pd, virus de plantes ont évolué des protéines spécialisées, appelées protéines de mouvement (MPs), visant spécifiquement les Pd^{1,2,3,4,5,6 , 7}. les voies moléculaires du transport Pd très probablement sont intimement liés avec les séquences spécifiques qui ciblent les protéines transportées dans ces voies. Ainsi, l’identification de ces signaux de localisation de Pd (PLSs) peut être diagnostique de la voie de transport Pd correspondante. C’est par analogie des Pd transport⁸, par exemple, à l’importation nucléaire différentes voies, qui peuvent être spécifiques pour localisation nucléaire différents signaux (NLS) séquences^9,10. D’un point de vue conceptuel, sln tant PLSs représentent non-CLIVABLES subcellulaires ciblage des séquences qui sont nécessaires et suffisantes pour le ciblage. Cependant, contrairement à la sln¹¹, les informations de séquence sur PLSs sont fortement limitées. Plus précisément, seuls quatre séquences de protéines impliquées dans le ciblage de Pd ont été signalés, avec tous les dérivés de protéines végétales endogènes. L’un est représenté par un domaine homéotique KN1¹² – un facteur de transcription qui déplace des couches cellulaires internes à l’épiderme de la feuille de plante¹³ – et ses homologues de KNOX¹⁴. L’autre est aussi d’un facteur de transcription, Dof, qui contient un PLS putatif décrit comme le trafic intercellulaire (IT) motif¹⁵. La troisième séquence est de la protéine de la membrane PDLP1 plasmodesmes résident de type 1, et elle est représentée par un domaine transmembranaire¹⁶. Enfin, le quatrième parti démocrate ciblant la séquence a été récemment signalé pour glycosylphosphatidylinositol (GPI)-protéines ancrées et il est représenté par la glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification signal¹⁷.

Fait intéressant, jusqu'à tout récemment, aucune PLSs n’ont été rapportés pour MPs virales. Études antérieures a révélé la présence de séquences PLS putatifs en usine virale MPs^18,19, mais aucun vrai PLS, c'est-à-direune séquence minimale d’acides aminés fois nécessaire et suffisante pour le Pd ciblage d’une cargaison non apparentés molécule ( e.g., CFP) a été identifié dans un MP virale. Encore une de ces protéines, MP du virus de la mosaïque du tabac (TMV), était le premier pour lequel Pd localisation et transports ont été démontrées²⁰.

Pour combler cette lacune, nous avons développé une stratégie expérimentale pour identifier les PLS MP TMV. Cette stratégie repose sur trois concepts. (i) nous avons défini PLS comme une séquence minimale d’acides aminés qui est nécessaire et suffisant pour cibler les protéines à Pd²¹. (ii) parce que le TMV MP vise tout d’abord les Pd et puis translocation à travers ces canaux²², nous nous sommes efforcés à découplage ces deux activités et à identifier la bonne foi PLS, qui fonctionne uniquement pour le ciblage de Pd et non pour le transport ultérieur. (iii) nous avons analysé les PLS identifiés pour les résidus d’acides aminés importants pour sa Pd ciblant l’activité, qu’elle soit structurellement ou fonctionnellement. En utilisant cette approche, nous avons délimité une séquence de résidus acides aminés 50 à l’extrémité aminée-TMV MP qui agit comme véritable PLS. Cela a été fait en produisant une série de fragments de TMV MP saturées toute la longueur de la protéine, marquage de leurs extrémités carboxyle avec CFP et transitoirement les exprimer dans des tissus végétaux. Localisation de PD de chacun des fragments testés a été déterminée par leur co-exprimant avec une protéine de marqueur de Pd, PDCB1 (protéine obligatoire de callose Pd 1)²³. Le plus petit fragment qui toujours localisée à Pd, mais ne pas Pd, était censé représenter les PLS. Enfin, le PLS a été alanine-analysés afin de déterminer les résidus d’acides aminés essentiels nécessaires à sa structure ou de fonction.

Alors qu’ici nous illustrons cette approche en décrivant l’identification de TMV MP PLS, il peut servir à découvrir PLSs dans aucune autre protéine ciblée Pd, si codé par les agents pathogènes des plantes ou par les plantes elles-mêmes ; C’est parce que notre méthode ne tire pas parti des fonctionnalités uniques de MPs virales en ce qui concerne leur capacité à cibler à Pd.

1. matériel végétal

1. Choix des espèces végétales
2. Utiliser les espèces de plantes indigènes à la protéine d’intérêt, c'est-à-dire, celui qui code cette protéine des protéines endogènes ou qui représente l’hôte naturel de l’agent pathogène pour les protéines virales. En outre, les espèces de plantes choisies doivent être favorable à la méthode choisie de transformation génétique transitoire.
   Remarque : Les études emploient couramment Nicotiana benthamiana, qui représente un bon hôte pour TMV et se transforme efficacement par la technique de la transformation par Agrobacterium génétique, c'est-à-dire, agroinfiltration (voir étape 3). Aussi, N. benthamiana plants poussent facilement et ont de grandes feuilles, qui sont facilement inoculés par Agrobacterium et facilement analysés par microscopie confocale.
3. Croissance des plantes
   1. N. benthamiana semer dans un sol humide à haute densité. Gardez-les dans une chambre à atmosphère contrôlée à 20-25 ° c sous 16 h de lumière à ~ 75 µmol photons m^-2 s^-1 et 8 h d’obscurité. Lorsque le diamètre d’euphyll atteint 0,5 cm, soigneusement transférer les semis dans des pots plus grands et poursuivre la croissance dans la même chambre aux mêmes conditions.
   2. Maintenir les plantes jusqu'à ce qu’ils cultivent au stade 4-8 feuilles dans les 4 semaines, quand les feuilles plus grandes sont 4-6 cm de diamètre ; en ce moment, ils peuvent être utilisés pour agroinfiltration (voir étape 3).
      NOTE : Ce qui est important, ne jamais utiliser les plantes si ils ont commencé à fleurir car, à ce stade de développement, l’architecture des feuilles varie souvent^24,25, aboutissant parfois à des résultats incohérents.

2. expression Vector Construction

1. Choix du système d’expression
   1. Choisissez l’expression système, c.-à-d., vecteurs et vecteur bordereaux, mieux adapté à l’expression de la protéine d’intérêt chez les espèces de plantes étudiées.
      NOTE : Parfois, ces combinaisons spécifiques de la protéine testé/plante peuvent exiger des vecteurs spécifiques et vector méthode de livraison pour une expression optimale et fonction de la protéine d’intérêt. Pour plus de dicotylédones, cependant, sélectionnez binaires plasmides vecteurs d’expression et agroinfiltration comme système de diffusion.
2. Marquage fluorescent protein
   1. Fluorescent étiqueter chaque protéine exprimée pour l’analyse de sa distribution subcellulaire²², y compris la localisation de Pd.
      Remarque : Employer auto-fluorescente protéines, telles que la PCP et DsRed2, sous forme de balises. Tag la protéine testée avec CFP et il coexpriment avec un DsRed2 libre. Fonctions de PCP comme balise et une molécule de cargaison de virus non liés. DsRed2 fonctions de calibrer l’efficacité globale d’expression transitoire et, parce qu’elle est cellule autonome, pour identifier la cellule initialement transformée ; cette dernière fonction est importante lors de l’évaluation de cellule à cellule mouvement de protéines testées potentiellement non-cellule-autonomes. Pour coexpression avec le marqueur de Pd PDCB1, qui est également une cellule autonome, Baliser la protéine testée avec la CFP et PDCB1 avec DsRed2.
   2. Suivant une règle simple, fusionner la balise auto-fluorescente à l’extrémité carboxyle-terminale de la protéine exprimée. Toutefois, si les expositions étiqueté protéines testées pleine longueur compromis ciblant les Pd, transférer le tag à l’extrémité aminée-de la protéine.
   3. Cloner les séquences codantes des protéines à tester dans un vecteur d’expression de végétaux adaptés.
      Remarque : Il existe de nombreux vecteurs d’expression de différentes plantes qui permettent un marquage fluorescent. Nous utilisons une série de SPAT plasmides²⁶ ou certains de leurs dérivés^27,28, qui conviennent pour le clonage de la séquence d’intérêt directement au châssis avec les balises auto-fluorescente suggérés (voir étape 2.2.1) dans les deux amino- et orientations du carboxyl-terminale.
   4. Transférer chaque cassette d’expression dans un vecteur binaire d’Agrobacterium.
      Remarque : Bien qu’axée sur la SPAT constructions ne conviennent pas pour la livraison de biolistique directement dans les tissus végétaux, agroinfiltration, qui est la méthode de transformation recommandée ici (voir étape 3), exige que la cassette d’expression qui sera situé entre l’ADN-T frontières d’un binaire vecteur²⁹.
      Remarque : Tous les vecteurs de SPAT sont conçus pour permettre ce transfert à la pPZP-RCS2 multigénique expression vecteur binaire^26,30 par une seule étape de clonage utilisant des nucléases rare coupe asques, j’ai-PpoI, I-SceI, I-CeuI, IPPG-PI et PI-TliI ²⁶. chercheurs qui préfèrent utiliser le clonage à des fins recombinatorial, par exemple, à l’aide de sites hétérologue lox ³¹, peuvent employer SPAT vecteur variantes^26,27.
   5. Pour coexpression, transférer les deux cassettes d’expression, par exemple, protéines testée-CFP et DsRed2 ou CFP-protéines testée et PDCB1-DsRed2 (voir point 2.1), pour le même vecteur binaire pPZP-RCS2.
      Remarque : Vous pouvez également Agrobacterium cultures hébergeant des constructions individuelles binaires peuvent être mélangés pour infiltration N. benthamiana (voir étape 3.1).

3. Agroinfiltration

1. Ajouter 1 µg d’un plasmide pPZP-RCS2 à base de culture 2.2.5 à 100 µL étape des cellules compétentes d’Agrobacterium tumefaciens souche EHA105 ou GV3101 préparé comme décrit³², incuber sur glace pendant 30 min, flash-congélation dans l’azote liquide pendant 1 min, et Incuber à 28 ° C pendant 15 minutes.
   1. Ensuite, ajouter 1 mL de milieu LB (tryptone 10 g/L, extrait de levure 5 g/L et 10 g/L de NaCl) dans le mélange de cellules compétentes et incuber à 28 ° C pendant 2 h. Spin down les cellules à 3 000 × g pendant 1 min, re-suspendez-les dans 0,2 mL de LB et leur plaque d’identification sur gélose LB avec des antibiotiques appropriés (par exemple, 100 mg/L spectinomycine et rifampicine 50 mg/L pour les vecteurs de base pPZP-RSC2^26,30). Croître à 28 ° C pendant 48 h, jusqu'à ce que les colonies individuelles sont visibles.
2. Choisissez et blanc sur plaque de plusieurs colonies individuelles sur une gélose LB au frais (voir étape 3.1), poussent à 28 ° C pendant 48 h et prendre une petite quantité de bactéries pour l’analyse par PCR de colonie³³ pour confirmer la présence des constructions binaires spécifiques.
3. Grandir à chaque colonie d’Agrobacterium avec la construction d’intérêt du jour au lendemain à 28 ° C dans 5 mL de milieu LB additionné d’antibiotiques appropriés (voir étape 3.1.1). Centrifuger les cellules à 3 000 × g et remettre en suspension les OD₆₀₀= 0,5 dans agroinfiltration tampon (10 mM MgCl₂, 10 mM MES (pH 5,6), 150 µM acétosyringone). Incuber pendant 2 h à température ambiante.
   1. Si vous utilisez un mélange de plasmides binaires plutôt qu’un plasmide seule expression multigénique pour coexpression de protéine, mélanger les cultures de cellules correspondant au ratio de 1:1 v/v avant infiltration. Puis incuber les cellules à 28 ° C pendant 2 h.
4. Charger l’inoculum dans une seringue en plastique de 1 mL et la presse que laisse l’embout de la seringue (sans aiguille) contre l’épiderme inférieur (abaxiale) de la pleine maturité N. benthamiana . Tenez la feuille avec un doigt ganté sur la face adaxiale^34,35.
   1. Introduire l’Agrobacterium dans le milieu de l’infiltration par injection lente. Signification statistique, s’infiltrer dans plusieurs feuilles sur chaque plante.
      NOTE : Notez que les feuilles plus anciennes ne sont pas utilisés car ils ne donnent pas les niveaux d’expression cohérente.
   2. Inoculer les feuilles in situ. Maintenir la plante infiltrée jusqu'à observation tel que décrit à l’étape 1.2.

4. confocal Microscopy

1. Utilisez une lame pour couper chaque feuille en fragments entre les veines 24-48 h après l’infiltration, (en fonction de l’efficacité d’expression transitoire de la protéine spécifique testée) ; la taille de chaque tranche de tissu doit être telles que la tranche est entièrement recouvert par le couvercle en verre (22 mm x 40 mm) utilisé pour la microscopie.
2. Place les tranches de feuille sur l’objet, faites glisser avec la face abaxiale vers le haut, placez une goutte d’eau sur la tranche de la feuille et couvrir avec le couvercle en verre. Immobiliser le couvercle en verre avec de petits morceaux de ruban de chaque côté.
3. Observez les tissus agroinfiltrated sous un microscope confocal à balayage de laser et les images qui en résultent.
   1. Tout d’abord, utilisez un objectif de 10 X pour identifier les cellules avec le signal et ensuite utiliser 63 x objectif pour des observations plus détaillées.
   2. Longueur d’onde d’utilisation la 458 nm d’un laser à argon ion pour exciter la CFP et 543 nm pour exciter DsRed2. Conserver tous les paramètres d’acquisition d’images, c'est-à-dire, intensité du laser et des paramètres de tube (PMT) de photomultiplicateur, entre expériences. En moyenne, examiner pour chaque condition expérimentale, les cellules de 100-120.

5. identification des PLS

1. Diagnostiquer la localisation de la protéine testée à l’aide de microscope confocal (section 4). Vérifier si la protéine testée a la caractéristique motif ponctuée périphérique^{25,36,37,38,39,40,41} et putative avec le marqueur Pd PDCB1²³. Cela indique que la protéine testée contienne probablement des séquences PLS.
2. Après confirmation de l’activité PLS de protéines testées, subdivisez progressivement son cadre de lecture ouvert (ORF) (numéro d’accession genbank BAF93925.1) en petits fragments, autofluorescently, (p. ex., PCP) marquer chacun d'entre eux et d’analyser leur localisation sous-cellulaire tel que décrit à l’étape 4. Initialement, la taille de 100 résidus d’acides aminés pour chaque fragment de Loti est recommandée.
3. Subdiviser davantage les fragments tronqués qui ont l’activité PLS et vérifier leur localisation subcellulaire tel que décrit à l’étape 4 jusqu'à ce que le plus petit fragment qui toujours se localise à Pd, c'est-à-dire est suffisant pour transporter la cargaison de balise auto-fluorescente à Pd, est identifié. Ce fragment est censé représenter la séquence PLS.
4. Supprimer le PLS putatif de la protéine pleine longueur testée, c'est-à-dire fusionner la partie restante de la protéine test sans PLS putatif à tag auto-fluorescente et déterminer la localisation intracellulaire de la protéine mutante qui en résulte, comme décrit à l’étape 4. Si cette protéine mutante qui n’a pas le PLS putatif ne parvient pas à localiser à Pd, cela indique que l’identifiés PLS n’est pas seulement suffisante (voir étape 5.3), mais aussi nécessaire pour le transport de Pd de la protéine testé.
5. Agroinfiltrate les feuilles avec un mélange de cultures d’Agrobacterium hébergeant l’expression construisent pour le CFP-tag PLS et DsRed2 libre (voir étape 3.3). Observer les tissus infiltrés à l’aide de microscope confocal avec porte-objectif 10 x en utilisant les mêmes paramètres que dans l’étape 4.3.
6. Marquer des cellules qui contiennent des signaux CFP tant DsRed2 comme cellules initialement infiltrés et marquer les cellules adjacentes contenant seulement le signal de la PCP comme ceux ce mouvement de la pièce.
   Remarque : Cette étape porte sur le PLS identifiée pour sa capacité de mouvement de cellule à cellule potentiels ; C’est parce que beaucoup de protéines qui ciblent les Pd (y compris la plupart des plantes virales MPs) parcourir aussi Pd et les cellules voisines. La concentration d’Agrobacterium, utilisé pour l’infiltration dépend l’efficacité de l’expression des différentes structures, respectivement. Pour agroinfiltration, assurez-vous d’utiliser la dilution de la culture de cellule qui veille à la transformation (i) des cellules simples, laissant les cellules adjacentes non transformés, (ii) permet d’obtenir une efficacité similaire d’expression. Par exemple, nos expériences utilisent OD₆₀₀ de 0,01 à 0,005 pour l’expression de PCP-tag PLS et libre DsRed2, respectivement.

6. identification des clés PLS les résidus à l’aide de balayage d’Alanine⁴²

1. Utiliser les protocoles PCR standard pour amplifier la PLS codage séquence employant une paire d’amorces destinés à contenir de la mutation souhaitée, c'est-à-dire, substitution du résidu d’acide aminé de cible avec alanine, autour de la région centrale de chaque amorce comme décrit ²¹. procéder à la conception d’amorce et utiliser le kit de mutagénèse dirigée pour la mutagénèse dirigée selon les instructions du fabricant.
2. Purifier les produits PCR résultantes à l’aide de n’importe quel kit de purification de l’ADN standard et digérer à 37 ° C avec DpnI pour éliminer le parental méthylés (c'est-à-direnon muté) et ADN hemimethylated. Cela refroidir pendant 5 min à température ambiante (pas sur la glace). Puis transformer le mélange directement dans e. coli cellules compétentes⁴³et identifier les colonies avec les constructions de mutant désirées comme décrit à l’étape 3.2.
3. Introduire les constructions mutantes dans le vecteur binaire comme indiqué au point 2.2.4, effectuez agroinfiltration tel que décrit à l’étape 3 et évaluer les Pd ciblage comme décrit aux étapes 4 et 5.1.

Les données représentatives, qui fidèlement illustrent les résultats attendus des protocoles décrits et identifient le TMV MP PLS, constituent des adaptations de Yuan et al. 21. figure 1 a tout d’abord résume les principales constructions exprimant la pleine longueur TMV MP (1-268), MP de TMV PLS (comprenant les 50 premiers résidus d’acides aminés de la protéine, 1-50), et ses alanine numérisation V4A dérivés fusionnée à la CFP (généré comme décrit dans les étapes 2.2, 5.2 et 6) tandis que la Figure 1 b résume et quantifie la localisation subcellulaire de ces protéines étiquetées. La figure 1 illustre les périphériques ponctuée Pd localisation configurations caractéristiques observées pour MP-CFP TMV et pour TMV MP PLS-CFP ainsi que pour le marqueur de Pd coexpressed, PDCB1-DsRed2 (voir étape 5.1). Figure 2 a illustre Pd ciblage de TMV MP-PCP et distribution TMV MP PLS-CFP et nucléocytoplasmique de DeRed2 gratuit coexpriment (voir étape 5.1). Enfin, la Figure 2 b illustre la perte de Pd ciblage par TMV MP et TMV MP PLS avec une substitution simple alanine V4A, indiquant que ce résidu est important pour les responsables de projet structure ou la fonction ; dans les mêmes cellules le marqueur Pd coexpressed PDCB1 localise encore aux Pd (voir étape 6).

Ces données montrent que cette procédure simple sur le plan conceptuel et technique de la production systématique de fragments protéiques, leur fusion à une protéine de marqueur-cargo auto-fluorescente et test de la capacité de localiser à Pd peut identifier une séquence de protéine minimum nécessaire et suffisante pour Pd ciblage, c.-à-d., PLS. Pour une interprétation correcte de ces données de localisation, il est essentiel d’effectuer des expériences de co-localisation avec une protéine connue de Pd, par exemple, PDLP ou PDCB membres de la famille16,23 ou l’un de l’usine virales MPs ce genre de Pd44 . Évidemment, la colocalisation n’a pas à être complet, pas de toutes les protéines P-localisation peuvent être ciblés pour la même periode, mais un degré significatif de co-localisation avec au moins une des protéines de marqueur Pd est nécessaire pour définir l’activité PLS.

Figure 1 : Identification des MP TMV pls (A) résumé des principales constructions de PCP-fusion utilisée pour identifier les boîtes de TMV MP pls TMV MP de séquences, vert ; CFP, boîtes bleues ; P, promoteur ; T, terminator. Les nombres à gauche indiquent les résidus d’acides aminés inclus dans chaque fragment de TMV MP. (B) résumé de localisation sous-cellulaire des protéines de fusion indiqué dans (A). Localisation de PD ou nucléocytoplasmique localisation a été déterminée basé sur la localisation des marqueurs subcellulaires correspondantes, PDCB1-DsRed2 et DsRed2 libre, respectivement. Le pourcentage de cellules présentant chaque localisation apparaît fondée sur la notation 100 cellules exprimant par construction dans trois expériences indépendantes. Données sont des moyennes ± erreurs-types (SE). (C) Pd ciblage de TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP et le marqueur de Pd PDCB1-DsRed2. Signal de la CFP est en bleu ; DsRed2 signal est en violet ; plaste autofluorescence était filtré. Les images sont simples sections confocale. Barreaux de l’échelle = 10 µm. DIC, micrographie contraste interférentiel différentiel. Ce chiffre est une adaptation du Yuan et al. 21. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Pd ciblage de TMV MP, MP TMV PLS et leurs mutants alanine-balayage. (A) la localisation sous-cellulaire des VMT MP-CFP, TMV MP PLS-CFP et le marqueur nucléocytoplasmique DsRed2. Perte de la (B) de Pd, au ciblage capacité des mutants V4A alanine-numérisation de TMV MP-CFP et TMV MP PLS-CFP. PD ont été visualisées par coexpression du marqueur Pd PDCB1-DsRed2. Signal de la CFP est en bleu ; DsRed2 signal est en violet ; plaste autofluorescence était filtré. Les images sont simples sections confocale. Barreaux de l’échelle = 10 µm. DIC, micrographie contraste interférentiel différentiel. Ce chiffre est une adaptation du Yuan et al. 21. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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