Article de méthode

En utilisant les cultures primaires Neurosphère à étudier primaire Cilia

DOI :

10.3791/55315

⸱

14 avril 2017

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

Dans cet article

Résumé

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Le cil primaire est fondamentalement important dans la prolifération des cellules progénitrices de neurones, la différenciation neuronale et la fonction neuronale adulte. Nous décrivons ici une méthode pour étudier ciliogenèse et la traite des protéines de signalisation dans les cellules à cilia souches / progénitrices de neurones et les neurones différenciés en utilisant des cultures de neurosphères primaires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cil primaire est d’une importance fondamentale pour la prolifération des cellules souches neurales/progénitrices et pour la différenciation neuronale au cours de la vie embryonnaire, postnatale et adulte. De plus, la plupart des neurones différenciés possèdent des cils primaires qui abritent des récepteurs de signalisation, tels que les récepteurs couplés aux protéines G, et des molécules de signalisation, telles que les adénylyl cyclases. Le cil primaire détermine l’activité de plusieurs voies de développement, y compris la voie du hérisson sonique pendant le développement neuronal embryonnaire, et fonctionne également dans la promotion de la signalisation subcellulaire compartimentée pendant la fonction neuronale adulte. Sans surprise, des défauts dans la biogenèse et la fonction du cil primaire ont été liés à des anomalies du développement du cerveau, à l’obésité centrale et à des déficits d’apprentissage et de mémoire. Ainsi, il est impératif d’étudier la biogenèse primaire du cil et le trafic ciliaire dans le contexte des cellules souches neurales/progénitrices et des neurones différenciés. Cependant, les méthodes de culture des neurones primaires nécessitent une expertise considérable et ne se prêtent pas aux cycles de gel-dégel. Dans ce protocole, nous discutons des méthodes de culture pour des populations mixtes de cellules souches neurales/progénitrices utilisant des neurosphères primaires. Les méthodes de culture basées sur la neurosphère offrent les avantages combinés de l’étude des cellules souches neurales primaires/progénitrices : adaptation à des passages multiples et à des cycles de gel-dégel, potentiel de différenciation en neurones/glie et transfectabilité. De manière significative, nous avons déterminé que les cellules souches neurales/progénitrices dérivées de la neurosphère et les neurones différenciés sont ciliés en culture et localisent les molécules de signalisation pertinentes pour la fonction ciliaire dans ces compartiments. À l’aide de ces cultures, nous décrivons plus en détail des méthodes pour étudier la ciliogenèse et le trafic ciliaire dans les cellules souches neurales/progénitrices et les neurones différenciés. Ces méthodes basées sur la neurosphère nous permettent d’étudier les voies cellulaires régulées par les cils, y compris le récepteur couplé aux protéines G et la signalisation du hérisson sonique, dans le contexte des cellules souches neurales/progénitrices et des neurones différenciés.

Introduction

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Le cil primaire est un compartiment subcellulaire dynamique basée microtubules qui fonctionne comme une antenne sensorielle dans la coordination des voies de signalisation cellulaires, y compris la voie Hedgehog Sonic (Shh) au cours du développement des neurones embryonnaires 1, 2, et compartimentée signalisation intracellulaire dans la fonction neuronale adulte 3, 4 . Les composants de signalisation de ces voies, telles que le récepteur de Shh Patched 5; l'activateur de la voie Smoothened (Smo) 6; et Gpr161 7, un récepteur (de GPCR) orphelin couplé à la protéine G qui régule négativement la voie Shh, à localiser les franges de façon dynamique. RCPG multiples ont été signalés à localiser au cil dans les neurones dans le cerveau 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Des défauts dans les voies de signalisation et les franges générées ciliées affectent de multiples tissus et sont collectivement connus sous le nom ciliopathies 17, 18, 19. Le spectre de la maladie de ciliopathie comprend souvent des défauts du développement neurologique, tels que des anomalies craniofaciales 20, 21, 22. En outre, les cils primaires dans les neurones hypothalamiques réguler voies centrales de satiété, et les défauts résultent de l'obésité centrale 23, ce qui reflète l' obésité chez ciliopathies syndromiques telles que le syndrome de Bardet Biedel 24. De plus, la signalisation du récepteur de neuropeptide dans cilia régule CENTRal satiété pathways 11, 14. Localisation ciliaire de l' adénylyl cyclase III (ACIII) et GPCR comme récepteur de la somatostatine 3 dans les neurones hippocampiques entraîner de nouveaux défauts de reconnaissance d'objets et des déficits de la mémoire 25, 26 et parallèle à un manque d'intégrité ciliaire 27. Les aspects relatifs au développement de la signalisation générés ciliées sont étroitement liés à l'homéostasie tissulaire; en particulier, les cils sont importants pour la progression des médulloblastomes Shh sous-type provenant de progéniteurs de granulés dans le cervelet 28, 29. Ainsi, cilia primaires jouent un rôle important au cours de l'embryon, post-natale, et le développement des neurones adultes et la fonction.

Les cellules souches neurales (NSC) se trouvent dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) du ventricule latéral, la zone sous-granulaire du gyrus denté de l'hippocampe, et lezone ventriculaire du troisième ventricule dans l'hypothalamus chez les mammifères , 30, 31, 32. Sont multipotentes NNC, possèdent la capacité d'auto-renouvellement, et sont importants pour le développement du cerveau et de la médecine régénérative 30. La plupart NNC dans le SVZ sont au repos et possèdent un cil primaire solitaire qui, dans de nombreux cas, s'étend vers le ventricule latéral 33. Les signaux de cil primaire par l' intermédiaire de la localisation des différents récepteurs, induisant des réponses cellulaires en aval, en particulier dans le cadre de Shh, TGFß, et les voies de la tyrosine kinase du récepteur 2, 34, 35, 36. Étant donné que les cils primaires pénètrent dans le ventricule latéral, on suppose que les cils primaires détecter des cytokines dans le liquide céphalorachidien (LCR) pour activer NSCs 37 . Des études récentes suggèrent que la voie de signalisation de Shh et primaire sont essentiels cilia pour l'activation des cellules souches dans la réparation et la régénération des tissus multiples, y compris l'épithélium olfactif, du poumon et du rein 38, 39, 40, 41. Cependant, les mécanismes par lesquels CSF communique avec NNC et si les cils primaires sont impliqués ne sont pas connus. NNC en culture sont adhérentes ciliés; localiser les composants de voie Shh, tels que Smo et Gpr161 dans les cils; et sont Shh sensible 42. Ainsi, NNC peut servir de système de modèle important pour étudier la voie Shh, le trafic ciliaire, et les voies de différenciation neuronale. De plus, les neurones différenciés de NNC peuvent également être utilisés pour les analyses de trafic ciliaire.

Neurosphères sont constitués par des amas de cellules flottantes provenant de la prolifération des NEURAL souches / cellules progénitrices qui se développent en présence de facteurs de croissance spécifiques et des surfaces non adhésives 43, 44. Neurosphères servent aussi important in vitro des modèles de culture pour étudier souches neurales / cellules souches dans le développement normal et la maladie 31, 45, 46, 47. Nous décrivons ici un dosage à base Neurosphère-pour la culture de souches neurales / cellules souches et de différenciation en neurones / glie. Nous soulignons en particulier la traite des composants de signalisation à cil de souches neurales / cellules souches et les neurones différenciés (figure 1). Par opposition à la culture de neurones primaires, neurosphères primaires sont relativement faciles à la culture, se prêtent à de multiples passages et cycles gel-dégel, et peuvent se différencier en neurones / glie. Il est important, nous avons déterminé que de neurones dérivés Neurosphère-les cellules souches / progénitrices et les neurones différenciés sont ciliés en culture et localiser des molécules de signalisation pertinentes pour la fonction ciliaire dans ces compartiments. méthodes de culture à base de neurosphères peuvent servir de système de modèle idéal pour étudier le trafic de ciliogenèse et ciliaire dans NNC et les neurones différenciés.

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Protocole

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1. Isolement de Neurosphères de la souris adultes du cerveau

  1. Euthanasier une souris adulte (environ 2 mois) par une surdose de isoflurane. Double-vérifier que la souris a cessé de respirer et de disséquer immédiatement après la mort.
  2. Avec des ciseaux, faire une incision médiane pour ouvrir le crâne. Retirez le cerveau.
  3. Placez le cerveau dans du PBS froid dans un plat de 10 cm sur la glace. Suivre toute la méthode de montage dissection pour obtenir la SVZ du ventricule latéral 48.
  4. Placer le ventricule latéral dans un tube de 1,5 ml, ajouter 500 ul de 0,05% de trypsine-EDTA dans du PBS, et laisser incuber le tube pendant 15 min à 37 ° C dans un bain d'eau.
  5. Après 15 min, ajouter 500 ul de milieu et d'arrêt en douceur pipeter 20 - 30 fois avec une pointe de 1 mL. Éviter la formation de bulles d'air pendant le pipetage.
    REMARQUE: Cette étape est essentielle pour la survie des cellules.
  6. Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 8 min. Jeter le surnageant, ajouter 1 ml de PBS, et remettre en suspension til les cellules par pipetage 5x avec une pointe de 1 ml.
  7. Centrifuger à 500 g pendant 8 min. Jeter le surnageant en utilisant une pointe de 1 mL et ajouter 1 ml de milieu de base.
  8. (Facultatif) Si les débris cellulaires sont observés, passer les cellules à travers un tamis cellulaire de 70 um.
  9. Compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre; en général, environ 30 000 - 60 000 cellules / SVZ sont obtenues.
  10. Plaque les cellules provenant de l' un SVZ dans une boîte de 10 cm avec 10 ml de milieu NSC et la culture à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  11. (Facultatif) Pour éviter la fusion entre les sphères 49, mettre 1000 cellules dans un seul puits d'une très faible liaison de plaque à 6 puits qui est pré - remplie avec 1,5 ml de milieu NSC et la culture à 37 ° C avec 5% de CO 2.
    NOTE: Après 5-7 jours, neurosphères peuvent être observés (figure 2A). La période de culture peut varier avec l'âge de la souris ou l'arrière-plan génétique.
  12. Ajouter 2 ml de milieu NSC tous les 3-4 jours pour maintenir la culture(Ne retirez pas le support existant).

2. Analyse de la différenciation des capacités des tests neurosphères et Ciliogenèse

  1. Pour analyser la capacité de différenciation, d'analyser les neurosphères dans des conditions adhérentes dans un milieu de différenciation.
  2. Stériliser 12 mm lamelles rondes par autoclavage ou par exposition aux rayons UV avant l'utilisation. Pour une culture de cellules adhérentes, mettre un couvercle en verre stérilisé ronde de 12 mm dans un puits d'une plaque à 24 puits dans des conditions aseptiques.
  3. Enduire le cache de verre pour 10 s avec 500 ul de 0,002% de poly-L-lysine (PLL). Aspirer la solution et la sécher pendant 10 à 15 min.
  4. Ajouter 500 ul de solution de laminine (5 pg / pl). Incuber le cache de verre pendant 1 h à 37 ° C.
  5. Aspirer la laminine et ajouter 500 ul de milieu de différenciation ou de milieu NSC (témoin non différencié).
  6. Pour le dosage de la différenciation, ramasser 100 - sphère de 200 um avec une pointe de 200 pi au microscope. Ajouter5-10 neurosphères dans chaque puits d'une plaque à 24 puits et la culture pendant 7-10 jours dans un milieu de différenciation.
  7. Pour analyser neurosphères indifférenciées, ajouter 5-10 neurosphères à chaque puits d'une plaque de 24 puits et de la culture pendant 1-2 jours dans un milieu NSC. Neurosphères attachés se propagent et se développent en monocouche (figure 2B).
  8. Après avoir retiré soigneusement le support, fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS pendant 15 min à température ambiante, puis on lave avec du PBS deux fois pendant 5 min à température ambiante. La plaque peut être stockée à 4 ° C pendant 1-2 mois.
    NOTE: Pour visualiser les cellules souches / progénitrices neurales dans un milieu NSC et des cellules différenciées dans un milieu de différenciation, effectuer une immunocoloration contre la nestine (souche neurale / marqueur de cellules progénitrices), β-tubuline III (monoclonal TUJ1, marqueur neuronal), GFAP (gliale fibrillaire acide Protein , un marqueur des astrocytes) et O4 (marqueur des oligodendrocytes) (Figure 2B-E). Pour analyser le cil, effectuer immunomarquage contre Arl13b (ci primairemarqueur lia) et Gpr161 (GPCR de ciliaire) (Figure 3).
  9. Monter le couvercle en verre avec une solution de montage sur une lame de verre. Incliner la lame de verre pour éliminer l'excès de solution.

3. Analyse des Ciliogenèse dans Neurosphères

  1. Pour analyser les cellules de neurosphères intactes par immunocoloration, le transfert de 1 ml de culture un milieu contenant de multiples neurosphères à un tube de 1,5 ml et centrifuger à 500 g pendant 8 min. Fixer les sphères avec 4% (PFA), après élimination du milieu pendant 15 minutes et on lave avec du PBS. Isoler sphères à 500 g pendant 8 min, retirer le surnageant, et incuber les sphères O / N à 30% de saccharose à 4 ° C.
  2. Jeter le surnageant en utilisant une pointe de 1 mL et ajouter 500 pi de solution à l'aide d'un coupe octobre bout 1 ml. Couper le bord de la pointe pour élargir l'ouverture, en octobre est visqueux.
  3. Transférer la solution contenant les neurosphères octobre dans un moule de congélation en plastique jetable (10 mm x 10 mm x 5 mm).
  4. Geler le mvieux sur la glace sèche pendant au moins 15 min.
  5. (Facultatif) Arrêtez l'expérience et de stocker le moule dans un congélateur -80 ° C pendant 1 an.
  6. Couper les sections avec un cryostat; l'épaisseur des sections doit être de 15 à 30 um.
  7. Pour visualiser les cils primaire dans un neurosphères, effectuer une immunocoloration contre Arl13b (Figure 4).

4. Culture et Passage de Neurosphères et NSCs Adhérent

  1. Passage neurosphères alors que la taille de la sphère se situe entre 100-200 um; lorsque les neurosphères sont trop gros (300 um ou plus), ils ne sont pas idéales pour les expériences.
  2. Transférer les neurosphères dans un tube de 50 ml en utilisant une pointe de 1 ml et centrifuger à 500 g pendant 8 min.
  3. Jeter le surnageant à l'aide d'un aspirateur, ajouter 500 ul de 0,05% de trypsine-EDTA dans du PBS, et laisser incuber pendant 5 minutes à 37 ° C. La quantité de trypsine varie en fonction du nombre de sphères.
  4. Ajouter 500 ul de milieu sérique et doucement tuyaut 20 fois avec une pointe de 1 ml.
  5. Centrifuger à 500 g pendant 8 min. Jeter le surnageant en utilisant une pointe de 1 mL et ajouter 1 ml de milieu de base.
  6. (Facultatif) Si neurosphères de débris cellulaires ou non dissociées sont vus, passer les cellules à travers une cellule de tamis de 70 um.
  7. Passage des cellules dans une boîte de 10 cm à une densité de 10.000 cellules / cm2 dans du milieu NSC; les cellules seront prêtes pour le passage suivant après une semaine.
  8. (Facultatif) Pour geler les cellules, ajouter le milieu de congélation pour générer 500 000 à 1.000.000 cellules / ml suspension. Geler les cellules en utilisant des conteneurs de cryo-gel; neurosphères peuvent non dissociées également gelée.
  9. Pour la culture adhérente, dillute les cellules à 50.000 cellules / cm 2 sur des lamelles revêtues de laminine-PLL- et avec le milieu NSC et culture pendant 1-2 jours.

5. Famine et analyse des Cilia

  1. Préparer milieu de privation (tableau 1).
  2. 1-2 jours après la pl initialeCLASSEMENT des cellules adhérentes après dissociation, le changement de milieu NSC dans un puits (témoin) et du milieu de privation dans un autre puits (expérience).
  3. Culture des cellules adhérentes à 24 h.
  4. Fixer les cellules avec 4% de PFA dans du PBS pendant 15 min à température ambiante et laver deux fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois à la température ambiante.
  5. (Facultatif) arrêter le test et stocker les plaques à 24 puits avec des lamelles dans du PBS à 4 ° C pendant 1-2 mois.
  6. Exécuter un protocole d'immunofluorescence pour la coloration 7, 50.
  7. Monter les lamelles en utilisant une solution de montage. Sécher la lame de verre O / N à la température ambiante dans l'obscurité.
  8. Acquérir des images sur un microscope composé au grossissement nécessaire. Utilisez un microscope, un appareil photo et objectifs (huile 40X / 1.3 et de l'huile 63X / 1.4), contrôlé en utilisant le logiciel accompagné. Prendre z sections suffisantes à 0,5-0,8 um intervalles (figure 5).
  9. Pour l'analyse quantitative de la localisation ciliaire dansles cellules adhérentes, acquièrent des piles d'images à partir de 3-8 trames consécutives avec des cellules confluentes en regardant dans le canal DAPI. Quantifier le nombre de cil primaire en utilisant ImageJ / Fidji. Typiquement, en utilisant l'outil « compteur de cellules » dans le plug-ins ImageJ> Analyse boîte de dialogue pour compter les cellules avec des cils GPCR-positive; projections maximales de piles d'images peuvent également être exportés à partir ImageJ / Fiji.Use intensité d'image similaire et les paramètres de contraste pour toutes les images de la même expérience pour le comptage et à des fins d'exportation.

6. Transfection de Neurosphères

  1. Adhérez dissocie les cellules à 24 h pour des lamelles. Utiliser une densité de cellules généralement entre 75.000 et 150.000 cellules dans 500 ul de milieu NSC dans un seul puits d'une plaque à 24 puits.
  2. Mélanger 25 ul de milieu de sérum réduit et 1,5 ul de réactif de transfection dans un microtube de 0,5 mL par tourbillonnement pendant 5 s.
  3. Ajouter 2,5 pg d'ADN de plasmide exempt d'endotoxine à 0,5 mL Microtub séparée contenant 25 ul de milieu de sérum réduit et vortexer pendant 5 s.
  4. Ajouter 1 pi de réactif de transfection au second microtube contenant de l'ADN et vortexer pendant 5 s.
  5. Ajouter le mélange dans le tube contenant l'ADN du premier microtube et mélanger par pipetage.
  6. Incuber le mélange pendant 10-15 minutes à température ambiante. Après incubation, on ajoute doucement goutte à goutte le mélange de transfection dans les puits au-dessus du milieu NSC (500 pl / puits).
  7. Changer le milieu après la transfection 24 h à contrôler milieu (milieu NSC) ou du milieu de privation (500 pl / puits).
  8. Fixer les cellules en changeant le milieu à 4% PFA après 24 h et effectuer une immunocoloration; typiquement, jusqu'à une efficacité de transfection de 10% est obtenue en utilisant ce protocole.

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Résultats

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Après étalement des cellules de la SVZ dans un milieu NSC pendant une semaine, neurosphères flottants ont été observés (figure 2A). Les dimensions des sphères varient entre 50 et 200 um. Examiner si les sphères ont été dérivées de cellules souches / progénitrices neurales, les neurosphères ont été étalées sur PLL- et laminine revêtement en milieu NSC lamelles pendant 2 jours. Ils ont ensuite été immunocoloration contre le marqueur souches / cellules progénitrices neurale...

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Discussion

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Nous décrivons ici une méthode pour générer et maintenir des cultures de neurosphères de SVZ de souris adulte. Quelques points pertinents en ce qui concerne les cultures sont les suivantes. Tout d'abord, les dimensions des sphères sont généralement entre 50-200 um. Dans notre expérience, quand un Neurosphère obtient plus de 300 m de diamètre, a été manqué le meilleur moment pour repiquage. Ces grandes sphères contiennent des cellules mortes dans le noyau. En second lieu, comme neurosphères sont couramment utilisés p...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le travail dans le laboratoire de S.M. est financé par des subventions de recrutement du CPRIT (R1220) et du NIH (1R01GM113023-01).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Verre de protection rond de 12 mmFisherbrand12-545-80  ;
Assiette 24 puitsFalcon353047
4 % de paraformaldéhyde (PFA)Affymetrix19943
Tube de 50 mLFalcon352098
95 mm x 15 mm boîte de Pétri, couvercle coulissantFisherbrandFB0875714G10 cm Plat
70 µ ; Filtre à cellules mFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey anti Rabbit, Alexa 488 anticorps secondaire
Arl13B, Clone N295B/66NeuromabAB_11000053
B-27 Supplement (50X),ThermoFisher Scientific17504001B27
Centrifugeusesans sérumThermo scientificST 40R
Flacon cryogéniqueCorning430488
DAPISigmaD9542-10MG
Désoxyribonucléase I à partir de pancre bovinSigmaD5025-15KUDnase I
Diméthyl sulfoxydeSigmaD8418-100MLDMSO
Moules à échantillons en vinyle jetablesSakura Tissue-Tek Cryomold456510 mm x 10 mm x 5 mm
Dulbecco’s Saline tamponnée au phosphate 10X, modifiée, sans chlorure de calcium ni chlorure de magnésium, liquide, stérile-filtrée, adaptée à la culture cellulaireSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5 Pincescience fine11254-20
Sérum fœtal bovin (FBS)SigmaF9026-500ML
Fluoromount-G solutionSouthern Biotech0100-01solution de montage
GFAPDAKOZ0334
Anticorps secondaire anti souris IgG1 de chèvre, conjugué Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA-21127IgG1 de chèvre, Alexa 555 anticorps secondaire
de chèvre anti souris IgG2a Anticorps secondaire, conjugué Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA-21137IgG2a de souris Alexa 555, Alexa 555 anticorps secondaire
Gpr161fait maisonN/A
humain bFGFSigmaF0291
FGF hémocytomètreHausser Scientific0,100 mm de profondeuramélioré neubauer
IsothesiaHenry ScheinNDC 11695-0500-2Isofluorane
Laminin d’Engelbreth-Holm-Swarm Sarcome membrane basaleSigmaL2020Laminine
L-Glutamine (200 mM)SigmaG7513
Lipofectamine 3000 Réactif de transfectionThermoFisher ScientificL3000
M. FrostyNalgene  ;5100-0036
Supplément N-2 (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
Milieu neurobasalGibco21103-049
Sérum d’âne normalJackson ImmunoResearch017-000-121
Composé OCTSakura Tissue-Tek4583OCT
Pénicilline-StreptomycineSigmaP4333-100ML
Poly-L-Lysine (PLL)SigmaP4707
Protéine EGF humaine recombinante, systèmes CFR et D236-EG-200
CiseauxOutils de sciences fines14060-10
Superfrost plusde microscope Fisher scientific12-550-15lames
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Solution trypsine-EDTA (10X)SigmaT4174-100Trypsine
COSTAR Plaque 6 puits, avec couvercle Fond plat Surface de fixation ultra-faible Polystyrène, stérileCorning3471Liaison ultra-faible Plaque 6 puits
&beta ;-tubuline IIICovanceMMS-435PTUJ1
à EGF lame

Références

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