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Article de méthode

Bioluminescence et proche infrarouge Imaging de névrite optique et inflammation du cerveau dans le modèle EAE de la sclérose en plaques chez des souris

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DOI :

10.3791/55321

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1 mars 2017

 , 
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

Dans cet article

Résumé

Nous montrons une technique de bioluminescence direct in vivo et l' imagerie dans l'infrarouge proche de la névrite optique et l' encéphalite dans le modèle expérimental d' encéphalomyélite auto - immune (EAE) pour la sclérose en plaques chez les souris SJL / J.

Résumé

Experimental encéphalomyélite auto-immune (EAE) dans SJL / J souris est un modèle pour la sclérose en plaques récurrente-rémittente (RRMS). scores EAE cliniques décrivant moteur déficits de fonction sont des lectures de base de l'inflammation de la médiation immunitaire de la moelle épinière. Toutefois, les scores et le poids corporel ne permettent pas une évaluation in vivo de l' inflammation du cerveau et de la névrite optique. Ce dernier est une manifestation précoce et fréquente dans environ 2/3 des patients atteints de sclérose en plaques. Ici, nous montrons des méthodes de bioluminescence et de l' imagerie en direct proche infrarouge pour évaluer EAE a évoqué la névrite optique, une inflammation du cerveau, et barrière hémato-encéphalique (BHE) perturbation chez les souris vivant en utilisant un système d'imagerie in vivo dans. Un substrat de bioluminescence activée par des oxydases a montré principalement la névrite optique. Le signal était spécifique et a permis la visualisation des effets des médicaments et des cours de temps de la maladie, qui en parallèle les scores cliniques. nanoparticules fluorescentes pégylés qui sont restés dans le vasculature pendant de longues périodes de temps ont été utilisés pour évaluer l'intégrité du Bureau. Proche infrarouge imagerie a révélé une fuite BBB au sommet de la maladie. Le signal est le plus fort autour des yeux. Un substrat proche de l'infrarouge pour métalloprotéinases de matrice a été utilisé pour évaluer l'inflammation de l'EAE évoquée. Auto-fluorescence interféré avec le signal, ce qui nécessite déconvolution spectrale pour la quantification. Dans l'ensemble, l'imagerie par bioluminescence est une méthode fiable pour évaluer la névrite optique et de médicaments effets EAE-associé et était supérieur aux techniques du proche infrarouge en termes de spécificité du signal, la robustesse, la facilité de quantification, et le coût.

Introduction

La sclérose en plaques est causée par l’attaque auto-immune et la destruction de la gaine de myéline dans le cerveau et la moelle épinière1. Avec une incidence globale d’environ 3,6 cas pour 100 000 personnes par an chez les femmes et d’environ 2,0 chez les hommes, la SEP est la deuxième cause la plus fréquente d’invalidité neurologique chez les jeunes adultes, après les blessures traumatiques 2,3. La pathologie de la maladie est favorisée par des facteurs génétiques et environnementaux 4 mais n’est pas encore complètement comprise. Les lymphocytes T autoréactifs pénètrent dans le système nerveux central et déclenchent une cascade inflammatoire qui provoque des infiltrats focaux dans la substance blanche du cerveau, de la moelle épinière et du nerf optique. Dans la plupart des cas, ces infiltrats sont initialement réversibles, mais la persistance augmente avec le nombre de rechutes. Un certain nombre de modèles de rongeurs ont été développés pour étudier la pathologie de la maladie. L’EAE récurrente-rémittente chez les souris SJL/J et l’EAE primaire-progressive chez les souris C57BL6 sont les modèles les plus populaires.

Les scores cliniques de l’EAE, qui décrivent l’étendue des déficits de la fonction motrice, et le poids corporel sont les étalons de référence pour évaluer la gravité de l’EAE. Ces signes cliniques concordent avec l’étendue de l’infiltration des cellules immunitaires et de la destruction de la myéline dans la moelle épinière et prédisent modérément l’efficacité du traitement médicamenteux chez l’homme5. Cependant, ces signes reflètent principalement la destruction des faisceaux de fibres ventrales dans la moelle épinière. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode simple, non invasive, fiable et reproductible pour évaluer l’infiltration cérébrale in vivo et la névrite optique chez les souris vivantes.

L’imagerie in vivo est en accord avec les 3 principes « R » de Russel et Burch (1959), qui revendiquent un placement R, une éducation Ret une finesse Rdes expériences sur les animaux6, car l’imagerie augmente les lectures d’un animal à plusieurs points temporels et permet une réduction des nombres globaux. À l’heure actuelle, l’inflammation ou l’état de la myéline est principalement évalué ex vivo par immunohistochimie, analyse FACS ou différentes méthodes de biologie moléculaire 7, toutes nécessitant l’euthanasie de souris à des moments précis.

Un certain nombre de sondes de système d’imagerie in vivo ont été développées pour évaluer l’inflammation de la peau, des articulations et du système vasculaire. Les techniques reposent sur l’activation de substrats fluorescents bioluminescents ou dans le proche infrarouge par des peroxydases tissulaires, notamment la myéloperoxydase (MPO), les métalloprotéinases matricielles (MMPs)8, et les cathepsines9 ou cyclooxygénase2. Ces sondes ont été principalement validées dans des modèles d’arthrite ou d’athérosclérose9,10. Une sonde sensible à la cathepsine a également été utilisée pour l’imagerie tomographique moléculaire par fluorescence de EAE11. Les MMP, en particulier MMP2 et MMP9, contribuent à la perturbation de la BHE médiée par la protéase dans l’EAE et sont régulées à la hausse aux sites d’infiltration des cellules immunitaires12, ce qui suggère que ces sondes peuvent être utiles pour l’imagerie de l’EAE. Il en va de même pour les sondes à base de peroxydase ou de cathepsine. Techniquement, l’imagerie de l’inflammation dans le cerveau ou la moelle épinière est beaucoup plus difficile car le crâne ou la colonne vertébrale absorbent les signaux bioluminescents et proches infrarouges.

En plus des indicateurs d’inflammation, des produits chimiques fluorescents ont été décrits, qui se lient spécifiquement à la myéline et peuvent permettre de quantifier la myélinisation13. Une sonde fluorescente proche infrarouge, l’iodure de 3,3'-diéthylthiatricarbocyanine (DBT), s’est avérée se lier spécifiquement aux fibres myélinisées et a été validée en tant qu’outil quantitatif dans des modèles murins de défauts de myélinisation primaires et dans la démyélinisation évoquée par la cuprizone14. Dans l’EAE, le signal DBT était plutôt augmenté, reflétant l’inflammation des fibres de myéline5.

Une autre caractéristique de l’EAE et de la SEP est la dégradation de la BHE, entraînant une augmentation de la perméabilité vasculaire et l’extravasation des cellules sanguines, du liquide extracellulaire et des macromolécules dans le parenchyme du SNC. Cela peut entraîner un œdème, une inflammation, des lésions oligodendrocytaires et, éventuellement, une démyélinisation15,16. Par conséquent, la visualisation de la fuite de la BHE à l’aide de sondes fluorescentes, telles que l’albumine sérique bovine marquée au fluorochrome5, qui se distribuent normalement très lentement du sang aux tissus, peut être utile pour évaluer l’EAE.

Dans la présente étude, nous avons évalué l’utilité de différentes sondes dans l’EAE et montré la procédure pour la technique bioluminescente la plus fiable et la plus robuste. De plus, nous discutons des avantages et des inconvénients des sondes dans le proche infrarouge pour l’activité MMP et l’intégrité de la BHE.

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Protocole

1. EAE Induction dans SJL / J Souris

  1. Souris
    1. Utilisez 11 semaines d'âge SJL femelle / souris J et leur permettre de se habituent à la salle expérimentale pendant environ 7 jours. Utilisez n = 10 souris par groupe.
    2. Pour l'évaluation des effets des médicaments, administrer le médicament et le placebo pour le groupe de contrôle en continu via l'eau de boisson ou par des boulettes de nourriture à partir de 3 ou 5 jours après l'immunisation (n = 10 par groupe). Durant le pic de la maladie, administrer un médicament ou un placebo avec du lait ou 3% de flocons de maïs sucre eau trempés.
  2. Matériel de vaccination
    1. Utiliser un kit d'induction d'EAE comprenant l'antigène (peptide de la protéine protéolipide, PLP139-151, 1 mg / émulsion ml) dans une emulsion avec de l'adjuvant complet de Freund (CFA, Mycobacterium tuberculosis tué par la chaleur H37 Ra) et de 2 flacons (5 ug chacun) de la toxine de la coqueluche lyophilisée (PTX).
    2. Dissoudre la PTX (2 pg / ml) dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS; par exemple, </ Em> ajouter 1,5 ml de PBS à chaque tube PTX, bien mélanger, retirer avec la même pointe de pipette, et ajouter à 1 ml de PBS dans un tube de 50 ml); bien mélanger.
  3. Immunisation
    1. Injecter PLP / CFA voie sous-cutanée en 2 parties, chaque 100 pi, à la fois à la base de la queue. Ne pas injecter dans le dos du cou, car toutes les réactions immunitaires de la peau dans la partie supérieure du dos ou du cou perturberont imagerie de la tête et de la moelle épinière.
    2. Injecter 100 ul de PTX intrapéritonéale (ip), deux fois par souris, le 1 premier - 2 h après l'immunisation et la seconde à 24 h.
    3. Pour les souris témoins, injecter CFA sans PLP (2 portions de 100 pi) plus PTX sans PLP.
  4. Souris manipulation après la vaccination
    1. Peser les souris tous les jours jusqu'au jour 7, puis peser tous les jours.
      REMARQUE: Les souris perdent environ 1 - 2 g de poids corporel au cours de l'EAE. La baisse marque le début de l'EAE.
    2. Évaluer les symptômes cliniques par jour du jour 7 accordment aux systèmes de notation standard (c. -à- score 0: pas de changements évidents dans les fonctions motrices; marquer 0,5: la paralysie distale de la queue; score 1: queue paralysie complète; marquer 1.5: parésie légère d'un ou les deux pattes de derrière; score 2: parésie sévère des pattes postérieures; marquer 2.5: paralysie complète d'une jambe de derrière, score 3: paralysie complète des deux pattes postérieures; marquer 3.5:. paralysie complète des pattes postérieures et parésie d'une jambe avant euthanasier les souris avec des scores de 3,5 ou plus pour > 12 heures.
  5. EAE cours et le temps de l' imagerie
    1. Effectuer la première imagerie à l'apparition de la maladie, lorsque les souris atteignent des scores> 1, qui se produiront autour du jour 10-12 après la vaccination.
    2. Effectuer la deuxième imagerie au sommet, qui sera atteint 1 ou 2 jours après les premiers symptômes se développent et va durer pendant 1 - 3 jours.
      NOTE: Par la suite, les souris se rétablir complètement dans les 7 à 10 jours. Imaging pendant les intervalles peut encore montrer des fuites vasculaires,mais les indicateurs d'inflammation doivent être négatifs.

2. Bioluminescent et imagerie proche infrarouge de névrite optique et inflammation du cerveau

  1. La configuration du système d'imagerie
    1. Effectuer l'imagerie in vivo avec tout équipement qui permet l'analyse de bioluminescence et de signaux dans le proche infrarouge.
    2. Garder la souris sous 2 à 2,5% d'isoflurane anesthésie pendant toutes les procédures d'imagerie.
    3. Position un ou deux souris à côté de l'autre dans l'appareil en utilisant les approvisionnements en gaz du milieu. Positionner la colonne vertébrale supérieure dans le centre.
    4. Utilisez deux souris simultanément, un par groupe, pour l'évaluation des effets des médicaments pour comparer des paires. Ceci est important pour l'imagerie bioluminescente.
    5. Protégez le site de la vaccination avec un chiffon noir et prendre une image photographique et de référence pour évaluer le positionnement correct de la souris / souris. Utiliser la mise au point B avec une distance de 6,5 cm à l'appareil pour toutes les images.
  2. Injection et imagerie de la sonde d'inflammation bioluminescente
    1. Utilisez les paramètres in vivo dans des systèmes d'imagerie: Epi-BLI, Em filtre ouvert, Ex bloc de filtre, fstop 1, binning 8, concentrer B = 6,5 cm, ad exposition 120 s; prendre une image de référence.
    2. Injecter 100 ul IP du réactif chimioluminescent prêt à l'emploi (40 mg / ml). Bien mélanger avant de remplir la seringue.
    3. Capturer des images de bioluminescence 5, 10 et 15 min après l'injection. Le cours du temps du pic bioluminescente diffère entre les animaux.
      NOTE: Le pic se produira 5-10 min après l'injection; une baisse à 15 min indique qu'aucune autre images sont nécessaires. Utilisez des paires de souris des groupes de contrôle et de traitement pour éliminer les biais mineures dues à différents cours à temps.
    4. Remplissez les descriptions pertinentes à l'expérience. Observer une boîte de dialogue pop-up automatiquement; il comprend des informations, telles que la souche de la souris, le sexe, le point de temps, le temps d'injection de la sonde, le groupe, etc. Enregistrer les fichiers dans tous les odossier ne; ils auront des balises de temps et toutes les descriptions.
  3. Injection et imagerie de nanoparticules fluorescentes proche infrarouge pour l' intégrité BBB
    1. Utilisez l'imagerie à épifluorescence proche infrarouge dans le B-focus (distance: 6,5 cm). Les maxima d'excitation / émission des nanoparticules fluorescentes pégylés sont 675/690 nm. Capturez deux images à différentes longueurs d'onde, à Ex640 / EM700 et Ex675 / Em720; utiliser un 2-s exposition, binning 8 et fstop 2. Prenez une image de référence.
    2. Injecter 70 ul de nanoparticules fluorescentes infrarouges pégylés iv à travers la veine de la queue et imaginer la souris 3 h et 24 h après l'injection en utilisant les paramètres ci-dessus. Mélangez bien la solution avant de remplir la seringue.
    3. Injecter chlorure de sodium à 0,9% chez les souris témoins, qui seront nécessaires pour évaluer la spécificité du signal.
  4. Injection et imagerie de la sonde proche infrarouge fluorescent pour l' activité MMP
    1. Raser ou depilate la tête et upper région de la colonne vertébrale prudemment un jour avant de prendre l'image de référence. La peau ne doit pas être blessé.
    2. Utilisez l'imagerie à épifluorescence proche infrarouge dans le B-focus (distance: 6,5 cm). Les maxima d'excitation / émission de la sonde activable MMP sont 680/700 nm. Capturez deux images à différentes longueurs d'onde, à Ex640 / EM700 et Ex675 / Em720; utiliser un-s 1 exposition, binning 8 et fstop 2. Prenez une image de référence.
    3. Ajouter 200 ul de 1 x PBS dans le tube 1,5 ml de la solution prête à l'emploi (20 nmol / 1,5 ml dans 1 x PBS), de sorte qu'il sera suffisant pour 10 souris; bien mélanger avant de remplir la seringue.
      REMARQUE: Le volume disponible ne tient pas compte du fait que peu de volume est perdue au cours du remplissage de la seringue et l'injection.
    4. Injecter 150 ul de la iv sonde à travers la veine de la queue 24 h avant l'imagerie. Injecter du PBS seulement chez les animaux de contrôle pour évaluer la spécificité du signal.
    5. A 24 h après l'injection, prendre des images Epi-FL au moins deux longueurs d'onde, Ex640 / EM700 et Ex 675 / EM720, avec les paramètres expliqué ci-dessus (1-s exposition, mise au point B, binning 8 et fstop 2).
      NOTE: L'utilisation de deux longueurs d'onde permet de déconvolution spectrale en soustrayant le signal non spécifique.

3. Analyses image

  1. L' analyse par bioluminescence (BLI)
    1. Double-cliquez sur le logiciel pour l'ouvrir.
    2. Dans la barre de menu supérieure, cliquez sur l'icône du navigateur de fichier, allez dans le répertoire du dossier de l'expérience, et sélectionnez - le; cela va ouvrir tous les fichiers dans le dossier dans une table.
    3. Configurer les colonnes montrant les descriptions pertinentes à l'expérience.
    4. Pour le contrôle de la qualité, double-cliquez sur un fichier d'une souris non-répondeur sans symptômes de l'EAE et / ou une souris naïve pour vérifier la spécificité des signaux EAE.
      NOTE: Il devrait y avoir aucun signal dans des souris naïves et le signal minimal chez les souris non-répondeurs.
      1. Vérifiez l'image de référence avant l'injection de la prosoit pour chaque souris en tant que contrôle supplémentaire de la spécificité du signal; il devrait être négatif.
    5. Pour sélectionner une image, double-cliquez sur le premier fichier de la première souris EAE et vérifier l'intensité bioluminescente (LUT gamme de bar) et la localisation. Vérifiez toutes les images une par une. Fermez le fichier avec l'intensité la plus faible pour chaque souris (ie, garder 2 sur 3 images pour chaque souris).
    6. l'ajustement et l'exportation image
      1. Double-cliquez sur le premier fichier à quantifier. Observez une nouvelle fenêtre pop up. Sous "options" (menu supérieur), personnaliser les étiquettes à afficher dans chaque image.
      2. Dans la palette d'outils à droite, aller à "Réglage de l'image." Par défaut, les intensités minimales et maximales sont réglées sur "auto" et affichés dans rainbow pseudocolor. Sélectionnez "manuel" pour modifier les paramètres si nécessaire.
        NOTE: Par exemple, toutes les images exportées peuvent avoir des barres de LUT identiques (minima et maxima identiques) pour être facilement comparables.L'ajustement des minima et maxima n'a aucun impact sur les résultats quantitatifs.
      3. Cliquez sur l'image à l'exportation, sélectionnez png, le répertoire et un nom d'image
    7. Quantification des régions d'intérêt (ROI)
      1. Aller à la "ROI" outil dans la palette d'outils. Sélectionnez la méthode de ROI (cercle, rectangulaire, auto ou mains libres) et le nombre de ROIs. Observez la fenêtre de ROI pop up dans la fenêtre d'image.
      2. Avec la souris, ajuster la taille et la position. Utilisez des seuils de ROI identiques pour toutes les images si l'outil d'auto-ROI est utilisé. Utilisez des zones identiques pour toutes les images si tailles et positions ROI sont définies manuellement (par exemple, ROIs circulaires).
      3. Cliquez sur "mesurer RO.I. Observer une nouvelle fenêtre pop - up. Personnalisez les colonnes (par exemple, le nom du fichier, le nombre d'animaux, le groupe, l' expérience, la superficie, les comptages totaux, comptes moyens, le nombre de SD, min et max Chiffres, région, temps le point, le temps d'injection de la sonde, etc.). Enregistrer les paramètres personnalisés. Lorsque ready, tout sélectionner (Ctrl + A), et copier et coller le tableau dans une feuille de calcul.
      4. Exporter l'image comme png avec les ROIs en place. Enregistrer et fermer le fichier image.
    8. Répétez la procédure (étapes 3.1.6 - 3.1.7) pour tous les fichiers d'image qui doivent être quantifiés. Copiez tous les quantifications de retour sur investissement dans le tableur.
      NOTE: Ici, les résultats peuvent être triés par groupe, point de temps, etc. et analysées statistiquement. Utilisez les comptes totaux de signaux de bioluminescence dans le ROIs pour les analyses statistiques.
  2. (NIR) analyse infrarouge Près de nanoparticules fluorescentes
    1. Utilisation des commandes dans le logiciel, régler le seuil de l'image.
      NOTE: Cela n'a aucun impact sur le résultat quantitatif.
    2. comparer visuellement les images capturées à Ex / Em 675/720 et Ex / Em 640/700 pour évaluer la spécificité du signal.
    3. Utilisez les images capturées à Ex / Em 675/720 pour l'analyse quantitative (maximum d'excitation: 680 nm). Définir ROIs, pour lequel l'outil d'auto-ROI peut être utilisé. Réglez le seuil d'auto-ROI et de l'utiliser pour toutes les images. Quantifier l'efficacité radiante totale dans ROIs (voir étape 3.1).
  3. (NIR) analyse-proche infrarouge de la sonde sensible à une protéase
    1. Utilisation des commandes de logiciels, régler le seuil de l'image.
      NOTE: Cela n'a aucun impact sur le résultat quantitatif. Effectuer unmixing spectrale de l'auto-fluorescence. L'outil unmixing est mis en œuvre Living Image. L'auto-unmixing utilise Ex / Em 640/700 comme spécifique et 675/720 en tant que l'image de l'auto-fluorescence.
    2. Sélectionnez l'image unmixed et définir les ROIs, comme décrit ci-dessus. Utilisez l'efficacité rayonnante totale dans ROIs pour des analyses quantitatives et statistiques.

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Résultats

Cours Temps de bioluminescence de névrite optique

Le signal de bioluminescence de la sonde de l'inflammation a été la plus forte autour des yeux et est produite exclusivement chez des souris EAE avec névrite optique. Un signal a été dans ni les souris non-EAE, ni les souris non injectées avec la sonde de l'inflammation. Le signal a disparu lorsque la souris récupéré. Par conséquent, le signal est spéci...

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Discussion

La présente vidéo montre les techniques de la bioluminescence et la fluorescence dans le proche infrarouge dans l' imagerie in vivo de l' EAE chez les souris SJL / J. Nous montrons que l'imagerie par bioluminescence à l'aide d'une sonde sensible à l'inflammation montre principalement la névrite optique et la quantification en accord avec l'évaluation clinique de l'EAE et la sévérité des effets des médicaments. Cependant, le procédé d'imagerie par bioluminescence n...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) et le programme de financement de la recherche "Landesoffensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) de l'Etat de Hesse, Centre de recherche pour la médecine translationnelle et Pharmacologie TMP et Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS), Groupe de formation en recherche translationnelle innovation Research - Pharma (TRIP).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AngioSpark-680Perkin Elmer, Inc., Waltham, États-UnisNEV10149Sonde d’imagerie, nanoparticules pégylées, utile pour l’imagerie de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique
MMP-sense 680Perkin Elmer, Inc., Waltham, États-UnisNEV10126Sonde d’imagerie, activable par des métalloprotéinases matricielles, utile pour l’imagerie de l’inflammation
Sonde d’inflammation XenoLight RediJectPerkin Elmer, Inc., Waltham, États-Unis760535Sonde d’imagerie, activable par les oxydases, utile pour l’imagerie de l’inflammation
PLP139-151/EFC émulsionHooke Labs, St Lawrence, MAEK-0123Kit d’induction EAE
Toxine de coquelucheHooke Labs, St Lawrence, MAEK-0123Kit d’induction
EAE IVIS Lumina SpectrumPerkin Elmer, Inc., Waltham, USASystème de bioluminescence et d’imagerie infrarouge
LivingImage 4.5 software  ;Perkin Elmer, Inc., Waltham, États-UnisCLS136334Logiciel d’analyse IVIS
IsofluraneAbbott Labs, Illinois,États-Unis 26675-46-7Anesthésique

Références

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Réimpressions et autorisations

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Bioluminescence et proche infrarouge Imaging de névrite optique et inflammation du cerveau dans le modèle EAE de la sclérose en plaques chez des souris
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