La perfusion de canaux pancréatiques est une technique importante qui peut permettre le traçage de la lignée, l’introduction de gènes et le ciblage spécifique à la lignée cellulaire. Une technique de perfusion de canal pancréatique pour l’administration de médicaments et de virus aux cellules pancréatiques est présentée ici.
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Article de méthode
Perfusion de canal pancréatique: une méthode efficace et sélective d’administration de médicaments et de virus
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le pancréas est un organe bifonctionnel avec des composants endocriniens et exocriniens. Un certain nombre de pathologies peuvent affecter le pancréas, y compris le diabète, la pancréatite et le cancer du pancréas. Ces trois maladies marquent des domaines d’étude actifs, non seulement pour développer un traitement immédiat, mais aussi pour mieux comprendre leur physiopathologie. Il existe peu d’outils pour approfondir ces domaines d’étude. La perfusion de canaux pancréatiques est une technique importante qui peut permettre le traçage de la lignée, l’introduction de gènes et le ciblage spécifique à la lignée cellulaire. La technique nécessite la dissection complexe de la deuxième partie du duodénum et de l’ampoule, suivie de l’occlusion du canal biliaire et de la canulation du canal pancréatique. Bien que la technique soit techniquement difficile au début, les applications sont myriades. L’ambiguïté des détails de la procédure entre les groupes a mis en évidence la nécessité d’un protocole standard. Ce travail décrit l’expression d’une protéine fluorescente verte (GFP) dans le pancréas après la perfusion par canal pancréatique d’un vecteur viral exprimant la GFP par rapport à une chirurgie simulée. La perfusion et donc l’expression est spécifique au pancréas, sans expression présente dans aucun autre type de tissu.
Introduction
Le pancréas est un organe bifonctionnel, avec des composants endocriniens et exocrines. Un certain nombre de pathologies peuvent affecter le pancréas, y compris le diabète, la pancréatite et le cancer du pancréas1. Ces trois maladies marquent des domaines d’étude actifs, non seulement pour développer un traitement immédiat, mais aussi pour mieux comprendre leur physiopathologie.
Une méthode d’administration thérapeutique ciblée serait bénéfique. Nous avons développé une technique de perfusion de canal pancréatique qui est une méthode efficace et sélective pour l’administration de médicaments et de virus aux cellules pancréatiques. Dans ce modèle, le canal pancréatique est canulé sélectivement et le canal biliaire commun est obstrué, ce qui permet une livraison exclusive au pancréas.
Cette technique peut permettre le traçage de la lignée de types cellulaires spécifiques pour élucider davantage les voies de développement importantes pour le développement pancréatique et la pathologie2,3. Différents promoteurs dans les vecteurs viraux permettent le ciblage spécifique des lignées cellulaires et l’introduction de gènes dans ces lignées cellulaires4,5. Ce travail démontre l’expression d’une protéine fluorescente verte (GFP) dans le pancréas après la perfusion par canal pancréatique d’un vecteur viral exprimant la GFP par rapport à une chirurgie simulée.
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Protocole
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité de recherche et de soins des animaux de l’Hôpital pour enfants de Pittsburgh et le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh.
1. Préparation préopératoire
- Administrer l’isoflurane inhalé (1 à 3 % pour l’entretien et jusqu’à 5 % pour l’induction) par l’intermédiaire d’un cône nasal à un niveau anesthésique approprié. Surveiller l’adéquation de l’anesthésie en pinçant les orteils avec une pince. L’absence de réponse est considérée comme adéquate et assurez-vous de ne pas trop meméder, car une dépression respiratoire peut survenir.
- Placez l’animal sur le dos sur la scène du microscope à dissection, avec l’abdomen centré en vue de l’objectif. Immobilisez l’animal avec du ruban chirurgical. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de l’animal pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Appliquez une couche lisse et épaisse de crème dépilatoire et laissez-la en place pendant 3 min. Vérifiez une petite zone pour l’épilation. Essuyez doucement la crème et les cheveux avec de la gaze imbibée à 70% d’éthanol.
- Nettoyez et désinfectez l’abdomen de l’animal en l’essuyant avec une gaze imbibée d’éthanol à 70% suivie d’une gaze imbibée de bétadine. Maintenir des conditions stériles tout au long de l’intervention chirurgicale.
2. Exposition adéquate
- Faites une incision médiane dans la peau du processus xyphoïde à l’ombilic à l’aide d’un scalpel. Soulevez le péritoine avec des pinces Adson et faites un petit trou dans la ligne médiane à l’aide de ciseaux.
- Étendez l’incision péritonéale jusqu’à la longueur de l’incision cutanée, en prenant soin de rester sur la ligne médiane (linea alba).
REMARQUE: Cela produira une laparotomie abdominale de la ligne médiane supérieure. - Élevez le foie avec des rétracteurs contondants pour exposer le canal biliaire commun. Serrez le canal biliaire commun avec une pince vasculaire de bouledogue incurvée.
REMARQUE: Cette manœuvre empêche la perfusion indésirable dans le foie.
3. Identification de la papille pancréatique et de la duodénotomie
- Identifiez le duodénum et, avec une pince Arruga, rétractez-le caudalement pour afficher la papille.
REMARQUE: La papille est une tache blanche sur la surface antérieure de la deuxième partie du duodénum. - Rétracter le duodénum caudalement, permettant l’identification du cours du canal pancréatique. Avec une aiguille de calibre 301/2, perforez tangentiellement la paroi du duodénum, directement en face de la papille.
REMARQUE: L’aiguille doit suivre le même angle que le conduit lorsqu’elle pénètre dans le duodénum.
4. Infusion.
- Passez le cathéter à travers la duodénotomie créée à l’étape 3.2 jusqu’à ce que le cathéter soit visible dans le conduit. Avancez le cathéter dans le conduit pas plus de 1 cm pour empêcher le contournement des affluents canalaires mineurs.
- Serrez le cathéter en place avec une deuxième pince vasculaire bulldog incurvée. Allumez la pompe et infusez le volume sélectionné. Le volume infusé peut varier de 25 à 250 μL, avec un volume idéal d’environ 150 μL.
- Administrer une injection intrapéritonéale d’environ 1,5 mL de solution saline pour compenser les pertes. Couvrez l’intestin exposé avec une gaze humide pour éviter la dessiccation.
- À la fin de la perfusion, retirez la pince bulldog qui maintenait le cathéter en place. Utilisez la pince bulldog pour retirer doucement le cathéter du canal pancréatique. Relâchez la pince du canal biliaire commun.
- Fermez le péritoine et la peau en une ou deux couches à l’aide d’une suture courante.
REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de fermer la duodénotomie, car elle se scellera toute seule. - Comme analgésie postopératoire, administrer une dose de cétofène à 5 mg / kg pendant la procédure et une le lendemain.
- Remettez la souris dans sa cage sous une lampe chauffante jusqu’à ce qu’elle se rétablisse. Fournissez à la souris de la nourriture et de l’eau ad libitum.
- Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait retrouvé suffisamment de conscience pour maintenir le couché sternal. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d’autres animaux jusqu’à ce qu’il se soit complètement rétabli.
5. Préparation de l’échantillon
- Placez l’animal dans une chambre à dioxyde de carbone ou effectuez une luxation cervicale.
- Récoltez le pancréas, avec la rate, le foie et le duodénum comme témoins. Fixer les tissus dans du paraformaldéhyde pendant la nuit à 4 °C. Cryoprotéger l’échantillon dans du saccharose à 30% pendant la nuit, comme décrit précédemment6.
- Congelez les échantillons par enclenchement. Coupe le tissu à une épaisseur de 6 μm à l’aide d’un microtome. Effectuer l’imagerie sur un microscope avec imagerie par fluorescence, comme décrit précédemment7.
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Résultats
Avec de la pratique et une technique chirurgicale minutieuse, le taux de survie de ces souris devrait être supérieur à 95%. Une semaine après la perfusion, l’effet désiré devrait être évident dans le pancréas. Des souris âgées de 10 à 12 semaines ont été utilisées pour des perfusions de canal pancréatique. Ici, nous utilisons un virus adéno-associé de sérotype 8 (AAV8) avec un promoteur CMV pour exprimer la protéine fluorescente verte (GFP), par rapport à une chirurgie simulée. Les pancré...
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Discussion
Ce travail décrit en détail la méthodologie derrière la perfusion de canal pancréatique, un modèle murin efficace pour l’administration de gènes et d’autres molécules spécifiquement et efficacement au pancréas. L’ambiguïté dans les détails de la procédure entre les différents groupes a mis en évidence la nécessité d’un protocole normalisé8,9,10.
Il y a plusieurs étapes critiques de la procédure, à com...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs n’ont aucune reconnaissance. Le financement a été reçu de la Commission de la fondation de la santé et de la planification familiale de la province du Zhejiang (subvention 20146242) et de la Fondation du Bureau des sciences et de la technologie de Wenzhou (subvention Y20140248).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Souris (25 à 30 g, 8 à 12 semaines) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Éthanol (70 %) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Solution saline stérile | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Équipement | |||
| Produit d’épilation | Nair ou tondeuse | ||
| Tampons de gaze 2 po x 2 po | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Aiguilles (30,5 G et 25 G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 et 305122 | |
| seringue pour Ketofen et Saline | Becton Dicksinson and Co. | ||
| 309657 Seringue pour pompe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Pompe à perfusion | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Cathéter de perfusion | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Pinces Bulldog incurvées (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Porte-aiguille | Roboz | RS-7882 | |
| Ciseaux | Roboz | RS-5982 | |
| Applicateurs à embout de coton | Médecins Ventes et services | 22-9988 | |
| Microscope | |||
| Suture | Owens et Minor | SXMD1B402 |
Références
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
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Réimpressions et autorisations
