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Article de méthode

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

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DOI :

10.3791/55335

⸱

24 février 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

Dans cet article

Résumé

la régénération rétinienne Zebrafish a surtout été étudiée en utilisant des rétines fixes. Cependant, les processus dynamiques tels que la migration nucléaire interkinetic se produisent au cours de la réponse régénérative et nécessitent imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes sous-jacents. Ici, nous décrivons la culture et d'imagerie conditions pour surveiller Interkinetic Migration nucléaire (INM) en temps réel en utilisant la microscopie multiphoton.

Résumé

Un programme de régénération endogène est initiée par Müller glie dans le poisson zèbre adulte (Danio rerio) rétine après une lésion neuronale et la mort. Les gliales Müller ré-entrer dans le cycle cellulaire et produisent des cellules progénitrices neuronales qui subissent les rondes subséquentes de divisions cellulaires et se différencient en types de cellules neuronales perdues. Les deux Müller gliales et cellules progénitrices neuronales noyaux répliquent leur ADN et subissent une mitose dans des endroits distincts de la rétine, soit ils migrent entre la basale couche intérieure nucléaire (INL) et la couche extérieure nucléaire (ONL), respectivement, dans un processus décrit comme Interkinetic migration nucléaire (INM). INM a surtout été étudié dans la rétine en développement. Pour examiner la dynamique de l'INM chez l'adulte régénérant rétine zebrafish en détail, imagerie des cellules vivantes des cellules progénitrices marquées par fluorescence Müller glie / neuronales est nécessaire. Ici, nous fournissons les conditions pour isoler et rétines culture dorsalesde Tg [GFAP: NGFP] zebrafish de mi2004 qui ont été exposés à une lumière intense constante pendant 35 h. Nous montrons également que ces cultures rétiniennes sont viables pour réaliser des expériences d'imagerie en direct des cellules, l' acquisition en continu des images z-stack dans toute l'épaisseur de l'expiant rétinienne jusqu'à 8 h par microscopie multiphoton pour surveiller le comportement migratoire des GFAP: cellules -positifs NGFP . En outre, nous décrivons les détails pour effectuer une analyse post-imagerie pour déterminer la vitesse de l'INM apicale et basale. Pour résumer, nous avons établi des conditions pour étudier la dynamique de l'INM dans un modèle adulte de la régénération neuronale. Cela fera progresser notre compréhension de ce processus cellulaire crucial et nous permettre de déterminer les mécanismes qui contrôlent l'INM.

Introduction

Contrairement aux humains, le poisson zèbre (Danio rerio) présentent une réponse de régénération robuste sur la mort cellulaire des neurones rétiniens 1, 2, 3, 4. Le facteur α de nécrose tumorale, une molécule de signalisation qui est libérée de mourir neurones de la rétine induit Müller glie résidant dans l'basales couche intérieure nucléaire (INL) de la rétine, à proliférer 5 et de produire des cellules souches neuronales qui continuent à proliférer avant de se différencier en cellule neuronale les types qui sont morts 2, 3, 4. Au cours de la phase proliférative de la réaction de régénération, les noyaux des cellules gliales Müller et de leurs cellules progénitrices neuronales dérivées subissent un motif répétitif de migration en phase avec le cycle cellulaire (Interkinetic migration nucléaire, INM) 6 > 7. Nuclei positionné dans le INL basale répliquer leur ADN avant de migrer vers la couche externe nucléaire (ONL) où ils se divisent avant les noyaux résultant retournent basally à l'INL. Ce processus a été décrit pour la première au cours du développement neuroépithélial utilisant des méthodes histologiques, alors que les approches d'imagerie en direct des cellules plus tard confirmé l'interprétation par Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Les deux approches d'imagerie histochimiques et des cellules vivantes ont été utilisées pour déterminer les mécanismes sous - jacents INM et sa fonction dans le développement neuroepithelia y compris la rétine 9, 11, 12, 13. Cependant, les mécanismes régissant INM chez l'adulte régénérant rétine n'a pas été étudiée en profondeurxref "> 6, 7. imagerie des cellules vivantes sera une approche précieuse pour faire progresser notre connaissance des voies de signalisation qui contrôlent l' INM chez l'adulte rétine régénération.

Jusqu'à récemment, l' imagerie des cellules vivantes de l' INM dans la rétine est limitée soit à des embryons de poisson zèbre vivants ou embryon de poulet ou de la souris postnatale explants rétiniens 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Alors que explants rétiniens provenant d' animaux adultes d'une variété d'espèces , y compris la souris, le rat et le poisson zèbre ont été utilisés pour la cellule différente des approches biologiques 17, 18, 19, 20, des expériences d'imagerie des cellules vivantes en utilisant des explants rétiniens have été limité à de brèves périodes de temps et n'ont pas été exécutées en continu pendant plusieurs heures 21, 22. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la culture adulte rétines poisson zèbre lumière endommagée pour effectuer des expériences d'imagerie des cellules vivantes INM de surveillance utilisant la microscopie multi-photon 6. Approches d'imagerie en direct des cellules sont avantageuses par rapport aux méthodes immunohistochimiques lors d' enquêtes sur les mécanismes de contrôle de l' INM, que la dynamique de l' INM, par exemple, les vitesses peuvent être affectées plutôt que l'emplacement de la mitose, ce qui pourrait potentiellement pas être détectée en utilisant immunocytochimie.

À l'avenir, cette méthode a aussi le potentiel d'être modifié pour étudier d'autres processus dynamiques au cours de la régénération de la rétine, comme la phagocytose de mourir photorécepteurs par Müller glie ou le comportement de la microglie.

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Protocole

Note: Zebrafish ont été soulevées et maintenu dans l'établissement Notre Dame Zebrafish dans le Freimann Life Sciences Center. Les méthodes décrites dans ce manuscrit sont approuvés par l'Université de Notre Dame de protection des animaux et l'utilisation Comité et sont en conformité avec la déclaration de l'utilisation des animaux dans la recherche de la vision par l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie.

1. Solutions

  1. Préparer éthanol à 70% pour stériliser la hotte de culture tissulaire et de tout équipement / des réactifs qui sont transférés dans la hotte de culture tissulaire.
  2. Ajouter 2 ml de 2-phénoxyéthanol à 1 L d'eau du système (1: 500 2-phénoxyéthanol).
  3. Préparer 0,1 mM NaHCO3, pH 8,0. Utiliser une seringue de 10 ml et un filtre de taille de pore seringue de 0,2 pm pour stériliser la solution dans une hotte de culture tissulaire stérile.
    REMARQUE: NaHCO 3 est utilisé pour propager efficacement l'adhésif et le tissu cellulaire à travers la surface de la lamelle couvre - fluorodishes (voirétape 3.2).
  4. Préparer 1,0 M de CaCl2 et 1,0 M de MgCl2. Stériliser avec une seringue de 10 mL et 0,2 um de taille de pore filtre de seringue dans une hotte de culture tissulaire stérile.
  5. Hank's pour préparer une solution saline équilibrée (HBSS), ajouter stérile CaCl2 et MgCl2 stérile à 1 x HBSS sans Ca 2+ / Mg 2+, sans rouge de phénol à une concentration finale de 1 mM chacun. Travailler dans un environnement stérile.
  6. Pour préparer le milieu de culture, mélanger 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) sans rouge de phénol, 25% HBSS contenant CaCl 2 et MgCl 2 (voir section 1.4), 25% de sérum de cheval (HS), 10 unités / ml de pénicilline et 10 pg de streptomycine / ml. Travailler dans un environnement stérile.
    NOTE: Éviter un milieu contenant du rouge de phénol comme il autofluoresces, affectant ainsi les rapports signal de bruit. 23
  7. Préparer 10 ml de 1% à bas point de fusion d'agarose dans 1x MEM sans rouge de phénol. Faire fondre l'agarose / 1 x MEM en utilisant un microWave. Préparer de petits volumes d'agarose (par exemple, 10 ml) et de réchauffage répétitive va changer la concentration en ions due à l' évaporation du fluide.
  8. Avant la mise en culture, stériliser 1,5 microtubes ml par autoclavage.

2. Light-dommages Paradigm

  1. Dark-adaptation
    1. Placez 2 - 3 Tg [GFAP: NGFP] zebrafish de mi2004 (ou autre poisson zèbre transgénique d'intérêt) à 6 - 14 mois dans un environnement dépourvu de lumière pendant 14 jours. Pour plus de détails , voir la référence 2, 6, 24, 25.
  2. Positionner le réservoir contenant 2 - 3 adapté à l' obscurité du poisson zèbre transgénique dans l' eau du système entre deux lampes fluorescentes qui émettent de la lumière de 2800 lux , 2, 6, 24, 25.
  3. Exposer zebrafish à une lumière intense constante pendant 35 h. Au cours de l'exposition à la lumière, assure que la température de l'eau est maintenue entre 31 - 33 ° C.

3. Préparation de la mise en culture (Le jour de l'isolement rétinienne)

  1. En utilisant 70% d' éthanol, stériliser la hotte de culture tissulaire et des composants / des outils qui sont transférés dans la hotte de culture tissulaire (par exemple des flacons contenant du MEM et de la HBSS, pipettes, embouts de pipette stériles, etc.).
  2. Préparation de fluorodishes
    1. Revêtez un FluoroDish pour chaque rétine avec la cellule et de l' adhésif de tissu (voir le tableau des matériaux).
    2. Diluer la colle tissulaire et cellulaire dans 0,1 mM NaHCO 3 à une concentration finale de 70 pg / ml, ajouter 50 ul à chaque FluoroDish et étaler la solution à travers le centre de la FluoroDish avec une pointe de pipette de 200 pi (environ 1 à 1,2 cm de diamètre ).
    3. Incuber les fluorodishes enduits pour les 1 - 3 h à RT; (Alternativement, incuber O / N à 4 ° C).
    4. Retirer la solution et rincer 3 fois avec 500 pi de MEM 1x pour chaque lavage. Pour éviter les fluorodishes enduits de sécher, de les maintenir dans MEM jusqu'à explants rétiniens sont montés.
  3. Préparer un milieu de culture tel que décrit à l'étape 1.6. Le milieu de culture peut être stocké pendant jusqu'à 1 semaine à 4 ° C.

4. Isolement et culture des explants rétiniens

NOTE: Le protocole décrit ci-dessous pour l'isolement de la rétine dorsale, qui est la région de la rétine qui est principalement lésée par la lumière est décrit dommage paradigme. Par conséquent, la prolifération induite par les dommages et l'événement associé de la migration nucléaire interkinetic se produisent dans la rétine dorsale. Toutefois, la procédure d'isolement peut être ajustée pour donner des régions rétiniennes en fonction des exigences spécifiques de la question chercheur / recherche.

  1. Euthanasier une lumière endommagée transgénique zebrafish untemps ta en 1: 500 2-phénoxyéthanol.
  2. Retirer MEM d'un FluoroDish avec une pipette de 1000 pi de sorte que seul un mince film de fluide reste.
  3. Transférer le poisson zèbre sur une serviette en papier sec, retirer l'œil avec une paire de pinces courbe Dumont (pince n ° 5, angle de 45 °) et de le transférer sur le FluoroDish.
  4. L' utilisation d' un stéréomicroscope, orienter l'œil avec l'élève sur la lamelle de l'FluoroDish de sorte que le fond de l'œil avec le nerf optique est visible (figure 1D).
  5. Avec une paire de ciseaux McPherson-Vannas retirer le nerf optique, la coupe près de l'arrière de l'œil. En outre, retirer le tissu conjonctif doublure à l'extérieur de l'œil.
  6. Tenir l'œil entre son nez et le côté temporel avec une paire de # 5 forceps tout en faisant une incision à la tige optique en perçant avec une lame de ciseaux à travers la lame criblée et coupe le long des deux nasales et sur les côtés temporels de l'œil (voir la figure 1E , li segmenténe).
  7. L'utilisation de deux paires de pinces # 5, l'une pour tenir la face dorsale de la rétine et l'autre paire pour séparer la ventrale de la rétine dorsale, tirer le tissu.
    NOTE: Il est conseillé d'orienter la rétine dorsale de telle sorte que la lentille et la couche de cellules ganglionnaires font face à la lamelle couvre-objet alors que la sclérotique est orientée vers le haut.
  8. Retirer la sclérotique de la rétine dorsale avec une paire de pinces # 5, tout en maintenant la lentille qui est relié à la rétine avec une deuxième paire de pinces n ° 5 (figure 1 H, I).
  9. Pour retirer la lentille, utiliser des ciseaux McPherson-Vannas et coupé derrière la lentille sans endommager la rétine (figure 1I, J). Parfois, la lentille se sépare à l'étape 4.7. Dans ce cas, retirez la sclérotique soigneusement avec une pince en tenant la rétine à une arête de coupe avec une deuxième paire de # 5 forceps.
  10. Retirez le vitré tout en retirant la lentille sans endommager la rétine. Aplatir la rétine avec la couche de cellules ganglionnaires face à la lamelledu FluoroDish (figure 1 L, M).
  11. Entourez la rétine avec 10 pi de 1% à bas point de fusion d'agarose et laisser l'agarose solidifier.
  12. Watch que l'agarose liquide ne lève pas la rétine que même une légère élévation pourrait affecter la capacité de se concentrer profondément dans le tissu. Si levage est observée, utiliser une pipette pour enlever agarose. Laissez ensemble d'agarose résiduel avant d'essayer d'ajouter plus.
  13. Répétez l'étape 4.12 à plusieurs reprises avant d'ajouter 1% à bas point de fusion d'agarose pour couvrir la totalité du FluoroDish. Une fois que l'agarose est solidifié, ajouter 1,5 ml du milieu de culture.
  14. Maintenir la culture d'expiant rétinienne dans un environnement de CO 2 / air 5% fixé à 32 ° C pendant environ 12 h pour permettre la rétine de récupérer du stress encouru par la procédure d'isolement. Réglez la température à 32 ° C pour maintenir rétines à la même température que le poisson zèbre lumière traité (voir l'étape 2.3).

5. multiphotonique Microscopie

NOTE: Les expériences réalisées dans ce manuscrit ont été optimisés pour un microscope multiphotonique équipé d'un laser infrarouge (voir le tableau des matériaux), une longue distance objective d'immersion dans l'eau 40X Apo (NA 1,15), un scanner galvanométrique et une chambre d'environnement qui contient un insert de 35 mm pour quatre boîtes de Petri. Les images ont été acquises avec un détecteur non-descanned (R-NDD).

  1. Avant l'imagerie, équilibrer la chambre environnementale pour obtenir une atmosphère de CO2 à 5% / air. Assurez-vous que des boîtes de Pétri vides sont insérés dans le support pour éviter les fuites de gaz dans la chambre.
  2. Allumez le système de microscopie.
  3. Une fois que la chambre de l'environnement est équilibrée, ajouter du liquide d'indice de réfraction sur la longue distance immersion dans l'eau objectif 40X Apo (NA 1,15).
    NOTE: Le liquide d'indice de réfraction ayant des propriétés optiques similaires à l'eau est utilisée pour éviter l'évaporation de l'eau lors de l'imagerie à long terme.
  4. Lieu grippeorodishes avec explants rétiniens dans la chambre. Utilisation de la lumière de fond clair, placez l'échantillon dans le chemin de la lumière et amener la région médiane de la rétine dorsale dans le plan de mise au point.
  5. Utilisez GFP épifluorescence la lumière de se concentrer sur la GFAP: NGFP -positifs Müller glie noyaux (figure 2A, C).
    NOTE: Si explants ne sont pas montés à plat ou d' agarose accumulée sous l'expiant, il sera difficile de se concentrer sur la GFAP: NGFP noyaux -positif ou ils fluorescence faiblement.
    1. Vérifiez si le déplacement vers une autre région dans le même explant rétinienne permettra de surmonter le problème de focalisation. Sinon passer à un explant rétinienne différent.
  6. Dans le logiciel d'acquisition d'images, ouvrez le 'A1 MP GUI », le« TiPad », le« A1 Compact GUI »et les« acquisition »ND fenêtres. Pour l'imagerie multiphotonique, assurez-vous que l'option 'IR NDD' est choisi dans le «A1 Compact GUI».
  7. Dans le 'settinchamp g ', sélectionnez IR-DM pour le 1 er miroir dichroïque et choisissez le filtre passe-bande 525/50 pour acquérir la fluorescence de la GFP.
  8. Allumez le laser IR dans la fenêtre intitulée «A1MP GUI». Il faudra quelques minutes pour que le laser soit prête. Réglez la longueur d'onde de 910 nm pour exciter la fluorescence de la GFP et aligner le laser en cliquant sur le bouton 'alignement automatique »dans la fenêtre' A1 MP GUI.
  9. Assurez-vous que salle et d'équipement lumières sont éteintes ou recouvertes avant d'ouvrir l'obturateur dans le «A1 MP GUI" pour éviter la surexposition du tube photomultiplicateur. Pour réduire les niveaux de bruit, loger le microscope dans un environnement sombre.
  10. Acquérir des images d'un champ de vision de 300 x 300 pixels, à un zoom de deux, et un temps pixel d'habitation de 4,8 ms / pixel. Environ mis en place la puissance du laser en changeant la «zone d'acquisition» dans le «A1MP GUI» et le gain dans la fenêtre 'A1 Compact GUI ».
  11. Configuration de la z-stack
    1. Focus sur la couche de cellules ganglionnaires pour définir le plan focal haut de la z-pile dans le '-subwindow Z'dans la «fenêtre d'acquisition ND. Une partie GFAP: Des cellules -positif NGFP sont généralement situées dans la couche de cellules ganglionnaires, ce qui permet d'identifier la limite de base de la rétine (figure 2A, D).
    2. Déplacer le plan focal par le niveau de l'ONL (figure 2A, B), qui est caractérisé par la présence de GFAP faiblement marquée: des cellules -positif NGFP qui sont ronds et agrandie par rapport à leurs homologues dans le INL (figure 2A, C) , .
    3. Définir ce plan que le fond de la pile z. Assurez -vous que l'ensemble ONL sera imagée (figure 2A, B).
    4. Lorsque vous rencontrez des changements de plan focal qui nécessitent ré-ajustement pendant la période d'imagerie, double-cliquez sur la position centrale dans le subwindow 'z' pour l'assigner comme position «domestique». Changement de «mode symétrique défini 'et cliquez sur «relative».
    5. Définissez la taille z-étape entre 0,7 à 1 pm.
  12. correction Z intensité:
    1. Appliquer des corrections z intensité pour compenser la perte d'intensité de pixel en raison de la diffusion de lumière lorsque l'imagerie dans les couches profondes du tissu.
    2. Pour configurer la correction, ouvrez la fenêtre 'de correction z-intensité ». Pour définir la «gamme z-stack ', choisissez' De ND.
    3. Cliquez sur le plan focal en bas dans la fenêtre «correction z-intensité» (dans ce cas, correspond à la couche de cellules ganglionnaires) et régler l'intensité du laser ( «zone d'acquisition» dans le «A1MP GUI») et le gain (A1 GUI Compact ).
    4. Cliquez sur la flèche à côté des «valeurs z» dans la fenêtre 'de correction z-intensité »pour confirmer les paramètres qui sont ensuite présentées sous la rubrique« paramètres de l'appareil »dans la fenêtre' de correction z-intensité» pour le plan focal choisi.
    5. Répétez le processus pour l'un milieuplans supérieurs nd, augmentant la puissance du laser et le gain. plans focaux supplémentaires peuvent être ajoutés si nécessaire. Voir le tableau 1 pour laser et de gain des paramètres spécifiques pour les expériences sur les figures 2 - 4.
    6. Définir la «zone d'acquisition» dans la fenêtre 'A1 MP GUI. Évitez de choisir une zone d'acquisition supérieur à 15 et un gain supérieur à 126 au début de l'imagerie pour contourner photoblanchiment et l'augmentation des niveaux de bruit.
      NOTE: Comme les lasers et les tubes photomultiplicateurs diffèrent entre les systèmes de microscopie, laser de test et les réglages de gain pour obtenir des conditions d'imagerie optimales pour le microscope mis en place tout en évitant photoblanchiment.
    7. Choisissez «correction d'intensité relative» dans la fenêtre 'de correction z-intensité ».
  13. Dans la sous-fenêtre «timeseries» dans la fenêtre «ND acquisition», réglez la durée à 8 h et l'intervalle de «sans délai». Ensuite, assurez-vous de cliquer sur le "z-correction Exécuter 'dans til 'z-stack' fenêtre secondaire dans le bouton «ND acquisition» de la fenêtre pour acquérir les timeseries 3-D.
  14. Maintenir explants de rétine à une température de 27-29 ° C pendant toute la durée d'acquisition des images.
  15. Tout au long de la période d'acquisition d'image, si nécessaire, réajuster le niveau de puissance et de gain afin de maintenir une qualité d'image pour l'analyse post-imagerie. Pour effectuer les étapes ajustements 5.11.2 - 5.11.4.
  16. Si les changements de plan focal pause ou arrêter la course et effectuer l'étape 5.11 à nouveau.
    NOTE: Si «z-correction relative 'a été choisi à l'étape 5.12.7 et 5.11.4 étape a été réalisée, il ne doit pas être nécessaire de réajuster les niveaux de puissance et de gain, à moins vaste photoblanchiment a eu lieu.

6. Analyse de la vitesse

  1. Extraire le temps, la fixation d'un «région d'intérêt» sur l'image. Utilisez la «mesure du temps 'outil et exporter les valeurs de temps à une feuille de calcul.
  2. Tronquer une région qui contient un groupe diViding GFAP: NGFP noyau -positif.
  3. Choisissez la région recadrée afin qu'il contient au moins un noyau qui ne subit pas INM afin de définir un point de référence pour mesurer ensuite les distances que le noyau de séparation migré par rapport à l'INL basale. NOTE: Pour choisir un noyau qui reste dans l'INL basale, il aide à préparer une reconstruction 3-D des timeseries.
  4. Alternativement, si un GFAP: NGFP cellule -positif est observée dans l'ONL pendant toute la période d'acquisition, utilisez une ligne verticale de longueur fixe couvrant du noyau ONL à l'INL basale afin d'identifier un point de référence.
  5. Utilisation de la fonction «show tranches de vue ', générer des projections orthogonales. Par la suite, changer le mode de «tranche» à «projection d'intensité maximale.
  6. Eteignez le 'xy' vue de la projection orthogonale maximale. Selon l'orientation à laquelle le migrant / noyau divisant est mieux visible, unLSO éteindre soit le «xz'- ou la« vue yz'.
  7. Cliquez sur l'image restante avec le bouton droit de la souris et extraire le «xz» ou «série yz'-image avec la fonction 'Créer un nouveau document à partir de ce point de vue». Si nécessaire, faire pivoter l'image.
  8. En utilisant la fonction "mesure manuelle ', tracer une ligne horizontale à travers l'image au niveau inférieur du noyau qui reste dans le INL basale et ne subit pas de l' INM (= point de référence; Figure 4A - E, ligne horizontale rouge).
  9. Mesurer la distance entre la ligne de référence et le point du noyau de migration pour les timeseries en utilisant l'outil "de mesure de la ligne» dans le logiciel d'analyse (voir Figure 4A - E) basale.
  10. Une fois l'enveloppe nucléaire se décompose, mesurer la position basale du soma si elle est identifiable après la diffusion de la GFP dans la cellule entière.
  11. L'utilisation d'un logiciel de tableur, tracer la distance d'un nucleus migré contre le temps écoulé (figure 4F).
    1. Pour déterminer la vitesse de migration apicale (v a), graphique les distances parcourues pour la période avant répartition de l' enveloppe nucléaire se produit (figure 4G).
    2. Sélectionnez la série de données dans le graphique, cliquez-droit sur la souris et insérez une courbe de régression linéaire y compris la fonction correspondante 'y = mx + c'. La pente «m» dans la fonction représente la vitesse, v un (Figure 4G).
    3. Répétez les étapes 6.11.1 et 6.11.2 pour la première phase de migration de base rapide pour déterminer la vitesse de migration de base, v b (Figure 4H).

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Résultats

L'isolement de la rétine selon la procédure décrite dans le schéma de la figure 1 permet la mise en culture d'une rétine dorsale aplatie d'adulte lumière endommagée Tg [GFAP: NGFP] mi2004 zebrafish sur une période d'au moins 24 h dans un 5% de CO 2 / environnement d'air. Ces explants rétiniens montés à plat peuvent être utilisés pour l'image des plans focaux au niveau des tissus profonds. Un exemple est Müller glie /...

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Discussion

Les études portant sur les mécanismes régissant la régénération de l'adulte endommagée de la rétine zebrafish méthodes principalement utilisées immunocytochimiques 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Mise en place des conditions de culture des explants rétiniens et d'effectuer l'imagerie...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous apprécions le soutien fourni par William Archer et le Fonds Notre Dame imagerie intégrée. Des remerciements spéciaux sont dirigés vers les techniciens Freimann sciences de la vie pour leur aide continue et leur prise en charge et de l'élevage du poisson zèbre. Cette étude a été soutenue par des subventions du National Eye Institute des NIH pour DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) et le Centre de recherche Zebrafish, Université de Notre Dame, Notre Dame, IN.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pince Dumont #5World precision instruments14098
Pince Dumont #5, 45 ́angleWorld precision instruments14101
McPherson-Vannas ciseauxWorld precision instruments501233
FluordishesWorld precision instrumentsFD35-100
StereomicroscopeNikonSMZ-1Btype similaire de dissection le stéréomicroscope fonctionnera
Armoire de sécurité biologique de classe A2Le type équivalentLabconco
incubateur de culture tissulaireThermoscientifiqueHEPA de classe 100type équivalent fonctionnera
Lampes fluorescentes Sylvania OSFP5835HOECOBulbtronics31850
0.2 & micro ; Filtre pour seringue AcrodiscVWR4192
10 mL Seringue Luer-lokVWRBD309604
60 mL Seringue Luer-lokVWRBD309653
NaHCO3FischerScientificS233-500
CaCl2ThermoScientificC79-500
MgCl2EMD Millipore5980
HBSS sans Ca2+/Mg2+, sans rouge de phénol, GibcoThermoScientific14175-095
MEM sans rouge de phénol, GibcoThermoScientific5100-038
Sérum de cheval, inactivé thermiquementThermoScientific26050-070
pénicilline/streptomycineVWR16777-164
Agarose ultrapure à bas point de fusionThermoScientific16520-100
éthanol, absoluThermoScientificBP2818-4
2-phénoxyéthanolSigma77699
Corning Cell-Tak adhésif pour cellules et tissusVWR354240
indice de réfraction liquide  ;Cargille Lab1803Y
Nikon A1 équipé d’un laser infrarouge MaiTaiNikonfonctionnera
Objectif à immersion dans l’eau longue distance Apo 40X (N.A. 1.15)
chambre environnementale équipée d’un insert pour paraboles de 35 mmà Okolabfonctionnera
logiciel d’analyseNISNikon
fonctionnera le Le microscope multiphotonique système équivalent à Le système équivalent

Références

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  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
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