la régénération rétinienne Zebrafish a surtout été étudiée en utilisant des rétines fixes. Cependant, les processus dynamiques tels que la migration nucléaire interkinetic se produisent au cours de la réponse régénérative et nécessitent imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes sous-jacents. Ici, nous décrivons la culture et d'imagerie conditions pour surveiller Interkinetic Migration nucléaire (INM) en temps réel en utilisant la microscopie multiphoton.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie
Dans cet article
Résumé
Résumé
Un programme de régénération endogène est initiée par Müller glie dans le poisson zèbre adulte (Danio rerio) rétine après une lésion neuronale et la mort. Les gliales Müller ré-entrer dans le cycle cellulaire et produisent des cellules progénitrices neuronales qui subissent les rondes subséquentes de divisions cellulaires et se différencient en types de cellules neuronales perdues. Les deux Müller gliales et cellules progénitrices neuronales noyaux répliquent leur ADN et subissent une mitose dans des endroits distincts de la rétine, soit ils migrent entre la basale couche intérieure nucléaire (INL) et la couche extérieure nucléaire (ONL), respectivement, dans un processus décrit comme Interkinetic migration nucléaire (INM). INM a surtout été étudié dans la rétine en développement. Pour examiner la dynamique de l'INM chez l'adulte régénérant rétine zebrafish en détail, imagerie des cellules vivantes des cellules progénitrices marquées par fluorescence Müller glie / neuronales est nécessaire. Ici, nous fournissons les conditions pour isoler et rétines culture dorsalesde Tg [GFAP: NGFP] zebrafish de mi2004 qui ont été exposés à une lumière intense constante pendant 35 h. Nous montrons également que ces cultures rétiniennes sont viables pour réaliser des expériences d'imagerie en direct des cellules, l' acquisition en continu des images z-stack dans toute l'épaisseur de l'expiant rétinienne jusqu'à 8 h par microscopie multiphoton pour surveiller le comportement migratoire des GFAP: cellules -positifs NGFP . En outre, nous décrivons les détails pour effectuer une analyse post-imagerie pour déterminer la vitesse de l'INM apicale et basale. Pour résumer, nous avons établi des conditions pour étudier la dynamique de l'INM dans un modèle adulte de la régénération neuronale. Cela fera progresser notre compréhension de ce processus cellulaire crucial et nous permettre de déterminer les mécanismes qui contrôlent l'INM.
Introduction
Contrairement aux humains, le poisson zèbre (Danio rerio) présentent une réponse de régénération robuste sur la mort cellulaire des neurones rétiniens 1, 2, 3, 4. Le facteur α de nécrose tumorale, une molécule de signalisation qui est libérée de mourir neurones de la rétine induit Müller glie résidant dans l'basales couche intérieure nucléaire (INL) de la rétine, à proliférer 5 et de produire des cellules souches neuronales qui continuent à proliférer avant de se différencier en cellule neuronale les typ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Note: Zebrafish ont été soulevées et maintenu dans l'établissement Notre Dame Zebrafish dans le Freimann Life Sciences Center. Les méthodes décrites dans ce manuscrit sont approuvés par l'Université de Notre Dame de protection des animaux et l'utilisation Comité et sont en conformité avec la déclaration de l'utilisation des animaux dans la recherche de la vision par l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie.
1. Solutions
- Préparer éthanol à 70% pour stériliser la hotte de culture tissulaire et de tout équipement / des réactifs qui sont transférés dans la hotte de culture tissulaire.
- ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
L'isolement de la rétine selon la procédure décrite dans le schéma de la figure 1 permet la mise en culture d'une rétine dorsale aplatie d'adulte lumière endommagée Tg [GFAP: NGFP] mi2004 zebrafish sur une période d'au moins 24 h dans un 5% de CO 2 / environnement d'air. Ces explants rétiniens montés à plat peuvent être utilisés pour l'image des plans focaux au niveau des tissus profonds. Un exemple est Müller glie /.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Les études portant sur les mécanismes régissant la régénération de l'adulte endommagée de la rétine zebrafish méthodes principalement utilisées immunocytochimiques 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Mise en place des conditions de culture des explants rétiniens et d'effectuer l'imagerie.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Nous apprécions le soutien fourni par William Archer et le Fonds Notre Dame imagerie intégrée. Des remerciements spéciaux sont dirigés vers les techniciens Freimann sciences de la vie pour leur aide continue et leur prise en charge et de l'élevage du poisson zèbre. Cette étude a été soutenue par des subventions du National Eye Institute des NIH pour DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) et le Centre de recherche Zebrafish, Université de Notre Dame, Notre Dame, IN.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pince Dumont #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Pince Dumont #5, 45 ́angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas ciseaux | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | type similaire de dissection le stéréomicroscope fonctionnera |
| Armoire de sécurité biologique de classe A2 | Le type équivalent | Labconco | |
| incubateur de culture tissulaire | Thermoscientifique | HEPA de classe 100 | type équivalent fonctionnera |
| Lampes fluorescentes Sylvania OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 & micro ; Filtre pour seringue Acrodisc | VWR | 4192 | |
| 10 mL Seringue Luer-lok | VWR | BD309604 | |
| 60 mL Seringue Luer-lok | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS sans Ca2+/Mg2+, sans rouge de phénol, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM sans rouge de phénol, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Sérum de cheval, inactivé thermiquement | ThermoScientific | 26050-070 | |
| pénicilline/streptomycine | VWR | 16777-164 | |
| Agarose ultrapure à bas point de fusion | ThermoScientific | 16520-100 | |
| éthanol, absolu | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phénoxyéthanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak adhésif pour cellules et tissus | VWR | 354240 | |
| indice de réfraction liquide ; | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 équipé d’un laser infrarouge MaiTai | Nikon | fonctionnera | |
| Objectif à immersion dans l’eau longue distance Apo 40X (N.A. 1.15) | |||
| chambre environnementale équipée d’un insert pour paraboles de 35 mm | à Okolab | fonctionnera | |
| logiciel d’analyse | NISNikon |
Références
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Kassen, S. C., et al. Time....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
