Method Article

Analyse qualitative et Quantitative de la Synapse immunitaire dans le système humain à l’aide d’imagerie de cytométrie en flux

DOI:

10.3791/55345

⸱

January 7th, 2019

 ,  , 
1Institute of Immunology, Section Molecular Immunology, University of Heidelberg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici un workflow complet pour l’analyse qualitative et quantitative du système immunitaires synapses entre les cellules T humaines primaires et les cellules présentatrices d’antigène. La méthode est basée sur l’imagerie cytométrie en flux, qui permet l’acquisition et l’évaluation de plusieurs images de milliers de cellules dans un délai relativement court.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La synapse immunitaire est le domaine de la communication entre les cellules T et cellules présentatrices d’antigène (CPA). Lymphocytes T polarisent les récepteurs de surface et des protéines vers la synapse immunitaire afin d’assurer une liaison stable et échange de signaux. La microscopie confocale, FRBR ou super-résolution classique ont été utilisées pour étudier la synapse immunitaire. Étant donné que ces méthodes nécessitent l’acquisition d’image manuel et quantification de temps, il est difficile de l’imagerie des événements rares. Nous décrivons ici un workflow qui permet l’analyse morphologique des dizaines de milliers de cellules. Système immunitaires synapses sont induites entre cellules T humaines primaires dans les préparations de pan-leucocytes et cellules de Staphylococcus aureus entérotoxine B SEB-chargé Raji comme TTB. Acquisition d’images s’effectue avec l’imagerie de cytométrie en flux, également appelée microscopie d’influx, qui combine les caractéristiques d’un cytomètre en flux et un microscope à fluorescence. Une stratégie de blocage complete pour identifier les couples de cellules T/APC et analyser les synapses immunitaires est fournie. Car ce flux de travail permet l’analyse d’immunitaire synapses dans des préparations non-purifiés pan-leucocyte et nécessite donc uniquement une petite quantité de sang (p. ex., 1 mL), elle peut être appliquée à des échantillons provenant de patients. Ce qui est important, plusieurs échantillons peuvent être préparés, mesurés et analysés en parallèle.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les lymphocytes T sont les principaux régulateurs du système immunitaire adaptatif et sont activés par l’intermédiaire de peptides antigéniques qui sont présentés dans le cadre des complexes majeurs d’histocompatibilité (MHC). Pleine activation des lymphocytes T nécessite deux signaux, le signal de compétence via le récepteur des cellules T spécifiques de l’antigène (TCR) / CD3 complexe et le signal de costimulation via des récepteurs accessoires. Les deux signaux sont générés par le biais de l’interaction directe des cellules T avec présentatrices d’antigène (CPA) des cellules. TTB mature fournit le signal de compétence pour l’activation des lymphocytes T par l’intermédiaire de complexes MHC-peptide, et qu’ils expriment des ligands costimulation (p. ex., CD80 ou CD86) pour assurer la progression de l' activation de lymphocytes T1. Une fonction importante de costimulation est le réarrangement de l’actine cytosquelette2,3,4. Le F-actine corticale est relativement statique au repos des cellules T. Stimulation des lymphocytes T par antigène-roulement TTB conduit à une réorganisation profonde du cytosquelette d’actine. Dynamique de l’actine (p. ex., rapide actine polymérisation/dépolymérisation cercles) activer les cellules T créer les forces qui servent au transport des protéines ou des organites, par exemple. De plus, le cytosquelette d’actine est important pour le développement d’une zone spéciale de contact entre lymphocytes T et les APC, appelé la synapse immunitaire. En raison de l’importance du cytosquelette d’actine vers la synapse immunitaire, il est devenu essentiel d’élaborer des méthodes pour quantifier les changements dans le cytosquelette d’actine de cellules de T5,6,7,8 , 9.

Au moyen d’aides du cytosquelette d’actine, récepteurs de surface et les protéines de signalisation sont séparées en grappes activation supramoléculaire (SMACs) au sein de la synapse immunitaire. La stabilité de la synapse immunitaire est assurée par la liaison des récepteurs aux faisceaux d’actine F qui augmentent l’élasticité du cytosquelette d’actine. La formation des synapses immunitaire s’est avérée être critique pour la génération de la réponse immunitaire adaptative. Les effets néfastes d’une formation de synapse immunitaire défectueux in vivo a étaient tout d’abord réalisées chez des patients atteints de maladie de Wiskott Aldrich Syndrome (WAS), une maladie dans laquelle polymérisation de l’actine et, en même temps, la formation des synapses immunitaires sont dérangées10 . A les patients peuvent souffrir de l’eczéma, infections graves à répétition, maladies auto-immunes et mélanomes. Malgré cette conclusion, il n'est pas encore connu si la formation des synapses immunitaire diffère dans les cellules T des individus sains et des patients souffrant d’anomalies immunitaires ou des maladies auto-immunes.

La microscopie de fluorescence, y compris confocale, FRBR et super-résolution microscopie, ont été utilisés pour découvrir l’architecture de la synapse immunitaire11,12,13,14. La haute résolution de ces systèmes et la possibilité d’effectuer l’imagerie de cellules vivantes active la collecte d’informations exactes, spatio-temporelle sur le cytosquelette d’actine et des protéines intracellulaires de surface dans la synapse immunitaire. Beaucoup de résultats, cependant, est basées sur l’analyse de quelques dizaines de cellules T. En outre, les cellules T doivent être purifiées pour ces types de microscopie de fluorescence. Toutefois, pour plusieurs questions de recherche, l’utilisation des cellules non-purifiés plutôt que la résolution plus élevée possible est primordial. C’est utile que si les cellules de T de patients sont analysés, puisque le montant des dons de sang est limité et qu’il pourrait y avoir la nécessité de traiter de nombreux échantillons en parallèle.

Nous avons établi des méthodes microscopiques qui permettent l’analyse du cytosquelette d’actine dans la synapse immunitaire dans le système humain15,16,17. Ces méthodes sont basées sur l’imagerie de cytométrie en flux, également appelée influx microscopie18. Comme un hybride entre la microscopie de cytométrie en flux et fluorescence multispectrale flux, imagerie cytométrie a ses points forts dans l’analyse des paramètres morphologiques et la localisation des protéines dans des populations de cellules hétérogènes, tels que pan-leucocytes de la sang périphérique. Nous avons introduit une méthodologie qui nous permet de quantifier l’actine F en conjugués de T-cellule/APC des cellules T humaines provenant d’échantillons de sang total, sans avoir besoin de purification lente et coûteuse étapes17. La technique présentée ici comprend le flux de travail ensemble, d’obtenir l’échantillon de sang à la quantification de la F-actine dans la synapse immunitaire.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. préparation des Pan-leucocytes

  1. Dessiner 1 mL de sang périphérique d’un donneur sain (ou patient) dans une seringue héparinée. Assurez vous d’avoir l’approbation par le Comité d’éthique responsable pour le don de sang.
  2. Mélanger 1 mL de périphériques humains de sang avec 30 mL de tampon de lyse ACK (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3et 0,1 mM EDTA, pH 7,0) dans un tube de 50 mL et incuber pendant 8 min à température ambiante.
  3. Remplissez les tubes avec PBS et centrifuger à 300 x g pendant 6 min. aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 30 mL de tampon de lyse ACK.
  4. Répétez les étapes 1,2 et 1,3 jusqu'à ce que le liquide surnageant est clair. Enfin, laver les cellules dans du PBS, centrifuger à 300 x g pendant 6 min à température ambiante et resuspendre le culot dans 2 mL de milieu de culture (RPMI1640 + 10 % FCS). Incuber les cellules à 37 ° C pendant 60 min.

2. chargement de Raji cellules avec SEB

  1. Préparer deux tubes Falcon de 15 mL avec 1,5 x 106 cellules Raji par tube. Tournez en bas des cellules (300 x g pendant 6 min à température ambiante) et éliminer le surnageant.
  2. Remettre en suspension les cellules dans un milieu résiduel (environ 50 à 100 µL), ajouter 1,9 µL (1,9 µG) SEB et incuber à température ambiante pendant 15 min. ajouter 5 mL de milieu de culture, tournez en bas des cellules (300 x g pendant 6 min à température ambiante) et resuspendre le culot dans le milieu de culture (RPMI 1640 + 10 % FCS) à une densité de 1 x 106 cellules/mL.

3. induction des Synapses immunitaires et souillant le protocole

  1. Pipeter 500 µL de la préparation des cellules Raji SEB chargées dans un tube de FACS et 500 µL de la préparation des cellules de Raji déchargés dans un autre tube de FACS. Ajouter 650 µL de pan-leucocytes dans chaque tube et centrifuger les cellules (300 x g pendant 10 min à température ambiante). Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 150 µL de milieu de culture (RPMI1640 + 10 % FCS). Incuber à 37 ° C (généralement pendant 45 min).
  2. Vortex doucement les cellules (10 s à 1 000 tr/min) et ajouter 1,5 mL de paraformaldéhyde (1,5 %) pendant le vortex pour fixer les cellules. Arrêtez la fixation en ajoutant 1 mL de PBS + 1 % de BSA. Granules des cellules (300 x g pendant 10 min à température ambiante et de la remise en suspension le culot dans 1 mL de PBS + 1 % BSA après incubation à température ambiante pendant 10 min.
  3. Pellet (300 x g pendant 10 min à température ambiante) et remettre en suspension les cellules dans 100 µL de PBS BSA 1 % + 0,1 % de saponine pendant 15 min à température ambiante pour permeabilize des cellules (plaque 96 puits, en forme de U).
  4. Laver les cellules en PBS, BSA 1 % + 0,1 % de saponine avec centrifugation (300 x g pendant 10 min à température ambiante) et resuspendre le culot dans 50 µL de PBS, BSA 1 % + 0,1 % de saponine contenant des anticorps marqués au fluorophore ou composés (CD3-PE-TxRed (01:30), Phalloidin-AF647 1 : (150) et au DAPI (1:3, 000)).
  5. Incuber les cellules à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 min. laver les cellules 3 fois en ajoutant 1 mL de PBS, BSA 1 % + 0,1 % de saponine. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à température ambiante. Re-remettre les cellules en 60 µL de PBS pour cytométrie en imagerie.

4. image Acquisition à l’aide d’un cytomètre en flux

Remarque : La suivante image acquisition procédure d’analyse de données et sont basées sur l’imagerie de cytométrie de flux à l’aide de logiciels tels qu’imagestream (IS100), INSPIRE et des idées. Toutefois, autre logiciel d’analyse et de cytomètres de flux peut également servir.

  1. Ouvrez le logiciel d’analyse sur l’ordinateur connecté à l’imagerie cytomètre de flux et cliquez sur initialiser fluidique du menu Instrument. Appliquer les perles sur le port de droit lorsque vous êtes invité à le faire.
  2. Charger le modèle par défaut dans le menu fichier et cliquez sur Run/Setup. Choisissez les perles dans le menu déroulant affichage.
  3. Ajuster l’éclairage lumineux-zone en cliquant sur l’intensité de la valeur si la valeur indiquée est inférieure à 200.
  4. Exécuter le calibrage et test de routine dans l’onglet assistance en cliquant sur démarrer tous.
  5. Cliquez sur charger/Lock/Flush et appliquez les échantillons dans le port de gauche lorsque vous êtes invité à le faire. Après avoir chargé les cellules dans le cytomètre en flux, ouvrez le classificateur de cellule et réglez les valeurs comme suit : plafond à 1 022 pour chaque canal, le pic intensité limite inférieure à 50 pour le canal 2 (DAPI) et le canal 5 (CD3-Pe-TxR), la limite inférieure de la zone à 50 pour l’intensité crête canal 1 (diffusion latérale) et une limite supérieure à 1 500.
  6. Modifier la puissance de laser de l’excitation à 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) et 647 nm (90 mW) dans l’onglet configuration.
  7. Passer le menu déroulant de vue entre les cellules et les perles pour évaluer les réglages d’alimentation cellule classifieur et laser.
    Remarque : Assurez-vous que toutes les cellules et les cellules couples sont retrouvent à l’affichage de la cellule et que les amas de cellules, les débris et les images avec des pixels saturés sont trouvent dans la vue de débris en changeant les classificateurs cellulaire et/ou les pouvoirs de laser d’excitation.
  8. Définir le nom de l’échantillon et la quantité d’images à acquérir (15 000 – 25 000 échantillons) et 500 pour les contrôles de compensation dans l’onglet configuration, cliquez sur Run/Setup pour lancer l’acquisition.

5. analyse

  1. Transférer les fichiers d’image raw (.rif) sur l’ordinateur d’analyse de données et ouvrez le logiciel d’analyse.
  2. Produire une matrice de rémunération suivant les instructions de la liste déroulante de Compensation. Enregistrez la matrice de rémunération sous comp_Date.ctm.
  3. Ouvrir un fichier image raw (.rif) et appliquer le comp_Date.ctm dans la fenêtre qui s’affiche pour produire les fichiers d’image compensée (.cif) et le fichier de l’analyse de données par défaut (.daf).
  4. Ouvrez le fichier image compensée. Convertit les images en mode couleur et ajuster les tables de recherche pour obtenir des couleurs optimales visibles dans la barre d’outils propriétés de galerie d’Image. Obtenir une image RVB-fusionné à l’aide de l’onglet Composite de la barre d’outils propriétés de galerie d’Image.
  5. Ouvrez le gestionnaire de masque dans le menu déroulant de l’analyse. Créer des masques pour définir les cellules T et la synapse immunitaire, comme suit :
    1. Sélectionnez le masque de lymphocytes : « (Fill (Threshold_Ch05, 60). » Sélectionnez le masque de la vallée : « Valley(Ch02,3). » Sélectionnez le masque de synapse de lymphocytes T : « masque de lymphocytes et vallée (M02, Ch02, 3). »
  6. Ouvrez le gestionnaire de fonctionnalités dans la liste déroulante analyse. Calculer les caractéristiques suivantes :
    1. Pour l’expression totale de CD3 dans les cellules T, sélectionnez « Intensity_T-cells_Ch5. » Pour le montant total de F-actine dans les cellules T, sélectionnez « Intensity_T-cells_Ch6. » Pour l’expression CD3 dans la synapse immunitaire, sélectionnez « cellules Intensity_T synapse_Ch5. » Pour la quantité F-actine dans la synapse immunitaire, sélectionnez « cellules Intensity_T synapse_Ch6. »
    2. Pour calculer la surface de lymphocytes, sélectionnez « Cellules Area_T ». Pour calculer la zone de synapse immunitaire des lymphocytes T, sélectionnez « synapse Area_T-cellule. »
  7. Déterminer l’actine F et CD3 enrichissement dans la synapse immunitaire en utilisant l’équation dans le gestionnaire de fonctionnalités :
    figure-protocol-1
  8. Appliquer la stratégie de blocage suivante à l’aide d’histogrammes et dot des parcelles de la zone d’analyse (pour plus amples détails, voir les références 17 et 19) :
    1. Jetez les cellules out-of-focus en traçant le « Gradient RMS_M2_Ch2 » dans un histogramme ; fixe le seuil à 15 ans.
    2. Tracer le CSD versus CD3 intensité dans une parcelle de dot. Définissez une porte sur les événements positifs CD3.
    3. Tracer le « Aspect ratio » de M02 (tache DAPI) par rapport à la zone de M02 (Dapi tache). Porte sur les maillots de T-cellule et cellule couples en conséquence. Corriger pour les couples de cellule réelle à l’aide de la zone du masque synapse, comme décrit plus haut17,19.
    4. Déterminer la quantité d’actine F en maillots de corps de cellules T et cellules de T de couples de T-cellule/APC et le pourcentage d’actine-F dans la synapse immunitaire.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un objectif majeur de la méthode décrite ici est la quantification de l’enrichissement en protéines (p. ex., F-actine) dans la synapse immunitaire entre TTB (cellules Raji) et les lymphocytes T non-purifiés pan-nombre de leucocytes provenant d’échantillons de sang humain de faible volume (1 mL) de substitution. La capture d’écran dans la Figure 1 donne un aperçu de la stratégie de blocage critique de cette méthode. Il montre la galerie d’images sur la gauche et l...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le flux de travail présentée ici permet la quantification du système immunitaires synapses entre les cellules T humaines (ex vivo) et APC. Notamment, érythrocytes-lysé pan-leucocytes sont utilisés comme sources de lymphocytes T, faire des étapes de purification de cellules T dispensable. La lignée de cellules de lymphome de B-cellule Raji a servi en tant que substitut TTB. Cela porte des avantages significatifs, puisqu’elle permet des comparaisons entre les donneurs de sang du côté T-cellulaire de la synapse immunitaire....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le travaux ont été financés par le Conseil de la société de recherche allemande (DFG) grâce à des subventions no. SFB-938-M et SA 393/3-4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
>Multifuge 3 SRHeraeus
RPMI 1640LifeTechnologies#11875085500 mL
FCSPan Biotech#3302-P101102
Tube à fond rond en polystyrèneFalcon#3520545 mL
KulturflascheThermo Scientific#178883
Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’sSigmaD8662
Sérum bovin AlbumineRoth#8076.3
SaponineSigmaS7900
ParaformaldéhydeSigma Aldrich#16005
FACS Wash SaponinePBS 1 % BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaBSarstedt72.699.0020.5 mL
Billede vitesseAmnis#400041
Minishaker MS1IKA Works  ; MS1
MikrotiterplatteGreiner Bio One#65010196U
Entérotoxine SEBSigma AldrichS4881
DAPISigma AldrichD95421:3000
CD3-PeTxRInvitrogenMHCD03171:30
Phalloidin-AF647Sondes moléculairesA222871:150
IS100AmnisCytomètre de flux d’imagerie
IDEASLogiciel Amnis
INSPIRELogiciel Amnis

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
  2. Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
  3. Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
  4. Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68(2016).
  5. Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
  6. Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
  7. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  8. Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
  9. Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
  10. Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
  11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  12. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
  13. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421(2012).
  14. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  15. Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
  16. Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
  17. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  18. Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
  19. Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
  20. Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
  21. Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
  22. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Immune SynapseImaging Flow CytometryT Cell APC ConjugatesCD3 Expression AnalysisF actin EnrichmentPan leukocyte PreparationSEB loaded Raji CellsGating StrategyProtein QuantificationHuman Blood Sample

Related Articles