Analyse qualitative et Quantitative de la Synapse immunitaire dans le système humain à l’aide d’imagerie de cytométrie en flux

Résumé

Nous décrivons ici un workflow complet pour l’analyse qualitative et quantitative du système immunitaires synapses entre les cellules T humaines primaires et les cellules présentatrices d’antigène. La méthode est basée sur l’imagerie cytométrie en flux, qui permet l’acquisition et l’évaluation de plusieurs images de milliers de cellules dans un délai relativement court.

Résumé

La synapse immunitaire est le domaine de la communication entre les cellules T et cellules présentatrices d’antigène (CPA). Lymphocytes T polarisent les récepteurs de surface et des protéines vers la synapse immunitaire afin d’assurer une liaison stable et échange de signaux. La microscopie confocale, FRBR ou super-résolution classique ont été utilisées pour étudier la synapse immunitaire. Étant donné que ces méthodes nécessitent l’acquisition d’image manuel et quantification de temps, il est difficile de l’imagerie des événements rares. Nous décrivons ici un workflow qui permet l’analyse morphologique des dizaines de milliers de cellules. Système immunitaires synapses sont induites entre cellules T humaines primaires dans les préparations de pan-leucocytes et cellules de Staphylococcus aureus entérotoxine B SEB-chargé Raji comme TTB. Acquisition d’images s’effectue avec l’imagerie de cytométrie en flux, également appelée microscopie d’influx, qui combine les caractéristiques d’un cytomètre en flux et un microscope à fluorescence. Une stratégie de blocage complete pour identifier les couples de cellules T/APC et analyser les synapses immunitaires est fournie. Car ce flux de travail permet l’analyse d’immunitaire synapses dans des préparations non-purifiés pan-leucocyte et nécessite donc uniquement une petite quantité de sang (p. ex., 1 mL), elle peut être appliquée à des échantillons provenant de patients. Ce qui est important, plusieurs échantillons peuvent être préparés, mesurés et analysés en parallèle.

Introduction

Les lymphocytes T sont les principaux régulateurs du système immunitaire adaptatif et sont activés par l’intermédiaire de peptides antigéniques qui sont présentés dans le cadre des complexes majeurs d’histocompatibilité (MHC). Pleine activation des lymphocytes T nécessite deux signaux, le signal de compétence via le récepteur des cellules T spécifiques de l’antigène (TCR) / CD3 complexe et le signal de costimulation via des récepteurs accessoires. Les deux signaux sont générés par le biais de l’interaction directe des cellules T avec présentatrices d’antigène (CPA) des cellules. TTB mature fournit le signal de compétence pour l’activation des lymphocytes T par l’inter....

Protocole

1. préparation des Pan-leucocytes

1. Dessiner 1 mL de sang périphérique d’un donneur sain (ou patient) dans une seringue héparinée. Assurez vous d’avoir l’approbation par le Comité d’éthique responsable pour le don de sang.
2. Mélanger 1 mL de périphériques humains de sang avec 30 mL de tampon de lyse ACK (150 mM NH₄Cl, 1 mM KHCO₃et 0,1 mM EDTA, pH 7,0) dans un tube de 50 mL et incuber pendant 8 min à température ambiante.
3. Remplissez les tubes avec PBS et centrifuger à 300 x g pendant 6 min. aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 30 mL de tampon de lyse ACK.
4. Répétez les étapes 1,2 et 1,3 jusq....

Résultats

Un objectif majeur de la méthode décrite ici est la quantification de l’enrichissement en protéines (p. ex., F-actine) dans la synapse immunitaire entre TTB (cellules Raji) et les lymphocytes T non-purifiés pan-nombre de leucocytes provenant d’échantillons de sang humain de faible volume (1 mL) de substitution. La capture d’écran dans la Figure 1 donne un aperçu de la stratégie de blocage critique de cette méthode. Il montre la galerie d’images sur la gauche et l.......

Discussion

Le flux de travail présentée ici permet la quantification du système immunitaires synapses entre les cellules T humaines (ex vivo) et APC. Notamment, érythrocytes-lysé pan-leucocytes sont utilisés comme sources de lymphocytes T, faire des étapes de purification de cellules T dispensable. La lignée de cellules de lymphome de B-cellule Raji a servi en tant que substitut TTB. Cela porte des avantages significatifs, puisqu’elle permet des comparaisons entre les donneurs de sang du côté T-cellulaire de la synapse immunitaire........

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
>Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 mL
FCS	Pan Biotech#3302-P101102
Tube à fond rond en polystyrène	Falcon	#352054	5 mL
Kulturflasche	Thermo Scientific	#178883
Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s	Sigma	D8662
Sérum bovin Albumine	Roth	#8076.3
Saponine	Sigma	S7900
Paraformaldéhyde	Sigma Aldrich	#16005
FACS Wash Saponine		PBS 1 % BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB	Sarstedt	72.699.002	0.5 mL
Bille	de vitesseAmnis	#400041
Minishaker MS1	IKA Works	; MS1
Mikrotiterplatte	Greiner Bio One	#650101	96U
Entérotoxine SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	1:3000
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	1:30
Phalloidin-AF647	Sondes moléculaires	A22287	1:150
IS100	Amnis		Cytomètre de flux d’imagerie
IDEAS	Logiciel Amnis
INSPIRE	Logiciel Amnis