Article de méthode

Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

DOI :

10.3791/55357

⸱

18 juillet 2017

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1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

Dans cet article

Résumé

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Nous décrivons l'établissement de tumeurs colorectales orthotopiques par injection de cellules tumorales ou organoïdes dans le cécum des souris et l'isolement subséquent des cellules tumorales circulantes (CTC) de ce modèle.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malgré les avantages d'une applicabilité et d'une rentabilité faciles, les modèles de souris sous-cutanés ont de graves limites et ne simulent pas exactement la biologie tumorale et la dissémination de cellules tumorales. Des modèles de souris orthotopiques ont été introduits pour surmonter ces limites; Cependant, ces modèles sont techniquement exigeants, en particulier dans les organes creux tels que le gros intestin. Afin de produire des tumeurs uniformes qui se développent de manière fiable et de métastases, des techniques normalisées de préparation et d'injection de cellules tumorales sont essentielles.

Nous avons développé un modèle orthotopique de cancer colorectal (CRC) qui développe des tumeurs hautement uniformes et peut être utilisé pour des études de biologie tumorale ainsi que des essais thérapeutiques. Les cellules tumorales provenant des tumeurs primaires, des lignées cellulaires bidimensionnelles (2D) ou des organoïdes tridimensionnels (3D) sont injectées dans le cécum et, selon le potentiel métastatique des cellules tumorales injectées, forment des tumeurs hautement métastatiques. En outre,Les CTC peuvent être consultés régulièrement. Nous décrivons ici la technique de la préparation des cellules tumorales à partir des lignées cellulaires 2D et des organoïdes 3D, ainsi que du tissu tumoral primaire, des techniques chirurgicales et d'injection ainsi que de l'isolement des CTC des souris portant une tumeur et des conseils pour le dépannage.

Introduction

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Le cancer colorectal (CRC) est l'une des causes les plus fréquentes de décès par cancer dans les pays occidentaux. 1 Alors que la tumeur primaire peut souvent être réséquée, l'apparition de métastases à distance aggrave considérablement le pronostic et conduit souvent à la mort. 2 , 3 La corrélation biologique de la métastase est la circulation des cellules tumorales (CTC), qui se détachent de la tumeur, survivent en circulation, attachent à l'épithélium dans l'organe cible, envahissent l'organe et finissent par dépasser de nouvelles lésions. 4 Bien que les CTC connaissent une pertinence pronostique, 5 , 6 , 7 , 8 , 9, leur biologie n'est que partiellement comprise en raison de leur extrême rareté dans le CRC. dix

Les modèles de souris sont un puissant tOol pour étudier divers aspects de la biologie du cancer. Les modèles classiques de tumeur sous-cutanée sont produits par injection sous-cutanée de cellules tumorales dans des souris destinataires, qui peuvent être immunocompétentes (si des cellules tumorales murines syngéniques sont utilisées) ou immunodéficientes. Les modèles de tumeur sous-cutanée sont peu coûteux et produisent rapidement des données; Leur croissance tumorale de point final peut être mesurée de manière simple et non invasive. Cependant, 88% des nouveaux composés qui ont démontré une activité antitumorale dans de tels modèles échouent dans les essais cliniques. 11 Cela s'explique en partie par les différences interspécifiques entre les humains et les souris; Cependant, une grande partie de cette défaillance est due à la faible valeur prédictive des modèles de souris sous-cutanés.

Les modèles de souris orthotopiques, dans lesquels les cellules tumorales sont injectées dans l'organe d'origine et donc poussent dans leur microenvironnement original, sont de plus en plus utilisés dans la recherche sur le cancer. 11 , 12 , 13 , 14 Les modèles orthotopiques ne simulent pas seulement les conditions locales de croissance tumorale; En raison du site anatomiquement correct de la croissance de la tumeur, les modèles de souris orthotopiques permettent également une simulation réaliste des métastases et sont donc utilisés pour étudier la biologie CTC 8 , 15 , 16 ou leur réponse à différents traitements dans le CRC. 13 , 17

Un inconvénient majeur des modèles de souris orthotopiques est leur complexité technique. Selon l'organe dans lequel les cellules doivent être injectées, la courbe d'apprentissage jusqu'à ce que l'expérimentateur puisse induire des tumeurs reproductibles soit assez longue. Cela s'applique particulièrement aux modèles de cancer colorectal, car les cellules tumorales doivent être injectées dans la paroi intestinale, ce qui entraîne souvent une perforation, une fuite de cellules tumorales ou une perte de cellules tumorales endoluminales. C'est unL'article a pour but de décrire le procédé de préparation cellulaire à partir d'échantillons de tissus primaires, de lignées cellulaires 2D et de culture organo-3D et leur injection dans le cécum des souris. La technique décrite ici conduit à des tumeurs hautement uniformes et, en fonction de la biologie tumorale de la lignée cellulaire utilisée pour l'injection, de la formation reproductible de métastases à distance et de CTC chez la souris destinataire. 15

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Protocole

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Les expériences sur les animaux présentées ici ont été revues et autorisées indépendamment par un comité institutionnel et gouvernemental de soins et d'utilisation des animaux et ont été menées selon les directives de la Fédération des associations de scientifiques de laboratoire (FELASA). Toutes les mesures possibles ont été prises pour minimiser les souffrances, y compris l'anesthésie et l'analgésie ou, si nécessaire, une euthanasie prématurée.

1. Préparation des cellules et des organoïdes

REMARQUE: Utilisez un volume de 20 μL avec 100 000 cellules pour chaque injection. Utilisez la matrice de membrane basique (BMM) afin d'éviter les fuites et d'assurer une injection standardisée. Afin d'assurer des résultats reproductibles, effectuer des analyses d'authentification de ligne cellulaire ( par exemple , via un profilage STR) à intervalles réguliers.

  1. Préparation des suspensions de cellules primaires à partir de tissus frais
    REMARQUE: Toujours travailler dans des conditions stériles. Transfert immédiat de la fraîcheurLes tissus réséqués de la salle d'opération au laboratoire sur glace sont requis pour assurer une viabilité élevée des cellules.
    Le bien-être et le traitement optimal du patient doivent toujours être la première priorité. Par conséquent, les échantillons de tissus pour la recherche doivent être obtenus d'une manière qui n'interfère pas avec le traitement pathologique et la mise en scène de la tumeur réséquée. Dans la plupart des cas, il est donc raisonnable d'avoir les échantillons pour la recherche obtenus par un pathologiste formé afin d'assurer la non-interférence avec le diagnostic pathologique.
    1. Immédiatement après l'élimination stérile de l'échantillon réséqué (idéalement ~ 1 cm 3 ), placez l'échantillon de tissu dans un tube de 50 ml prérempli avec 20 à 30 ml de solution salée tamponnée au phosphate (PBS). Rangez le tube sur glace et transférez immédiatement au laboratoire.
    2. Mettez le tissu dans une boîte de Petri et lavez-le deux fois avec de l'ABS pour éliminer le sang restant.
    3. Couper le tissu en petits morceaux (~ 2-4 mm) avec une scaLpel ( par exemple , avec une lame # 20 ou # 36).
    4. Utiliser le dissociateur selon les instructions du fabricant afin de dissocier davantage le tissu tumoral à une suspension à une seule cellule. Alternativement, utiliser d'autres protocoles de digestion enzymatique des tumeurs.
    5. Comptez les cellules de la suspension à une seule cellule résultante ( par exemple , dans un compteur de coultre ou un hémocytomètre).
    6. Centrifugeuse (5 min à 1.500 xg) et lavez la suspension cellulaire deux fois avec du PBS.
    7. Ressusciter les cellules dans le BMM à une concentration de 5 x 10 6 cellules / mL et les garder sur de la glace.
  2. Préparation des lignées cellulaires pour injection
    1. Cultiver toutes les lignées cellulaires du cancer colorectal dans des conditions de culture standard (37 ° C, 5% de CO 2 ) et les préparer au jour de la chirurgie.
    2. Récoltez les cellules selon les protocoles de culture cellulaire standard, comptez les cellules ( p . Ex. , Dans un compteur de coultre ou un hémocytomètre) et calculez la requêteQuantité utilisée pour toutes les injections selon le nombre d'animaux à injecter.
    3. Préparez 3-5x du volume réellement nécessaire pour tenir compte des pertes de pipetage et du volume mort de la seringue d'injection.
    4. Centrifugeuse (5 min à 1500 g) et lave la suspension cellulaire deux fois avec du PBS.
    5. Ressusciter les cellules dans le BMM à une concentration de 5 x 10 6 cellules / mL et les garder sur de la glace.
  3. Préparation organoïde
    NOTE: Toutes les cultures organoïdes 3D sont cultivées dans des conditions de culture standard (37 ° C, 5% de CO 2 ). Des protocoles détaillés pour la culture organoïde ont déjà été publiés. 18 , 19 , 20 Comme pour les lignées cellulaires conventionnelles, nous recommandons un volume de 20 μL de BMM avec 100 000 cellules par injection. Les organoïdes sont préparés au jour de l'opération comme suit:
    1. Préparez le support suivant (mentionné ci-aprèsDMEM / F12 +++): Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamine (200 mM) + 1% de pénicilline / Streptomycine.
    2. Pré-remplir les tubes de 15 mL avec 1 mL de DMEM / F12 +++.
    3. Aspirer soigneusement les organoïdes de la surface de la plaque de culture et transférer le contenu de 3 à 5 puits dans un tube de 15 mL.
    4. Calez soigneusement les organoïdes en petits morceaux en les pipetant vers le haut et vers le bas avec une pipette en verre étendue.
    5. Ajouter 5 mL de DMEM / F12 +++ au tube, puis centrifuger à 1000 xg pendant 5 min.
    6. Après centrifugation, éliminer le surnageant, remettre à nouveau le culot dans 600 μL de tampon de dissociation enzymatique et transférer la suspension dans un puits d'une plaque à 6 puits.
    7. Incuber à 37 ° C pendant 1 à 5 minutes, puis faire pipeter soigneusement la suspension vers le haut et vers le bas pour dissoudre les organoïdes.
      REMARQUE: vérifier la digestion par microscope; Il est complet lorsque tous les clusters cellulaires ont été dissociésD aux cellules simples.
    8. Après une digestion réussie, ajouter 1,4 mL de DMEM / F12 +++ pour arrêter la digestion. Ensuite, transférer tous les puits d'organoïdes digérés dans un tube de 50 ml.
    9. Comptez les cellules et calculez la quantité requise pour toutes les injections.
    10. Préparez 3 à 5 fois le volume réellement nécessaire pour tenir compte des pertes de pipetage et du volume mort de la seringue d'injection
    11. Centrifugeuse (5 min à 1.500 xg) et lavez la suspension cellulaire deux fois avec du PBS.
    12. Remis en suspension les cellules dans BMM à une concentration de 5 x 10 6 cellules / mL et les garder sur de la glace.

2. Modèle de souris orthotopique

  1. Préparation des animaux receveurs pour la chirurgie
    REMARQUE: Utilisez des souris NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) de 6-8 semaines, en tant que destinataires. 21 NSG sont parmi les souris les plus immunodéprimées, dépourvues de cellules B, T et NK matures, ainsi que de multiples autres immunoglobulinesLes effets. 21 Ils développent de manière fiable des tumeurs même si des nombres de cellules faibles sont injectés et sont très susceptibles d'être exposés à des métastases à distance. Les souris NSG sont d'excellents éleveurs et peuvent être conservées dans des unités spécifiques de pathogènes spécifiques (SPF).
    1. Avant la première incision, injecter 0,05 mg / kg de buprénorphine par voie sous-cutanée.
    2. Utilisez le sévoflurane à 3-3,5 vol% pour l'anesthésie générale. Une perte du réflexe de pincement indique une anesthésie suffisante.
    3. Couvrir les yeux des souris anesthésiées avec une pommade ophtalmique pour éviter la dessiccation de la cornée.
    4. Rallongez les souris en position couchée sur une petite table.
    5. Raser l'abdomen avec un rasoir électrique (la crème dépilatoire peut être utilisée alternativement) et désinfecter avec au moins 3 fois de chlorhexidine / iode et 70% d'alcool en alternance.
    6. Couvrir le champ chirurgical avec des rideaux stériles.
      NOTE: L'utilisation d'antibiotiques périopératoires est facultative et est assujettie aux lignes directrices institutionnelles.
  2. Laparotomie à la ligne médiane et l'exposition du cécum
    1. Utilisez des ciseaux (les scalpels peuvent être utilisés alternativement) pour faire une petite incision de la ligne médiane (3 à 5 mm) de la peau sur le bas ventre. Ramassez la musculature de la paroi abdominale avec une pince et soigneusement l'inciser avec des ciseaux, ouvrant ainsi la cavité abdominale.
    2. Identifier et soigneusement extérioriser le cecum avec des pinces atraumatic. Placez la poche terminale aveugle du cecum sur l'abdomen qui pointe de manière crânienne.
    3. Une fois extériorisé, garder le cécum humide en utilisant des écouvillons salins chauds en tout temps.
  3. Injection orthotopique, fermeture de l'abdomen et récupération postopératoire
    1. Pour l'injection intracecale, utiliser une seringue standard de 1 ml avec une canule 30 G. Montez cette seringue sur une pompe à micro-injection, qui est à son tour montée sur un micromanipulateur.
    2. Saisissez soigneusement la pointe du cecum avec des pinces atraumatiques et lissez-la doucement en la caressant en avalD avec un deuxième ensemble de pinces humidifié avec une solution salée chaude.
    3. Placez la canule directement au-dessus du cecum.
    4. Effectuez les étapes suivantes sous contrôle visuel avec un microscope chirurgical binoculaire.
    5. Saisissez soigneusement le cecum avec deux pinces atraumatiques aux deux extrémités de la partie extériorisée du cecum, étirez-la légèrement puis tirez lentement sur la canule qui est positionnée parallèlement et directement au-dessus. Il est crucial de ne pas perforer la totalité de la paroi intestinale (en injectant ainsi les cellules dans la lumière) et de ne pas perforer la séreuse au-delà du point de pénétration initial car cela entraînerait une fuite et une diffusion péritonéale.
      1. Déplacez l'intestin vers la canule, pas la canule vers l'intestin. Tenir et étirer l'intestin entre deux pinces. Les mains du chirurgien doivent reposer sur une surface afin de réduire les tremblements.
    6. Injecter les cellules entre la serose (vue comme une doublure très mince et translucide au-dessus de laE les vaisseaux sanguins intra-moraux) et la musculaire. La canule doit donc être placée visuellement au-dessus des vaisseaux sanguins et sous la mince membrane translucide.
    7. Utilisez un interrupteur pour démarrer l'injection afin de réduire le tremblement pendant que la canule est à l'intérieur de la paroi intestinale.
    8. Une fois que la canule est en position, commencer l'injection. Utilisez une durée de 20 s, ce qui entraîne un réglage de 1 μL / s sur l'unité de commande de la pompe.
      REMARQUE: L'injection dans un vaisseau sanguin endommagé ou proche d'elle entraîne une dissémination intravasculaire directe et une métastase à distance et devrait donc être évitée.
    9. Une fois l'injection terminée, retirez soigneusement la canule en la tirant vers l'arrière.
    10. Placez un écouvillon sec sous le cécum, puis rincez soigneusement le cecum avec de l'eau distillée pour lyser les cellules filtrées et ainsi éviter la dissémination artificielle péritonéale.
  4. Fermeture de l'abdomen et récupération postopératoire
    1. Après rEn train de déposer doucement le cecum à la cavité abdominale.
    2. Fermer la paroi abdominale avec des sutures de course 6-0 rapidement absorbables.
    3. Fermez la peau avec des clips chirurgicaux.
    4. Placez la souris sur un plan de chauffage réglé à 38 ° C jusqu'à ce qu'il soit complètement récupéré de l'anesthésie.
    5. Observez de près l'état postopératoire des souris pendant les 48 h suivantes. En cas de détresse, traiter avec 0,05 mg / kg buprénorphine toutes les 12 h.
    6. Surveiller les souris au moins une fois par jour pour détecter les signes de détresse due à la croissance tumorale.

3. Isolation des cellules tumorales circulantes à partir d'échantillons de sang total

NOTE: Obtenez du sang par ponction cardiaque transcutanée chez des souris anesthésiées, suivi d'une euthanasie. Idéalement, 1000 μL de sang sont aspirés dans une seringue préremplie de 100 μl d'anticoagulant (acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) ou héparine). Utiliser un anti-humain-EpCAM (adhésion de cellules épithélialesMolécule) pour identifier les CTC. Cela fonctionne très bien si les lignées cellulaires épithéliales humaines sont utilisées dans le modèle de la souris. Pour d'autres appareils, des anticorps différents peuvent être nécessaires.

  1. L'enrichissement en CTC:
    1. Pré-remplir des tubes de 15 mL avec un milieu gradient de densité de 5 mL et transférer soigneusement le sang dans le tube de 15 mL.
    2. Centrifugeuse (30 min à 300 xg sans frein) et retirez soigneusement le surnageant supérieur.
    3. Versez le reste dans un nouveau tube de 15 ml et centrifugez (15 min, 300 xg avec frein).
    4. Récupérer l'interphase contenant les cellules mononucléaires (jeter le reste) et laver les cellules deux fois avec du PBS.
    5. Remettre en suspension la pastille dans 200 μl de PBS / 1% d'EDTA et ajouter 4 μL d'anticorps EpCAM. Incuber 20 min sur de la glace dans le noir.
  2. Projection et sélection
    1. Préparez le tampon suivant (appelé ci-après tampon de prélèvement): PBS + 10% de sérum de veau foetal (FCS) + 1% de pénicilline / STreptomycine (1%) + 0,8% d'EDTA.
    2. Utilisez un stylo PAP pour dessiner un cercle de ~ 1 cm dans une boîte de Petri stérile de 6 cm (empêche le fluide de se disperser dans le plat) et faites pipeter 700 μL de tampon de prélèvement dans ce cercle.
    3. Ajouter 50 μL de suspension cellulaire au tampon de prélèvement de 700 μL dans le cercle. Vérifiez la densité des cellules au microscope. Divisez l'échantillon dans différentes plats s'il est trop dense.
    4. Attendez que les cellules s'installent (~ 5 min).
    5. Écran de la goutte de suspension cellulaire pour les cellules colorées (= EpCAM-positives).
    6. Une fois qu'une cellule est trouvée, choisissez la cellule avec le micromanipulateur et placez-le dans un tampon de 50 μl en fonction de l'analyse en aval prévue ( p . Ex. , Tampon d'extraction d'ARN ou milieu de culture).
    7. Selon les analyses en aval prévues, isoler les cellules négatives et / ou les médiums par EpCAM comme témoins négatifs.
    8. Procédez avec des analyses en aval ( p . Ex. , Culture cellulaire, PCR).

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Résultats

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La génération réussie et reproductible de tumeurs colorectales dans ce modèle dépend de manière critique d'une injection précise des cellules sans déversement ou fuite. Si cela est atteint, ce modèle est extrêmement fiable et entraîne très rarement une diffusion péritonéale artificielle. La cinétique de croissance des tumeurs ainsi que leurs profils de diffusion dépendent de la biologie des organoïdes et des cellules utilisés. 15 Alors que les cellules HCT116 mett...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malgré leur activité précliniquement prouvée dans les modèles de souris sous-cutanés, la grande majorité des nouveaux composés échouent dans les essais cliniques et n'atteignent jamais la clinique. 11 Cette insuffisance évidente de modèles de souris sous-cutanés pour simuler de manière précise la biologie et les modèles de croissance des tumeurs a conduit au développement de modèles de souris orthotopiques basés sur l'injection de cellules tumorales directement dans l'organe original....

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la fondation allemande de recherche (WE 3548 / 4-1) et Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieux de culture cellulaire et composants
Advanced DMEM F12Invitrogen12634010DMEM/ F12 +++ moyen
HEPES (1 M)Life Technologies GmbH15630056DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM)Life Technologies GmbH35050038DMEM/ F12 +++ medium
Pénicilline/ Streptomycine (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122DMEM/ F12 +++ moyen
DMEMLife Technologies GmbH61965026milieu de base de lignées cellulaires 2D (DMEM/10 % FCS
)Sérum de veau fœtal (FCS)BIOCHROM AGS 0115milieu de base de lignées cellulaires 2D (DMEM/10 % FCS)
TrypLE Tampon de dissociation enzymatique expressLife Technologies GmbH12604021
Matrice à membrane basale Matrigel (BMM, sans rouge de phénol)CORNING B.V. Life Sciences356231
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169
Trypsine-EDTA (0,25 %, Phenol-Red)Life Technologies GmbH25200072
Plaques à 6/48 puits avec couvercleCORNING3516/3548
Flacon de culture cellulaire 75 cm² ;, 250 mLVWR International GmbH734-2066
fiole de culture cellulaire 150 cm² ;, 600 mLCorning B.V. Life Sciences355001
tubes Eppendorf 1,5 mL / 2 mLSarstedt AG & Co.72.706.400/ 72.695.400
Tubes à centrifuger 15 mL, 50 mLGreiner-Bio-One GmbH188271/227270
TC10 Lames de comptage (pour machine de comptage TC20)Bio-Rad Laboratories GmbH1450016
Pipettes Pasteur (verre, 150 mm)Fisher Scientific GmbH11546963/ FB50251finement tirées à l’aide d’un bec Bunsen
gentleDissociateur MACSMiltenyi Biotec130-093-235pour la préparation des tissus tumoraux primaires
MACSmix RotatorMiltenyi Biotec130-090-753pour la préparation des tissus tumoraux primaires
douxMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237pour la préparation des tissus tumoraux primaires
Kit de dissociation des tumeurs humainesMiltenyi Biotec130-095-929pour la préparation
des tissus tumoraux primairesFaucon 70 et micro ; m Cell StrainerCorning B.V. Life Sciences352350pour la préparation de tissus tumoraux
primairesNameCompanyCatalog NumberComments
Surgical Equipment
SevofluraneAbbVie Germany GmbH & Co. KG-Oxygène
médicalAir Liquide Medical
Temgesic-Bepanthen
- pommade ophtalmiqueBayer Vital GmbH10047757
Saline normale 0,9 % (E154)Serumwerk Bernburg AG10013
Aqua ad injectabiliaBraun235144
Seringue de 1 mL (sans volume mort) - Injekt-F SOLOBraun/neoLab194291661
aiguille d’injection 30GBECTON DICKINSON304000
écouvillons en celluloseLohmann & Rauscher Deutschland13356
Pince Micro-AdsonFST - Outils de science fine11018-12
Ciseaux à iris - ToughCutFST - Outils de science fine14058-11
Olsen-Hegar Porte-aiguilleFST - Outils de science fine12002-12
Kit AutoClipFST - Outils de science fine12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (chirurgical suture)Johnson & Johnson Medical GmbHZ1012H
Appareil d’anesthésie de recherche de table sans chasse d’eau O2 et vaporisateur de sévofluranePompe UltraMicro Parkland ScientificV3000PS/PK
avec contrôleur Micro4World Precision InstrumentsÉquipement UMP3-4pour injection orthotopique hautement contrôlée
Pédale pour contrôleur SYS-Micro4World Precision Instruments15867Équipement pour l’injection orthotopique hautement contrôlée
Micromanipulateur manuel à trois axesWorld Precision InstrumentsM325Équipement pour l’injection orthotopique hautement contrôlée
Support magnétique pour micromanipulateurWorld Precision InstrumentsM10Équipement pour l’injection orthotopique hautement contrôlée
Plaque de base en acier pour M10 Support magnétiqueWorld Precision Instruments5479équipement pour l’injection orthotopique hautement contrôlée
Hot Plate 062Labotect13854
Isis - Rasoir à cheveuxAESCULAP -
Parkland ScientificVS-2Z
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
CTC isolation
EDTARoth8040.1
Gradient de densité medium &ndash ; FicollStemCell - Lymphoprep7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Clone d’anticorps 9C4BioLegend324210
Alexa Fluor 488 anti-souris CD326 (EpCAM) Clone d’anticorps G8.8BioLegend118210
Boîte de Pétri, ø ; 60 x 15 mm, 21 cm² ;, VentGreiner bio-one628102
Microscope de culture cellulaire à fluorescenceLeica
Transferman 4rEppendorf
CellTram AirEppendorfconnectée au micromanipulateur
Dmz Universal Microelectrode PullerDagan Corporationnécessaire pour la fabrication de microcapillaires pour l’aspiration unicellulaire
Prism Glass CapillariesDagan Corporation
Stylo PAPAbcamab2601
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169tampon de cueillette
Sérum de veau fœtal (FCS)BIOCHROM AGS 0115Tampon de cueillette
Pénicilline/Streptomycine (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122tampon de cueillette
EDTARoth8040.1tampon de prélèvement
NomEntrepriseNuméro de catalogue<strong>Comments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) clone d’anticorps 9C4BioLegend324201EpCAM immunohistochemistry (cf, fig. 2C)
HRP lapin anti-souris IgGAbcamab97046EpCAM immunohistochimie (cf, fig 2C)
GmbH-Buprénorphine Microscope chirurgical binoculaire Braun Micromanipulateur Pompe d’aspiration

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201(2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82(2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484(2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107(2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).

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Injection de cellules tumoralesInjection c caleCentrifugation sur gradient de densitIsolation des CTCTechnique chirurgicaleM tastase tumorale

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