Extractions séquentielles de sels pour l’analyse de la chromatine en vrac, lier des propriétés de la chromatine modification Complexes

Summary

Sequential extraction du sel de protéines chromatiniennes lié est un outil utile pour déterminer les propriétés de liaison de complexes protéiques importantes. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer le rôle des sous-unités individuelles ou des domaines de l’affinité globale d’une protéine complexe en bloc de la chromatine.

Abstract

Élucider les propriétés de liaison de ciblage de la chromatine des protéines peut être très difficile en raison de la nature complexe de la chromatine et l’hétérogénéité des mammifères plus complexes modification de la chromatine. Afin de surmonter ces obstacles, nous avons adapté un test d’extraction séquentielle du sel (SSE) permettant d’évaluer les affinités de liaison relative de la chromatine lié aux complexes. Ce dosage facile et simple peut être utilisé par des non-spécialistes pour évaluer la différence relative affinité de deux complexes apparentés, les changements dans l’affinité d’un complexe quand une sous-unité est perdue ou d’un domaine individuel est inactivé et le changement de affinité de liaison après modification du paysage de la chromatine. Séquentiellement, re-suspension en vrac la chromatine en augmentant les quantités de sel, nous sommes en mesure de profil l’élution d’une protéine particulière de la chromatine. À l’aide de ces profils, nous sommes en mesure de déterminer l’incidence des altérations dans un complexe de modification de la chromatine ou modifications de l’environnement de la chromatine sur des interactions de liaison. SSE de couplage avec d’autres dosages in vitro et in vivo , nous pouvons déterminer les rôles des domaines individuels et des protéines sur les fonctionnalités d’un complexe à une variété d’environnements de chromatine.

Introduction

Règlement de l’ADN dans les cellules eucaryotes est un système complexe et sophistiqué qui est étroitement contrôlé par un assortiment de protéines que coordonner les réactions aux stimuli intracellulaires et extracellulaires. ADN est enroulé autour d’histone octamères aux nucléosomes forme, qui peuvent être plus ou moins répartis le long de l’ADN ou compactés en serpentins serré¹. Cet arrangement structurels de l’ADN et les histones est connu comme la chromatine, qui est régulée par un réseau de protéines que lire, écrire et effacer les modifications post traductionnel (PTM) histones². Certaines histones SPTM, tels que l’acétylation, changer la charge de l’acide aminé, ils sont déposés sur, modifier les interactions entre les histones et ADN². Histone SPTM service aussi à recruter des régulateurs transcriptionnels, rénovateurs de la chromatine, machines de réparation des dommages ADN et machinerie de réplication de l’ADN à des régions spécifiques du génome³.

La plupart des méthodes pour étudier les interactions de la chromatine soit sonder les interactions à petite échelle ou impliquent de grandes analyses Génome-large. Études in vitro de liaison utilisent souvent des domaines individuels recombinants peptides histone ou ADN dans les essais comme les essais de déplacement de mobilité électrophorèse (EMSA), la calorimétrie isotherme de titration, polarisation de fluorescence et peptide pulldowns. Parce que ces tests se concentrent généralement sur un domaine de protéines individuelles, ils facilitent la compréhension d’un petit morceau du puzzle, mais ne nous permettent pas de comprendre la nature coopérative de protéines multi-domaine, sans parler de leur rôle en multi-protéines complexes. Une autre couche de complexité est ajoutée par la composition hétérogène de mammifères plus complexes modification de la chromatine. Cette hétérogénéité de protéine, en combinaison avec le caractère dynamique du paysage la chromatine, rend difficile de récapituler in vivo liant les interactions des protéines chromatiniennes à chromatine in vitro.

Méthodes in vivo ont fait des progrès considérables ; Cependant, ils sont souvent coûteux, chronophages et techniquement difficiles. Immunoprécipitation de la chromatine suivie par séquençage (ChIP-seq) est très utile pour déterminer la localisation des protéines et des modifications d’histone au sein du génome, mais il nécessite une optimisation importante⁴. Les protéines sont souvent réticulé à la chromatine de préserver des interactions ; Toutefois, cela peut produire des interactions artificielles et peut causer épitope masquant⁵. En outre, l’immunoprécipitation (IP) exige des anticorps hautement spécifiques et vaste optimisation des ADN cisaillement IP conditions par ChIP-qPCR en utilisant un site de liaison connue, ce qui n’est souvent pas disponible a priori. Après l’optimisation des conditions de la puce, traitement des échantillons est coûteuse et nécessite quelques semaines ou mois de séquencer et d’analyser. Bien que cette méthode est précieuse pour identifier la localisation de la chromatine lié protéines au sein du génome, le coût et engagement en temps rendre prohibitifs pour utiliser cette méthode pour générer des hypothèses sur comment les petits changements peuvent affecter des propriétés de liaison de global .

Dans cet article, nous décrivons comment un test d’extraction séquentielle du sel (SSE) peut être utilisé pour examiner les profils de liaison globale des protéines liées à la chromatine et distinguer comment des changements dans un profil PTM protéine complex ou global peuvent modifier les interactions. Bien que les extractions sels sont une technique couramment et largement utilisée, nous démontrons comment cette méthode séquentielle est hautement reproductible et polyvalent. SSE permet de caractériser la façon dont une seule sous-unité d’un immeuble ou même un seul domaine contribue à affinité globale du complexe de la chromatine globale. SSE permet également de déterminer si la liaison d’une protéine est influencée par les changements dans le paysage de la chromatine, fournissant des hypothèses intéressantes pour histone marque ciblant qui peuvent être confirmés à l’aide de ChIP-seq et autres études large de génome.

Nous avons initialement adapté cette méthode de Wu et al., d’examiner la fonction de Polybromo1 (PBRM1) dans la liaison de la PBAF la chromatine rénovateur^6,7. En utilisant cette technique, nous avons déterminé le rôle de PBRM1 pour la liaison de la chromatine dans la chromatine PBAF complexe de remodelage et ensuite déterminer la contribution relative des six BROMODOMAINES individuels à cette fonction⁷.

Nous décrivons ici comment optimiser cette méthode pour explorer la liaison de la chromatine dans différents types de cellules, pour évaluer l’affinité relative de chromatine semblable modification complexes, afin d’examiner le déplacement d’une protéine de la chromatine par un inhibiteur chimique, et pour déterminer les effets de la liaison de la chromatine après modification du paysage de la chromatine.

Protocol

1. préparations

1. préparer 100 mL d’une solution hypotonique tampon AR. : 0,3 M saccharose, KCl 60 mM, 60 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA et 0,5 % NP-40. Conserver à 4 ° c.
   Remarque : Certaines lignées cellulaires, tels que HEK293T, nécessitent des conditions moins strictes de lyse. Si les noyaux lyse facilement, utiliser modification tampon A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl ₂, 0,05 mM EDTA, 0,1 % NP-40 et 10 % de glycérol.
2. Préparer une solution 250 mL de solution de 2 x mRIPA : 100 mM Tris pH 8,0, désoxycholate de sodium 2 % NP-40 et 0,5 %.
3. Préparer une solution de 5 M de NaCl 100 mL.
4. à l’aide de la x mRIPA et les solutions de 5 M de NaCl, 2 préparer 50 mL de solution de x mRIPA 1 pour chacune des six concentrations sels : 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM et 500 mM NaCl. Avant de commencer l’expérience, refroidir toutes les solutions sur glace
5. Grow cell lines dans conditions souhaitées.
   Remarque : Pour déterminer les effets de faire tomber une protéine, SSE pour la ligne de coup de masse doit être comparée aux cellules de type sauvage. Ces SSE doit être exécutés en parallèle. Pour obtenir des exemples utilisant des inhibiteurs chimiques ou des stimuli, reportez-vous aux sections 3-5.

2. Base Extraction séquentielle du sel

1. récolte 8 millions de cellules de chaque État et laver deux fois avec 5 mL de PBS froid glace.
   Remarque : Il est essentiel de disposer d’un nombre égal de cellules présentent des concentrations de protéines équivalente. Le nombre exact de cellules devrez peut-être être optimisé pour les lignées de cellules individuelles ou des protéines particulières. Il est important de ne pas avoir trop, car l’augmentation des concentrations de protéines va empêcher l’observation de la courbe de l’élution, qui dépend de la liaison de l’équilibre. Toutefois, avec trop peu de cellules il y a peut-être pas suffisamment de protéines pour détecter la courbe et le culot de la chromatine est plus difficile à isoler et peut être perdu entre fractions.
2. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampons A + inhibiteurs de la protéase, transvaser dans des tubes à centrifuger micro 1,5 mL et tournent dessus plus bas à 4 ºC pendant environ 10 minutes
3. Isoler les noyaux par centrifugation à 6000 x g pendant 5 min à 4 ° c.
   NOTE : Après cette étape de l’enveloppe nucléaire soit encore intact. Si l’enveloppe nucléaire est intact, le culot va remettre en suspension entièrement ; Cependant, quand l’enveloppe est lysé et la chromatine est libérée, le pellet ne sera pas remettre en suspension. Si l’enveloppe nucléaire n’est pas intacte après incubation de tampons A, utilisez modifié tampon A.
Inhibiteurs de la
4. Ajouter 200 µL de mRIPA 0 mM NaCl + protéase à chaque boulette de noyaux avant de re-suspendre pellet. Homogénéiser chaque échantillon de pipetage 15 fois avec une pipette de 1 mL. Le culot doit réactiver facilement, cependant, les noyaux lyseront car il est reversé, et l’échantillon deviendra épaisse et collante et difficile à pipeter.
   1. Afin d’élaborer le culot dans la pointe, tapez sur le bout de l’embout de la pipette contre le fond du tube à centrifuger. Les granulés se dissoudront pas entièrement une fois que l’ADN est libéré par les noyaux, mais pipetage il cassera vers le haut
5. Lorsque tous les échantillons ont été homogénéisés, Incuber tous les échantillons sur glace pendant 3 min.
   Remarque : Le temps d’incubation devrez peut-être être optimisée en fonction de la protéine d’intérêt.
6. Pellet isolat de la chromatine en centrifugeant les échantillons pendant 3 min à 6500 x g à 4 ° c.
7. Transfert surnageant dans une centrifugeuse propre 1,5 mL tube. Il s’agit de la fraction de 0 mM. Cette solution de mRIPA 0 mM peut agir comme un pas de lavage à la lyse des noyaux et supprimer tout protéines lâches ne pas associées à la chromatine.
Inhibiteurs de la
8. Ajouter 200 µL de mRIPA 100 mM NaCl + protéase à chaque boulette de chromatine avant de re-suspendre pellet. Briser le culot de la chromatine en pipettant également, le culot et descendre 15 fois.
   Remarque : Il est essentiel d’être cohérent avec le nombre de fois le culot en éjectant.
9. Incuber sur glace pendant 3 min. Cette étape d’incubation permet à tous les échantillons d’atteindre un état d’équilibre, qui est particulièrement important lorsqu’il y a plusieurs échantillons.
10. Centrifugeuse à 6500 x g pendant 3 min à 4 ºC et transférez surnageant dans un tube propre de 1,5 mL.
11. Répéter 2.6-2.10 pour les autres concentrations salines.
    Remarque : Après 400 mM NaCl, mRIPA le culot doit être claire et gloopy et ne restera pas au fond du tube. Le plomb peut être placé dans le couvercle de la tube à centrifuger pendant le surnageant isolé.
12. Ajouter 70 µL de 4 x chargement protéine teindre à chaque fraction et charger 30 µL de chaque fraction sur un gel d’acrylamide SDS pour analyse par western blot.
    Remarque : Pour déterminer le profil de liaison de la protéine, il est essentiel de charger des volumes équivalents de concentrations de lysat, plutôt que de charger des protéines égale.
13. Effectuer un transfert western standard par le transfert sur une membrane et d’utiliser des anticorps primaires pour des protéines d’intérêt.
14. Pour doser la protéine éluée de la chromatine, incuber la tache en anticorps secondaires de fluorescence infrarouge IRDye et tache d’image avec un imageur. Alors que les autres méthodes de développement peuvent être utilisées, nous vous recommandons de fluorescence ou l’imagerie infrarouge, car c’est plus de nature quantitative.
15. Utilisation ImageJ ou un logiciel similaire pour calculer l’intensité pour la protéine éluée à chaque concentration de sel. En traçant la courbe l’intensité de la bande contre la concentration de sel, le profil d’élution de votre protéine d’intérêt peut être déterminé.

3. Sequential Extraction du sel en présence d’un " lecteur " inhibiteur

1. récolter les deux ensembles de cellules (4 millions) et d’isoler les noyaux comme un SSE standard.
2. Remettre en suspension les deux ensembles dans 200 µL de mRIPA 0 mM NaCl et incuber pendant 3 min. Cela permettra la suppression de toute protéine libre dans les noyaux.
3. Ajouter 200 µL mRIPA 0 mM NaCl pour chaque boulette. Ajouter l’inhibiteur (2 µL de 1 mM (+) JQ1) à un échantillon et DMSO à l’ensemble de la commande.
4. Agiter le culot de pipetage 15 fois et incuber sur glace pendant 5 min.
5. Centrifugeuse à 6500 x g pendant 3 min à 4 ºC et transférez surnageant dans un tube propre de 1,5 mL.
6. Répétez 3.3-4 pour toutes les concentrations de sels et d’effectuer un transfert western standard.

4. Sequential Extraction du sel en présence d’un " écrivain " inhibiteur

1. traiter les cellules avec l’inhibiteur (10 µM SAHA) ou le DMSO pendant 3 h
2. Récolte 4 millions de cellules pour chaque traitement.
3. Effectuer un SSE standard pour les échantillons avec l’inhibiteur ajouté à tous les tampons.

5. Sel Sequential Extraction suivant DNA Damage

1. traiter les cellules avec 1 doxorubicine µM pour 1 h.
2. Modifier les médias sur les cellules et leur permettre de récupérer pendant 3 h.
3. Récolte 8 millions de cellules et d’effectuer la base SSE.

6. Extraction du sel non séquentiel

1. récolter 12 millions de cellules et laver avec du PBS.
2. Diviser les cellules afin qu’il y a 2 millions de cellules par tube à centrifuger micro.
3. Remettre en suspension dans 500 µL de tampons A et incuber pendant 10 min.
4. Isoler les noyaux par centrifugation à 6000 x g.
5. Une nouvelle suspension pastilles dans un 200 µL de chacune des tampons mRIPA + NaCl.
6. Homogénéiser chaque échantillon de pipetage 15 fois avec une pointe de pipette de 1 mL.
7. Incuber sur glace pendant 3 min.
8. Isoler la chromatine par centrifugation à 6500 x g et transférer le surnageant pour nettoyer les tubes. Ajouter 70 µL de colorant de chargement et exécuter 30 µL sur un gel SDS-page pour analyse par western blot.

Results

Dans cet article, nous montrons les avantages et les applications de la méthode d’extraction du sel séquentielle couramment utilisés (SSE) que nous nous sommes adaptés de la littérature⁶. Dans la Figure 1, on compare la reproductibilité du SSE pour extraire des protéines non séquentielle en détectant les profils d’élution des ARID1a et PBRM1. Nous observons constamment que ARID1a, une sous-unité de la BAF, élue surtout à 200 mM NaCl et...

Discussion

Caractérisation des interactions de protéine et la chromatine par extractions sels est une méthode commune qui a été employée pendant des décennies^14,15; Toutefois, il n'a pas été systématiquement optimisée avant de révéler son utilité complète. Nous montrons comment cette méthode séquentielle fournit un moyen rapid et peu coûteux de distinguer les changements dans la liaison de la chromatine, lorsque la protéine ou l’environnement est modifié. SSE est très adapt...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorure de sodium, cristal 2,5 kg AR (ACS)	Avantor/Macron	7581-06
saccharose, cristal 500 g AR¨ ; (Crédit : ACS)	Avantor/Macron	8360-04
Chlorure de potassium, granulaire 500 g AR¨ ; (Crédit : ACS)	Avantor/Macron	6858-04
Base Trizma(R), étalon primaire et tampon, >=99,9 % (titrage), cristallin	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
EDTA (Ethylenedinitrilo) Acide tétraacétique, sel disodique, dihydraté 125 G AR (ACS)	Avantor/Macron	4931-02
NONIDET P-40 SUBSTRAT, 100mL UN3082	Amresco	E109-100ML
HEPES Buffer solution (1M)	Gibco	15630-080
chlorure de magnésium, 6-hydrate, cristal 500 g AR¨ ; (Crédit : ACS)	Avantor/Macron	5958-04
GLYCÉROL, 1L	Amresco	0854-1L
SEL DE SODIUM D’ACIDE DÉSOXYCHOLIQUE, 100g	Amresco	0613-100G
Pipette Eppendorf Research plus	Fisher Scientific	13-690-032
Eppendorf 5424 R microcentrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	5424 R
Souris secondaire IgG HRP	Signalisation cellulaire	7076
IgG secondaire de lapin Signalisation cellulaire liée à HRP		7074
Anticorps BMI-1 Anticorps	Millipore
PBRM1 Anticorps	Bethyl	A301-591A
ARID1a Anticorps	Santa Cruz	sc-32761
BRD4 Anticorps	Bethyl	A301-9852a
(+) JQ1	Cayman Chemical Company	11187
SAHA	Cayman Chemical Company	10009929
Doxorubicine	AK Scientific	25316-40-9
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Macron	4948-02
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
Mini Réservoir de Gel	ThermoFisher	A25977
Albumine bovine (BSA)	Amresco	0332-100g	Utilisé comme solution à 5 % dans le PBS-T comme solution bloquante pour les Western blots
Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	B0001
Bolt LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus Échelle de protéines précolorées, 10 à 250 kDa	ThermoFisher	26619
Methyl Alcool, anhydre	Macron	3041-10
Trypsine kEDTA, 1X	Cellgro	25-053-CI
SODIUM AZIDE, 250g UN1687	Amresco	0639-250G
SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325	Amresco	0227-500G
Glycine, pour électrophorèse, >=99 %	Sigma-Aldrich	G8898-1kg
BigTop Tubes de microcentrifugation, polypropylène	VWR	20170-333
1000 µ ; L Pointes de pipette	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris Gels préfabriqués 4-12 %	Invitrogen	NW04125BOX
Hémisulfate de lupeptine, 5 MG	RPI Research Products	22035-0.005	Utilisé pour la solution inhibitrice de protéase.
APROTININE, 10 MG	RPI Research Products	20550-0.01	Utilisé pour la solution inhibitrice de la protéase.
PEPSTATINE A, 5 MG	RPI Research Products	30100-0.005	Utilisé pour la solution d’inhibiteur de protéase.
OVCA429 cellules	Don de Karen Cowden Dahl. Ph.D.
HEK293T	ATCC	CRL-3216
HeLa cellules	ATCC	CCL-2
McCoy’s 5A media	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
Minimum Essential Medium (MEM), Poudre	Corning Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA (100X) acide aminé non essentiel	Gibco	11140-050
FB-11 : Sérum de veau fœtal, États-Unis Source	Omega Scientific	FB-11
Pénicilline-Streptomycine Solution	Life Technologies	15140-122
Glutamax	Life Technologies	35050-061
Pyruvate de sodium	Life Technologies	11360070
VWR Power Source	VWR	13-690-032