Contrôlable Expression Ion canal par transfection transitoire inductible

Matan Geron; Adina Hazan; Avi Priel

doi:10.3791/55370

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Article de méthode

Contrôlable Expression Ion canal par transfection transitoire inductible

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DOI :

10.3791/55370

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17 février 2017

Matan Geron^*¹ , Adina Hazan^*¹ , Avi Priel¹

¹The Institute for Drug Research (IDR), School of Pharmacy, Faculty of Medicine, The Hebrew University of Jerusalem (HUJI)

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Étudier les canaux ioniques à travers un système exprimant de manière hétérologue est devenue une technique de base dans la recherche biomédicale. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode efficace de temps pour obtenir l'expression du canal ionique étroitement contrôlé en effectuant une transfection transitoire sous le contrôle d'un promoteur inductible.

Résumé

La transfection, la délivrance d'acides nucléiques étrangers dans une cellule, est un puissant outil pour la recherche de protéines. Grâce à cette méthode, les canaux ioniques peuvent être étudiés par analyse électrophysiologique, la caractérisation biochimique, des études mutationnelles et leurs effets sur les processus cellulaires. Des transfections transitoires proposent un protocole simple dans lequel la protéine est disponible pour l'analyse au bout de quelques heures à quelques jours. Bien que cette méthode présente un protocole efficace relativement simple et le temps, l'un des éléments essentiels est l'étalonnage de l'expression du gène d'intérêt à des niveaux pertinents physiologiques ou des niveaux qui sont adaptés à l'analyse. A cet effet, de nombreuses approches différentes qui offrent la possibilité de contrôler l'expression du gène d'intérêt sont apparus. Plusieurs protocoles de transfection de cellules stables constituent un moyen d'introduire de façon permanente un gène d'intérêt dans le génome cellulaire sous la régulation d'une transcriptase tétracycline contrôléeactivation tional. Bien que cette technique produit des niveaux d'expression fiables, chaque gène d'intérêt nécessite quelques semaines de travail qualifié y compris l'étalonnage d'une courbe de mise à mort, la sélection des colonies de cellules, et dans l'ensemble plus de ressources. Ici, nous présentons un protocole utilisant une transfection transitoire de l'élément de potentiel sous-famille V du canal de cation 1 (TRPV1), le gène transitoire de récepteur dans un système inductible comme un moyen efficace pour exprimer une protéine de manière contrôlée ce qui est essentiel dans l'analyse du canal ionique. Nous démontrons que l'utilisation de cette technique, nous sommes en mesure d'effectuer l'imagerie calcique, cellules entières, et l'analyse de canal unique avec des niveaux de canaux contrôlés requis pour chaque type de collecte de données avec une seule transfection. Dans l'ensemble, cela fournit une technique réplicable qui peut être utilisée pour étudier les canaux ioniques structure et fonction.

Introduction

Systèmes exprimant hétérologue est l' une des techniques les plus couramment utilisées pour étudier une multitude de fonctions cellulaires ^1. Leur faible profil endogène des protéines, un minimum d'entretien, la croissance fiable, et la capacité de prendre et d' exprimer l' ADN étranger ont fait des lignées cellulaires telles que rein embryonnaire humain (HEK293) et ovaire de hamster chinois (CHO) presque indispensable à la recherche biologique ^{^2,} ^3. Les domaines de recherche en utilisant des systèmes hétérologues comprennent des protéines membranaires, la signalisation....