La modélisation du développement du cerveau humain a été entravée en raison de la complexité sans précédent du tissu épithélial neural. Ici, une méthode de génération robuste d’organoïdes cérébraux pour délimiter les événements précoces du développement du cerveau humain et modéliser la microcéphalie in vitro est décrite.
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Article de méthode
Génération de iPSC dérivés du cerveau humain organites au Modèle des troubles du développement neurologique précoce
Dans cet article
Résumé
Résumé
La disponibilité limitée de modèles in vitro appropriés capables de représenter de manière fiable le développement complexe du cerveau humain est un goulot d’étranglement important qui limite la traduction de la recherche fondamentale sur le cerveau en application clinique. Alors que les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) ont remplacé les cellules souches embryonnaires humaines éthiquement discutables, les études de différenciation neuronale basées sur les iPSC restent descriptives au niveau cellulaire mais ne parviennent pas à fournir de manière adéquate les détails qui pourraient être dérivés d’un tissu cérébral humain complexe en 3D.
Cette lacune est maintenant comblée par l’application d’organoïdes cérébraux 3D dérivés d’iPSC, « Brains in a dish », qui modélisent de nombreuses caractéristiques du développement complexe du cerveau humain. Ici, une méthode de génération d’organoïdes cérébraux 3D dérivés d’iPSC est décrite. Les organoïdes peuvent aider à modéliser la microcéphalie primaire autosomique récessive (MCPH), un trouble neurodéveloppemental humain rare. Une explication largement acceptée de la malformation cérébrale dans la MCPH est un épuisement du pool de cellules souches neurales au cours des premiers stades du développement du cerveau humain, un défaut de développement difficile à recréer ou à prouver in vitro.
Pour étudier la MCPH, nous avons généré des iPSC à partir de fibroblastes dérivés de patients porteurs d’une mutation dans la protéine centrosomale CPAP. En analysant la zone ventriculaire d’organoïdes cérébraux 3D de microcéphalie, nous avons montré la différenciation prématurée des progéniteurs neuraux. Ces organoïdes cérébraux 3D sont un puissant système in vitro qui jouera un rôle déterminant dans la modélisation des troubles cérébraux congénitaux induits par des produits chimiques neurotoxiques, des infections virales neurotrophiques ou des mutations génétiques héréditaires.
Introduction
troubles neurodéveloppementaux humains, tels que microcéphalie, ne peuvent être mal étudiés dans des modèles animaux en raison du fait que les cerveaux humains ont une surface corticale étendue, une caractéristique unique différent des animaux non humains.
Cet aspect rend le développement du cerveau humain un processus complexe qui ne peut pas être suffisamment étudié dans une 2D, système in vitro de culture cellulaire. Nouvelles techniques de culture 3D permettent la génération d'organites analogue à un tissu à partir de cellules souches pluripotentes induites (CISP). La différenciation des cellules souches pluripotentes dan....
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Protocole
1. Génération du cerveau organites (23 jours)
- Initiation de neuroectoderme (5 jours)
REMARQUE: Les points suivants doivent être pris en considération avant le début de la différenciation. La méthode de reprogrammation (lentiviral-, sendai-virus-, épisomiques ou etc. , selon microARN) pour obtenir CSPi humaines devrait idéalement être la même pour tous les patients et le contrôle des lignes iPSC. Divers kits de reprogrammation et instructions basées sur des protocoles publiés sont disponibles 15, 16, 17,
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Résultats
La génération des organites du cerveau nécessite au moins trois semaines de culture en continu (Figure 1A). Pour obtenir des résultats reproductibles, nous recommandons que le chercheur documente toutes les étapes et, surtout, évite toute modification concernant les composants du milieu, des points de temps, et la manipulation des cellules. Nous donnons ici un résumé de la façon d'évaluer si les étapes critiques sont atteints afin d'obtenir organites de qualité s.......
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Discussion
MCPH est un trouble neurodéveloppemental complexe humain qui ne peut être récapitulé dans des modèles animaux in vivo ou dans un langage simple culture de cellules humaines approche in vitro. La manifestation clinique de MCPH commence à apparaître au cours du premier trimestre, lorsque la neurogenèse précoce commence. Ainsi, organites du cerveau 3D représentent un système expérimental fiable pour modéliser le développement MCPH. De plus, 3D organites du cerveau humain sont une approche idéale car i) il.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Nous sommes reconnaissants à l'installation d'enrobage des tissus et l'installation de base de microscope de CMMC. Nous sommes reconnaissants pour les discussions et le soutien technique fourni par les membres du Laboratoire de biologie Centrosome et cytosquelette. Nous remercions Li Ming Gooi pour la relecture du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Anti-souris 488 | Invitrogen | A-11001 | Anticorps secondaire anti-IgG de souris (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 488 |
| Anti-lapin 647 | Invitrogen | A-21245 | Anticorps secondaire anti-IgG de lapin (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B anticorps polyclonal de lapin ; |
| Système CELLSPIN | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4&prime ;,6-Diamidino-2-phenylindole dichlorhydrate ; plusieurs fournisseurs |
| DMEM/F-12 | Gibco, États-Unis | 31331093 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium : Mélange de nutriments F-12 ; |
| Dorsomorphine | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C ; plusieurs fournisseurs |
| Milieu d’enrobage | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol ; milieu d’enrobage ; plusieurs fournisseurs |
| Matrice Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) | Corning | 354277 | Matrigel matrice qualifiée hESC ; important : qualifié hESC |
| Gélatine de poisson ; | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gélatine provenant de peau de poisson d’eau froide ; plusieurs fournisseurs ; autoclave après ajout au PBS pour dissoudre et stériliser, stocker à 4 ° ; C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine pour la biologie moléculaire ; fournisseurs multiples ; |
| Boucle d’inoculation avec aiguille, jetable (1 & micro ; L) | Sigma Aldrich, États-Unis | BR452201-1000EA | plusieurs fournisseurs ; |
| Insuline | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | fournisseurs multiples |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM) ; milieu de différenciation neurale |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM solution d’acides aminés non essentiels (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Kit de détection de mycoplasmes ; plusieurs fournisseurs |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal anticorps (4D11) |
| Paraformaldéhyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4 % en PBS, solution de magasin à -20 ° ; C; Attention : Portez une protection cutanée et oculaire et travaillez sous la cagoule |
| PBS | comprimés Gibco, US | 18912014 | Voir le fabricant´ ; ; plusieurs fournisseurs |
| Pénicilline-Streptomycine (10.000 U/mL) | Gibco, États-Unis | 15140122 | Plusieurs fournisseurs Solution |
| poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Fournisseurs multiples |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentine (Ser55) mAb |
| Reagent A ; | Technologies des cellules souches | # 05872 | Note relative au Protocole 1.1.1.2 ; ReLSR (réactif de sélection et de passage des cellules ES et iPS humaines sans enzymes) ; Veuillez suivre manufactorer´ ; ; produits alternatifs de plusieurs fournisseurs disponibles |
| Réactif B ; | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | La solution d’accutase est une solution enzymatique pour la dissociation de cellules uniques ; plusieurs fournisseurs ; protocole 1.1.2 « solution de dissociation de cellules enzymatiques » ; |
| Recherche Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S Fournisseurs | multiples |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | |
| Fournisseurs multiples Fiole tournante 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Fournisseurs multiples |
| Superfrost ultra plus lames de microscope Thermo | scientific, US | J3800AMNZ | Les lames doivent être étiquetées avec un « + » et chargées positivement |
| Supplément 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplément (100x) |
| Supplément 2 sans vitamine A | Gibco, US | 12587010 | supplément B-27 (50x), moins la vitamine A ; plusieurs fournisseurs |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | fournisseurs |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Fournisseurs multiples |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Fournisseurs multiples |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | &beta ;-Tubulin III (polyclonal de lapin) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Système fluorométrique TUNEL |
| Tween 20 pour la biologie moléculaire | AppliChem | A4974,0500 | Plusieurs fournisseurs |
| de feuille imperméable | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm " M”; fournisseurs multiples |
| Y-27632 ; | Selleckchem.com | S1049 | (Y-27632 2HCL) ; |
| plusieurs fournisseurs & bêta-mercaptoéthanol | Gibco, États-Unis | 31350010 | 2-mercaptoéthanol (50 mM) ; plusieurs fournisseurs |
Références
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Na....
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Réimpressions et autorisations
