L'incubation prolongée de aiguë Neuronal tissus pour électrophysiologie et Calcium-imagerie

Résumé

Une fois sorti du corps, le tissu neuronal est fortement influencée par les conditions environnementales, ce qui conduit à une dégradation éventuelle du tissu après 6 à 8 heures. En utilisant une méthode d'incubation unique, qui surveille de près et régule l'environnement extracellulaire du tissu, la viabilité des tissus peut être considérablement prolongée pour> 24 h.

Résumé

Aiguë des préparations de tissus neuronaux, des tranches de cerveau et wholemount rétinienne, ne peuvent généralement être conservés pendant 6-8 heures après dissection. Cela limite la durée de l'essai, et augmente le nombre d'animaux qui sont utilisés pour l'étude. Cette limitation spécifiquement les impacts des protocoles tels que l'imagerie calcique qui nécessitent une pré-incubation prolongée avec des colorants de bain appliqués. la croissance bactérienne exponentielle dans les 3 - 4 h après le découpage en tranches est étroitement corrélée avec une diminution de la santé des tissus. Cette étude décrit un procédé pour limiter la prolifération des bactéries dans les préparations aiguës pour maintenir le tissu neuronal viables pendant des périodes de temps prolongées (> 24 h) sans avoir recours à des antibiotiques, des procédures stériles ou milieux de culture tissulaire contenant des facteurs de croissance. Par un cycle du fluide extracellulaire par irradiation UV et de maintenir le tissu dans une chambre de maintien de la commande à 15 - 16 ° C, le tissu ne montre aucune différence dans les propriétés électrophysiologiques, ou si de calciumgnaling par des colorants de calcium intracellulaire à> 24 h postdissection. Ces méthodes ne seront pas seulement prolonger le temps expérimental pour ceux qui utilisent le tissu neuronal aigu, mais permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation des objectifs expérimentaux, et établira une norme d'or pour l'incubation de tissu neuronal aiguë.

Introduction

Électrophysiologie et d'imagerie fonctionnelle (calcium, tension colorants sensibles) sont deux des techniques expérimentales les plus couramment utilisés dans les neurosciences. Casse des préparations de tranche et wholemount rétinienne, qui sera examiné ici, fournissent un moyen d'examiner les propriétés électrophysiologiques et la connectivité synaptique sans contamination par des anesthésiques ou des relaxants musculaires. Des tranches de cerveau et de la rétine wholemount conservent leur intégrité structurelle, à la différence des cultures ou des homogénats cellulaires, permettant l'étude des circuits spécifiques et des réseaux cérébraux ^1. Les enregistrements de tissu isolé présentent des avantages par rapport aux enregistrements in vivo que les mouvements associés au rythme cardiaque et la respiration sont éliminés. De plus, la visualisation directe permet à des classes spécifiques de cellules à cibler, et l' application locale d'outils pharmacologiques ^{2, 3.}

enregistrements de patch-clamp et calcium colorant chargement dans wholemount rétinienne est compliquée par l'existence de l'Inner Limitation de la membrane (ILM), qui couvre la couche rétinienne Ganglion cellulaire (RGC) et empêche l'accès direct aux cellules. Typiquement, cette membrane est gratté avec une pipette en verre pour permettre une application directe d'une pipette de patch et la formation d'un joint d'étanchéité gigaohm sur une seule cellule. En outre, les colorants de calcium bain appliquée ne traversent pas la ILM et doivent soit être injectés sous cette membrane ^4, rétrogressivement transporté après l' injection au niveau du nerf optique ⁵ ou électroporation à travers le tissu ^6. En outre, lorsqu'on utilise un modèle de rongeur de la rétinite pigmentaire, le rd / rd souris, la MLI est plus épaisse et plus impénétrable. Ici, nous utilisons une technique pour éliminer l'ILM à la digestion enzymatique ^7, pour permettre à la fois du calcium omniprésent colorant chargement, et un accès direct à des cellules ganglionnaires de la rétine pour patch-clamp recordings ^8.

enregistrements réussis provenant soit des tranches de cerveau ou wholemount rétinienne dépendent de la dissection et l'incubation du tissu neuronal viable. Typiquement, le tissu est extrait le matin de l'expérience et mis en incubation dans le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF) jusqu'à ce qu'il soit utilisé pour l'enregistrement. En général, le tissu reste viable pour les 6 - 8 h, à une dégradation importante qui suit cette fenêtre temporelle. Cependant, les deux tranches de cerveau et les préparations de rétines wholemount produisent habituellement plus de tissu que peuvent être enregistrées à partir de cette courte période de temps. Par conséquent, le tissu est souvent mis au rebut à la fin de la journée et de la dissection est achevée à nouveau les jours suivants. Cela signifie un autre animal est utilisé et ~ 2 h de la configuration et la dissection / coloration répétée. Le protocole suivant décrit une méthode pour prolonger la vie de tissu neuronal pendant plus de 24 h, ce qui signifie moins d'animaux sont utilisés, et le temps plus expérimental est disponible. Tissue viabilité wcomme évalué par l'enregistrement des propriétés électrophysiologiques et la dynamique de calcium, et ces propriétés ne se distinguaient pas entre <4 h et> 24 h postdissection.

Ces résultats indiquent que non seulement les propriétés des cellules individuelles intactes et fonctionnelles après une incubation prolongée, mais l'activité du réseau, tel qu'évalué par imagerie du calcium et des enregistrements électrophysiologiques, est inchangé> 24 h postdissection. En outre, nous montrons que les colorants de calcium dans les cellules peuvent rester pendant des périodes prolongées sans provoquer d'effets secondaires nuisibles. L'application de ce protocole démontre que l'activité fonctionnelle des neurones dans le tissu neuronal aiguë peut être maintenue pendant de longues périodes, une fois que l'environnement extérieur est très réglementé. En outre, comme la viabilité des tissus varie grandement entre les laboratoires en raison de protocoles d'incubation différents, cette méthode établit une norme d'or pour les paramètres idéaux qui devraient être appliqués pour réduire la variabilité de la santé de neu aiguëtissus ronal.

Protocole

Le protocole suivant décrit la préparation de C57BL / 6 et C3H / He (retinally dégénéré) un tissu neuronal de la souris, mais des techniques similaires peuvent être appliquées à d'autres espèces. Tous les animaux étaient en bonne santé et manipulé avec les conditions normales de température, d'humidité, 12 h cycle lumière / obscurité, l'accès libre à la nourriture et de l'eau, et sans stimuli de stress destinés. Toutes les expériences ont été approuvées et effectuées en conformité avec comité de l'Université Western Sydney Animal Care et de l'éthique et selon l'utilisation des animaux et des lignes directrices de soins (Animal Research Authority # A9452, # A10396 et # A8967).

1. Cerveau Slice Préparation

1. Anesthésier l'animal par inhalation d'isoflurane (5%) et en utilisant une guillotine décapite des rongeurs. Retirer rapidement le cerveau, comme décrit précédemment ⁹ et le placer dans une solution physiologique glacée (aCSF) contenant (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2 _CaCl2, 25NaHCO _3, 25 dextrose, et une solution saturée de carbogène (95% O _2/5% CO ₂ du mélange; 310 mOsm; pH 7,4).
2. Couper des tranches de cerveau dans la région d'intérêt, de 300 um d'épaisseur avec un microtome vibrant.
3. Transférer les tranches à un système d'incubation intégré personnalisé qui surveille et contrôle les niveaux de pH (pH 7,2 à 7,4), le flux de carbogène et température comme décrit précédemment ^{10, 11.}
4. Régler la température de la chambre initiale à 35 ° C pendant 15 - 30 min, puis réduire lentement à 15 - 16 ° C , comme le montre la figure 1C. Puis incuber des tranches dans le système d'incubation jusqu'à ce que nécessaire, que ce soit pour l'électrophysiologie ou d'imagerie.
   NOTE: Si les tranches doivent être utilisés pour le calcium-imagerie, suivez les étapes ci-dessous avant le tissu de refroidissement ci-dessous RT.

2. Retinal Wholemount Préparation et intérieure Limitation Membrane Removal

1. Préparer des échantillons entiers rétiniens sous soit normalelaboratoire des conditions d'éclairage ou rouge lumière infrarouge / dim.
2. Euthanasier animaux par dislocation cervicale et les yeux immédiatement énucléer. Faire une petite incision le long de la ora serrata, et le lieu dans les deux médias Ames, ou LCRa contenant (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO _3, 3 KCl, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 10 glucose, 0,5 L-glutamine, et sature avec du carbogène (95% O _2/5% CO ₂ du mélange; ~ 300 mOsm; pH 7,4) à température ambiante.
3. Retirer immédiatement la cornée, le cristallin et vitreux en coupant le long de l'ora serrata avec de petits ciseaux et retirer la lentille et le vitré avec une pince. Placer le tissu dans le système d'incubation à la température ambiante.
   REMARQUE: le tissu rétinien peut être maintenue dans l'œilleton, après réduction lente de la température à 15 - 16 ° C, pendant> 24 h dans le système d'incubation jusqu'à ce que nécessaire.
4. Pour supprimer l'ILM, transférer l'œil-tasse contenant la rétine à un petit pot de verre contenant de la papaïne 30 U / ml, 1 mM de L-cystine, EDTA 0,5 mM et 0,005% DNase dans Earl's-Une solution saline équilibrée (BSS) à 37 ° C pendant 20 min. Appliquer 95% O _2/5% de CO ₂ à la solution à travers le couvercle mais ne pas bulle. En cas d'utilisation de tissus de jeunes animaux (<6 semaines), diluer la solution à demi-force.
   1. Arrêter la digestion enzymatique, en plaçant le tissu dans un ovomucoïde (10 mg / ml) et BSA (10 mg / ml), la solution pendant 10 min dans le BSS Earl. Laver soigneusement les tissus avec LCRa avant le transfert vers le système d'incubation et de réduire la température à 15 - 16 ° C.
5. Maintenir le tissu rétinien dans l'œil-tasse jusqu'à ce que nécessaire. Pour le transfert au microscope, isoler la rétine de l'œil-tasse et coupé en 4 morceaux avec une lame de rasoir. Si la rétine entière est nécessaire, faire quatre petites coupures dans la périphérie de la rétine pour lui permettre de reposer à plat.
   NOTE: Pour les expériences d'imagerie, la charge avec le calcium-colorants avant le transfert vers le système d'incubation, voir ci-dessous.

3. Le maintien de tissus dans l'incubateur

1. Placez le tissu dans la chambre principale contenant des sondes pour pH et de la température (Figure 1A, B).
2. Circulez LCRa à travers une deuxième chambre (chambre UVC, construit comme décrit précédemment ¹²⁾ isolé de la chambre principale et exposée à 1,1 W lumière UVC (254 nm, lampe UV 5W / 2P stérilisateur) pour irradier bactéries flottant dans la solution (Figure 1A). synchronisation de la lumière de contrôle UVC via une minuterie programmable à l'aide d'une fonction aléatoire qui est activée à des moments variant entre 15 et 26 min toutes les 15 - 30 min pour éviter un échauffement excessif de la LCRa.
3. Réglez le débit dans la chambre UVC à 12 mL / min comme indiqué précédemment ^12. Couvrir la chambre UVC avec une feuille d'aluminium pour empêcher l'éclairage UVC en dehors de la chambre, ce qui peut endommager le tissu neuronal.
   NOTE: Pour le tissu rétinien adapté à l'obscurité, appliquer une couverture sur mesure à la chambre principale pour exclure la lumière.
4. Utilisez une pompe péristaltique à Circulate la solution (LCRa) à travers les deux chambres et une plaque froide thermoélectrique Peltier glacière pour refroidir ou chauffer la chambre principale pour les températures souhaitées dans la plage de 0 - 50 ° C. Pour incubation optimale des tissus, utiliser 15 - 16 ° C pour la viabilité à long terme.

4. Calcium Dye Loading

1. Sélectionnez les colorants de calcium en fonction de la préférence du chercheur individuel. Ici, nous utilisons Fura-2 heures, Fluo-huit heures ou Fluo-quatre heures. Cependant, cette méthode peut être appliquée à d' autres colorants, ainsi: dissoudre les colorants de calcium dans le DMSO à une solution de 1 mM et 1% de copolymères séquencés (par exemple, l' acide-127 Pluronic) jusqu'à un volume final de 50 ul et de traitement par ultrasons pendant 10 min.
2. Ajouter une solution à LCRa à une concentration finale de 10 uM, les copolymères séquencés 0,01% pour des tranches de cerveau, et 20 uM (rétine), les copolymères séquencés 0,02% pour la rétine. Dans les rétines (papaïne traitées) et des tranches de cerveau de jeunes animaux, de la charge dans le bain pendant 45 minutes à 37 ° C (Fura-2 AM) ou à la température ambiante (Fluo-quatre heures; Fluo-8 AM).
   1. Pour les animaux adultes, (> 12 semaines) pipeter les colorants (50 pi) directement sur les tranches de cerveau, et maintenir pendant 75 minutes pour permettre une meilleure pénétration du colorant dans les couches profondes.
   2. Afin d'assurer une oxygénation adéquate de la tranche immergée pendant colorant incubation, préparer une chambre de chargement de verre avec un couvercle fermé (pot circulaire de diamètre 2,5 cm, 3,5 cm de hauteur) avec des colorants de calcium dilué dans 2,5 ml de LCRa. Oxygéner en continu avec 95% O _2/5% CO _2. Ne pas bulle.
3. Après charge de colorant, lavez le tissu avec LCRa et transfert vers le système d'incubation, réduire lentement la température à 15 - 16 ° C jusqu'à ce que l'utilisation expérimentale.

5. électrophysiologique Recordings et imagerie

1. Placer le tissu dans une chambre d'enregistrement immergée sous un microscope, et perfuser avec oxygénées LCRa à un débit de 4 d'écoulement - 5 ml / min, soit à température ambiante (~ 22 ° C) ou de la température physiologique (35 ° C). Hold le tissu en place à l'aide d'un rendu '' harpe '', en nylon ou en or fils tendus et collés sur une pièce en forme de U de fil d'or ou de platine.
2. Pour électrophysiologie:
   1. Préparer les pipettes d'enregistrement de 1,5 mm (1,19 mm de diamètre) en verre borosilicate à l'aide d'un extracteur micropipette pour obtenir une résistance finale de 5-6 MQ.
   2. Remplir la pipette avec 3 - 4 pi de solution interne comme décrit précédemment ¹³ et visualiser les cellules sous infrarouge contraste d' interférence différentiel (IR-DIC) à l' aide d' une caméra CCD. La solution intracellulaire doit être soigneusement adaptée à chaque expérience pour obtenir des résultats expérimentaux.
   3. Position de la pipette, tout en maintenant une pression positive appliquée à travers un orifice d'aspiration sur le porte-pipette sur la membrane d'une cellule à l'aide d'un micromanipulateur. Étant donné que le GIP a été retiré de la rétine, sans grattage de la membrane préalable est nécessaire. Une fois que la pipette est sur la cellule, appliquer négative doucela pression à la pipette pour obtenir un joint d'étanchéité gigaohm. Ensuite, la rupture de la membrane cellulaire par une brève quantité de pression négative.
   4. Faire la cellule entière enregistrements ou opérations courantes voltage-clamp en utilisant des techniques standard, le cas échéant.
3. Calcium-imagerie:
   1. Pour l'imagerie ratiométrique de Fura-2, utiliser une longueur d'onde de commutation de vitesse ultra-élevée pour fournir des longueurs d'onde d'excitation de 340 nm, et 380 nm. Passez la lumière émise à partir de cellules individuelles à travers un filtre d'émission de 510 ± 20 nm, et de capturer avec une haute sensibilité, un appareil photo numérique à haute vitesse.
   2. Pour une seule longueur d'onde d'excitation de Fluo-4, la lumière filtre d'excitation à travers un 460 - bande de filtre 490 nm de passage et la lumière émise par un 515 - 550 filtre passe-bande nm. Pour l'enregistrement le plus rapide et le plus sensible utiliser un appareil photo numérique à haute vitesse tels. Acquérir les images selon les besoins.
   3. Mesurer les modifications de fluorescence en fonction du temps, soit à une seule longueur d'onde (Fluo-4) ou en utilisant le rapport de la longueur d'ondeProcédé (Fura-2), tel que décrit ci- dessus ^{8, 14.}

Résultats

une régulation stricte de la charge bactérienne et la température du LCRa pendant l'incubation est essentiel pour maintenir la viabilité des tissus neuronaux. Ceci peut être optimisée par l' irradiation avec de la lumière UV - C et en maintenant la température du LCRa à 15 - 16 ° C (figure 1). En outre, le LCRa paramètres timbre (APS; Figure 1C) fournit l'expérimentateur avec un enregistrement des conditions environnementales (pH et la tempér...

Discussion

Cet article décrit une méthode d'incubation pour prolonger la viabilité du tissu neuronal aigu pour les expériences d'imagerie et électrophysiologiques, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation des objectifs expérimentaux. Deux processus principaux régissent la détérioration du tissu neuronal au fil du temps: i) l' augmentation des niveaux de bactéries, et l'augmentation d' accompagnement dans l' endotoxine bactérienne libérée, et ii) excitotoxicité qui suit la procédu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorure	de sodium Sigma Aldrich VETEC	V800372
Chlorure	de potassium Sigma Aldrich	P9333
N-méthyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004  ;
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Bicarbonate	de sodium Sigma Aldrich	S6014
Phosphate de sodium monobasique	Sigma Aldrich	S2554
Chlorure	de magnésium Sigma Aldrich	M9272  ;
Chlorure de calcium  ;	Sigma Aldrich	223506
Système de dissociation de la papaïne	Worthington  ;
Dimethyl sulfoxyde anhydre	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Faible absorbance UV*	Life technologies	P-6867	Solution à 20 % dans DMSO  ;
Fura-2 AM  ;   ;	Anaspec	84017
Fluo-4 AM  ;   ;	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Microtome à lame vibrante  ;	Leica Biosystem	VT1200 S	équipé de Leica' s Vibrocheck&trade ; appareil de mesure  ;
Table antivibratoire	Kinetic Systems Vibraplane  ;	Vibraplane 9100/9200  ;
Microscope droit à platine fixe	Olympus	BX51WI  ;
Objectif de microscope	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X  ;
Objectif microscope	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
Caméra CCD	Andor	Ixon +
Commutateur de longueur d’onde haute vitesse	Instrument	Sutter Lambda DG-4  ;
Amplificateur patch clamp	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Système d’acquisition de données	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® ; Système
Capillaires en verre borosilicaté	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Extracteur de microélectrodes	Sutter Instrument Co	P-97	Extracteur de micropipettes de type flamant/brun
Chambre d’enregistrement/de perfusion	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath
Chambers Logiciel	Molecular Devices	pClamp 10.2
Logiciel d’imagerie de cellules vivantes Andor Andor		iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Refroidisseur de plaque froide thermoélectrique Peltier,	technologie TE CP-121
régulateur de température	TE Technology	TC-36-25, RS232

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