Exemple amélioré Multiplexage de tissus à l'aide combinée Precursor et étiquetage Isotopique isobarique Tagging (cPILOT)

Summary

marquage isotopique de précurseur combiné et le marquage isobare (cPILOT) est une stratégie de protéomique quantitative qui améliore les capacités de multiplexage échantillon d'étiquettes isobares. Ce protocole décrit l'application de cPILOT aux tissus à partir d'un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage.

Abstract

Il y a une demande de plus en plus d'analyser de nombreux échantillons biologiques pour la compréhension des maladies et la découverte de marqueurs biologiques. stratégies protéomiques quantitatives qui permettent la mesure simultanée de plusieurs échantillons se généralisent et réduire considérablement les coûts expérimentaux et les temps. Notre laboratoire a développé une technique appelée précurseur combinée marquage isotopique et de marquage isobarique (cPILOT), ce qui améliore l'échantillon multiplexage de marquage isotopique traditionnel ou des approches de marquage isobares. cPILOT globale peut être appliquée à des échantillons provenant de cellules, des tissus, des fluides corporels ou des organismes entiers et donne des informations sur les abondances de protéines différentes conditions relatives à travers l'échantillon. cPILOT fonctionne en 1) en utilisant des conditions de tampon à faible pH pour sélectivement peptide dimethylate N-terminales et 2) en utilisant des conditions de tampon à pH élevé pour étiqueter des amines primaires des résidus lysine avec des réactifs isobares disponibles dans le commerce (voir le tableau des Matériaux / réactifs). Le degré demultiplexage d'échantillons disponibles dépend du nombre d'étiquettes précurseurs utilisés et le réactif de marquage isobare. Nous présentons ici une analyse 12-plex en utilisant la lumière et déméthylation lourde combinée à six plex réactifs isobares pour analyser 12 échantillons de tissus de souris en une seule analyse. multiplexage amélioré est utile pour réduire le temps et le coût expérimental et plus important encore, ce qui permet la comparaison entre les nombreuses conditions d'échantillons (biologiques, réplicats stade de la maladie, les traitements médicamenteux, génotypes, ou points de temps longitudinaux) avec biais moins expérimental et d'erreurs. Dans ce travail, l'approche globale de cPILOT est utilisé pour analyser le cerveau, le cœur et les tissus du foie à travers réplicats biologiques à partir d'un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage. Mondial cPILOT peut être appliquée à l'étude d'autres processus biologiques et adapté pour augmenter le multiplexage de l'échantillon à plus de 20 échantillons.

Introduction

Proteomics implique souvent l'analyse de nombreux échantillons utilisés pour mieux comprendre les processus de la maladie, la cinétique enzymatique, les modifications post-traductionnelles, réponse aux stimuli environnementaux, la réponse aux traitements thérapeutiques, la découverte de biomarqueurs, ou les mécanismes de la drogue. Les méthodes quantitatives peuvent être utilisées pour mesurer les différences relatives dans les taux de protéine à travers les échantillons et peut être sans étiquette ou comporter un marquage isotopique (métabolique, chimique ou enzymatique). méthodes d'étiquetage des isotopes stables ont gagné en popularité car ils permettent d....

Protocol

Déclaration d'éthique: Les souris ont été achetés auprès d'un institut de recherche indépendant, biomédicale à but non lucratif et logés dans la Division des ressources animales de laboratoire à l'Université de Pittsburgh. Tous les protocoles animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation des institutions à l'Université de Pittsburgh.

1. extraction des protéines et la production de produits chimiques pour Peptides marquage

1. Extrait de protéines à partir de tissus, des cellules ou des

Results

cPILOT utilise la chimie à base d'amine de peptides chimiquement de l'étiquette à l'extrémité N-terminale et les résidus de lysine et améliore les capacités de multiplexage d'échantillons. La figure 2 montre des données représentatives de MS qui est obtenu à partir d' une analyse de cPILOT 12-Plex du cerveau, le cœur et les tissus du foie à partir d' un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage. Comme le montre le tableau 1,

Discussion

cPILOT permet la mesure simultanée de plus de 12 échantillons uniques. Afin d'assurer le marquage avec succès à la fois l'extrémité N-terminale et les résidus lysine de peptides, il est impératif d'avoir le pH correct pour chaque ensemble de réactions et d'effectuer la réaction de diméthylation première pour le marquage des peptides. diméthylation sélective à l'extrémité N-terminale est réalisée en ayant un pH à ~ 2,5 (± 0,2). Ceci est obtenu en tirant parti des différences de pKa des groupes amino s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eau - MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 La quantité de 4 L n’est pas nécessaire
Acétonitrile - MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	La quantité de 4 L n’est pas nécessaire
Acide acétique	J.T. Baker	9508-01
Solution d’hydroxyde d’ammonium (28 - 30 %)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Formiate d’ammonium	Acros Organics	208-753-9
Acide formique	Fluka Analytique	94318-250ML-F
Kit de dosage des protéines BCA	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Urée	Biorad	161-0731
Tris	Biorad	161-0716
Dithiothréiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Iodoacétamide (IAM)	Acros Organics	144-48-9
L-Cysteine	Sigma Aldrich, Chimie	168149-25G
L-1-tosylamido-2 phényléthyl cholorméthylcétone (TPCK) traitée Trypsine du pancréas bovin	Sigma Aldrich, Sciences de la vie	T1426-100MG
Solution de formaldéhyde (CH2O) ; 36,5 à 38 % dans H2O	Sigma Aldrich, Sciences	de la vieF8775-25ML
Solution de formaldéhyde (13CD2O) ; 20 % en poids dans le D2O, 98 atomes % D, 99 atomes % 13C	Sigma Aldrich, Chimie	596388-1G
Cyanoborohydrure de sodium ; qualité réactif, 95 %	Sigma Aldrich	156159-10G
Cyanoboroduture de sodium ; 96 atomes % D, 98 % CP	Sigma Aldrich, Chimie	190020-1G
Pointes de spin à échange de cations forts (SCX) Kit de préparation d’échantillons	Protea BioSciences	SP-155-24kit
Tampon de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB)	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Kit de marquage isobare (TMT 6 plex) - 6 réactions (1 x 0,8 mg)	Thermo Fisher Scientific	90061
Chlorhydrate d’hydroxylamine	Sigma Aldrich, Chimie	255580-100G
Mélangeur vortex standard	Fisher Scientific	2215365	tout mélangeur peut être utilisé
Oasis HLB 1 cc (10 mg) cartouches d’extraction	Waters	186000383	Il s’agit de cartouches C18
Collecteur à vide Visiprep SPE, DL (doublure jetable), modèle à 24 ports	Sigma Aldrich	57265	Un modèle à 12 orifices est également suffisant
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	n’importe quelle marque d’aspirateur rapide suffit Chambre de
bain-marie	Thermo Scientific	2825/2826	N’importe quelle marque de chambre de bain-marie à température contrôlée suffit.
Homogénéisateur mécanique (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D avec passeur d’échantillons Nano LC AS-2	Sciex-Ce		modèle n’est plus disponible. N’importe quel nano LC avec un passeur d’échantillons automatique est suffisant.
Spectromètre de Masse LTQ Orbitrap Velos	Thermo	Scientific-Ce	modèle n’est plus disponible. D’autres instruments à haute résolution ( par exemple Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion ou Orbitrap Fusion Lumos) peuvent être utilisés.
Logiciel de gestion des protéines (e.g. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH  ;
Balance analytique	Mettler Toledo	AL54
Plaque d’agitation	VWR	12365-382	N’importe quelle marque de plaques d’agitation est suffisante
PH-mètre (compatible Tris)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	N’importe quelle marque de pH-mètre est suffisante
Tampon de pH 10	Fisher Scientific	06-664-261	N’importe quelle marque de tampon de pH 10 est suffisante
pH 7 tampon	Fisher Scientific	06-664-260	N’importe quelle marque de tampon de pH 7 est suffisant
1,5 mL de tubes eppendorf, 500 pk	Fisher Scientific	05-408-129	N’importe quelle marque de tubes eppendorf de 1,5 mL suffit
0,6 mL de tubes eppendorf, 500 pk	Fisher Scientific	04-408-120	N’importe quelle marque de tubes eppendorf de 0,6 mL suffit
0,65 µ ; m Unités de filtration centrifuge Ultrafree MC DV	EMD Millipore	UFC30DV00
Tubes de microcentrifugation de 2 ml, 72 unités	Thermo Scientific	69720
C18 matériau d’emballage (5  ; et micro ; m, 100 Å ;)	Bruker	PM5/61100/000	Cet article n’est plus disponible chez Bruker. Un autre matériau d’emballage avec les spécifications énumérées sera suffisant
C18 matériau d’emballage (5  ; et micro ; m, 200 Å ;)	Bruker	PM5/61200/000	Cet article n’est plus disponible chez Bruker. Un autre matériau d’emballage avec les spécifications énumérées sera suffisant