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L'identification d'un épitope linéaire des cellules B monoclonales d'anticorps reconnus par le peptide à balayage assistée

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DOI :

10.3791/55417

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24 mars 2017

 , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

Dans cet article

Résumé

Ici, les auteurs présentent un protocole simple et efficace pour définir un épitope antigénique linéaire à l’aide d’un anticorps monoclonal purifié et d’un balayage peptidique par hybridation dot-blot. L’épitope identifié peut ensuite être utilisé dans des applications thérapeutiques et diagnostiques.

Résumé

L'identification d'un epitope antigénique par le système immunitaire permet la compréhension du mécanisme de protection d'anticorps neutralisants qui peuvent faciliter le développement de vaccins et de médicaments peptidiques. balayage peptidique est une méthode simple et efficace qui mappe carrément l'épitope linéaire reconnu par un anticorps monoclonal (mAb). Ici, les auteurs présentent une méthodologie de détermination de l'épitope impliquant des protéines recombinantes en série tronquées, la conception de peptides synthétiques et hybridation dot-blot pour la reconnaissance antigénique du virus de la nécrose nerveuse protéine d'enveloppe en utilisant un mAb neutralisant. Cette technique repose sur l'hybridation dot-blot de peptides synthétiques et des mAb sur un fluorure de polyvinylidène (PVDF). La région antigénique minimum d'une protéine d'enveloppe virale reconnue par le RG-M56 mAb peut être réduite par l'étape par étape taillée cartographie peptidique sur un épitope de peptide 6-mer. En outre, le balayage d'alanine mutagenèse et les résidus sousconstitution peut être effectuée pour caractériser l'importance de liaison de chaque résidu d'acides aminés constituant l'épitope. Les résidus flanquant le site d'épitope ont été trouvés à jouer un rôle critique dans la régulation peptide de conformation. Le peptide d'épitope identifié peut être utilisé pour former des cristaux de complexes peptide-anticorps épitope pour une étude de diffraction des rayons X et de la compétition fonctionnelle ou pour la thérapeutique.

Introduction

Dans le système immunitaire, la recombinaison V, D et J pour les anticorps segments permet de créer des variations considérables des régions déterminant la complémentarité (CDR) pour la liaison à des antigènes différents pour protéger l'hôte contre une infection pathogène. La défense de neutralisation des anticorps dirigés contre des antigènes dépend de la complémentarité spatiale entre les CDRs de l'anticorps et les épitopes des antigènes. Par conséquent, une compréhension de cette interaction moléculaire facilitera la conception d'un vaccin prophylactique et le développement peptide médicament thérapeutique. Cependant, cette interaction de neutralisation peut être influencée à la fois par de multiples domaines antigéniques à partir d'un seul antigène et par plusieurs CDR d'anticorps, ce qui rend par conséquent le procédé de détermination de l'épitope plus complexe. Heureusement, le développement de la technologie des hybridomes, qui fusionne les cellules productrices d'anticorps individuelles avec des cellules de myélome, permet de diviser un lot de cellules en permanence à secrete un anticorps spécifique, connu comme un anticorps monoclonal (mAb) 1. Les cellules d'hybridome produisent ces mAb, à haute affinité pures pour se lier à un domaine antigénique unique d'un antigène spécifique. La relation de l'antigène-anticorps mis en place, plusieurs approches, y compris le balayage des peptides, peut être utilisé pour déterminer l'épitope d'un antigène en utilisant son anticorps monoclonal correspondant. Les développements récents dans la technologie de peptide synthétique ont fait la technique de balayage de peptide plus accessible et plus commode d'exécuter. En bref, un ensemble de peptides synthétiques se chevauchant sont produites selon une séquence de l'antigène cible et sont associés à une membrane supporté sur un solide pour mAb hybridation. balayage Peptide non seulement offre un moyen simple pour cartographier la région de liaison de l'anticorps, mais facilite également l'acide aminé (aa) la mutagenèse par balayage de résidus ou de substitution pour évaluer l'interaction de liaison entre chaque résidu aa du peptide d'épitope et les CDR de l'anticorps.

Ici, la présente étude décrit un protocole pour l'identification efficace de l'épitope linéaire du mérou jaune virus de la nécrose nerveuse (YGNNV) protéine d'enveloppe en utilisant une neutralisation mAb 2, 3, 4. Le protocole comprend mAb préparation, la construction et l'expression de protéines recombinantes tronquées en série, la conception de peptides se chevauchant de synthèse, hybridation dot-blot, le balayage d'alanine et la mutagenèse par substitution. Compte tenu du coût élevé de la synthèse peptidique, l'étape consistant à tronquer en série les protéines recombinantes d'une protéine cible souhaitée a été modifiée, et la région antigénique a été réduit à environ 100 à 200 résidus aa avant la synthèse réseau peptidique analyse dot-blot a été réalisée.

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Protocole

1. Préparation de l'anticorps monoclonal

  1. Culture les RG-M56 cellules hybridomes monoclonaux de souris 2 dans un milieu sans sérum dans des flacons de 175T à 37 ° C avec 5% de CO 2 supplément. Recueillir le surnageant lorsque la couleur du milieu devient jaune après cinq jours d'incubation.
    REMARQUE: Les cellules d'hybridome sont cultivées dans un milieu exempt de sérum pour éviter la contamination anticorps à partir du sérum de foetus bovin.
  2. Centrifuger le surnageant à 4500 xg pendant 30 min à 4 ° C et jeter le culot de débris cellulaires.
  3. Ajouter 2 ml d'agarose de protéine G (fourni sous forme d'une suspension à 50%) sur une colonne de 5 ml et on équilibre avec 10 volumes de résine (10 ml) de PBS glacé.
  4. Charge 200 ml du surnageant d'anticorps (étape 1.2) sur la colonne et jeter le pass-through.
  5. Ajouter 10 ml de PBS glacé à la colonne pour la laver. Répéter deux fois.
  6. Ajouter 10 ml de glycine 50 mM, pH 2,7 à la colonne pour éluer l'anticorps de la protéine G associée. Coltionner des fractions de 900 ul dans un tube de microcentrifugation contenant 100 pi de 10 x tampon de neutralisation (Tris 1 M, 1,5 M de NaCl et 1 mM d'EDTA, pH 8,0).
  7. Stocker l'anticorps purifié dans 50% de glycérol avec 0,03% de NaN3 à -20 ºC.

2. Construction et expression de protéines recombinantes tronquées en série

  1. Préparer un mélange de réaction PCR: 5 pi de tampon 10x Pfu, 0,2 mM de chaque dNTP, 0,2 uM d' amorce avant 3, 0,2 uM d' amorce inverse 3, 2 mM de MgSO 4, 1 ng de pET20b-1A59 ADN 3 de plasmide et 2,5 U ( unité) de l' ADN polymerase Pfu; ajouter ddH 2 O jusqu'à un volume final de 50 ul.
    1. échantillons exécuter dans un cycleur thermique automatique en utilisant les paramètres suivants: Cycle 1 (94 ° C pendant 5 min); cycles 2-36 (94 ° C pendant 30 s, 63 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 60 s); et le cycle 37 (72 ° C pendant 7 min).
  2. Extraire la réaction en chaîne par polymérase (PCR) produits en utilisant un kit de purification PCR 5 pour faciliter la digestion par enzyme de restriction suivante.
  3. Digérer les fragments d'ADN amplifiés par PCR avec les enzymes de restriction Nde I et Xho I et ligaturé chacun de ces fragments d'ADN dans Nde I et Xho I enzyme clive pET-20b (+) vecteur. Transformer les constructions dans Escherichia coli cellules DH-5a-compétente 6.
    1. Préparer le mélange de digestion dans un tampon de digestion (20 mM de Tris-acétate, 10 mM de Mg (CH 3 COO) 2 mM KCH 50 3 COO, et 1 mM de DTT, pH 7,9) avec 1 pg d'ADN amplifié par PCR ou pET-20b (+) ADN vecteur et 2 U de restriction Nde I et Xho I enzymes dans un volume final de 20 ul.
    2. Mélanger le mélange de digestion en douceur et tourner rapidement vers le bas. Incuber à 37 ° C pendant 2 h dans un bain sec pour assurer la découpe complète de la restriction assises.
    3. Extraire les fragments d'ADN digéré par une enzyme de restriction en utilisant un kit de purification de PCR 5 afin de faciliter la construction du plasmide suivant.
    4. Préparer le mélange de ligature dans un tampon de ligature (Tris 66 mM, MgCl2 5 mM, ATP 1 mM et 5 mM de DTT, pH 7,5) avec 100 ng d'prédigéré ADN, amplifié par PCR, 10 ng de prédigéré pET-20b (+) ADN vecteur et 5 U d'ADN ligase T4 dans un volume final de 10 ul.
    5. Mélanger le mélange de ligature doucement et tourner rapidement vers le bas. Incuber à 16 ° C pendant 18 h dans un bain d'eau.
    6. Mettez 10 pi des échantillons de ligature dans 100 pi des cellules DH-5α-compétentes et mélanger doucement avant de placer le tube de microcentrifugation sur la glace pendant 30 min. Placer le tube à centrifuger dans un bain sec à 42 ° C pendant 90 s pour provoquer un choc thermique 7. Immédiatement transférer le tube sur de la glace pendant 2 min.
    7. Ajouter 900 ul de Luria-Bertani (LB) (1% de Bacto tryptone, 0,5% de Bacto levure Extract et 0,5% de NaCl, pH 7,0) dans le tube. Incuber à 37 ° C avec 150 rpm agitation pendant 45 min. Sédimenter les cellules par centrifugation à 4000 x g pendant 10 minutes et éliminer le surnageant.
    8. Remettre en suspension le culot avec 50 ul de bouillon LB et étaler chaque transformation sur des plaques pré-chauffé LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 16 h.
    9. Ramassez une seule colonie en utilisant une pointe de 200 pi et le placer dans 3 ml de bouillon LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline dans un lâche couvert 15 ml tube. Incuber à 37 ° C avec 150 rpm agitation pendant 12 h.
    10. Extraire l'ADN plasmidique 8 de chaque culture et de la séquence en utilisant le promoteur T7 et les amorces T7 terminator pour confirmer la séquence 9.
  4. Après confirmation de la séquence, transformer 10 ng d'ADN à partir de ces pET-20b (+) des plasmides avec des longueurs de YGNNV gène de protéine d'enveloppe variable dans la souche BL-21 (DE3) de E. coli en nousment la méthode de choc thermique 7. Suivez les étapes 2.3.6-2.3.8 pour effectuer la transformation.
  5. Transférer une seule colonie de E. coli transformée par BL-21 cellulaire dans 3 ml de bouillon LB contenant 100 ug / ml d' ampicilline dans un bouchée non hermétiquement 15 ml tube. Incuber la culture à 37 ° C avec 150 rpm agitation.
  6. On refroidit la culture à 25 ° C lorsque la DO600 de la culture est d' environ 0,6 et ajouter de l' IPTG à une concentration finale de 0,4 mM pour induire l'expression de la protéine recombinante. Incuber la culture pour un supplément de 4 h à 25 ° C avec 200 rpm agitation.
  7. Transférer 1 ml de la culture dans un tube de microcentrifugeuse. Sédimenter les cellules par centrifugation à 12 000 x g pendant 1 min et jeter le surnageant.
  8. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 pi de tampon de dénaturation (8 M d'urée, du phosphate de sodium 20 mM et du NaCl 0,5 M, pH 7,4) par pipetage de haut en bas avec une micropipette. Mélanger par tourbillonnement vigoureux.
    NOTE: L'échantillon de solutions devraient maintenant être semi-transparent, un peu collante, et prêt pour l'essai d'hybridation dot-blot.

3. Conception et synthèse de peptides chevauchants

  1. Conception et synthèse 3 série peptides 20-mères que chaque chevauchement avec son successeur par 10 résidus aa de la région 195-338 aa de la protéine d'enveloppe de YGNNV pour affiner la région d'épitope de RG-M56 mAb par point blot.
  2. Conception et synthétiser des peptides 3 trois 8-mer (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204 et 199 VLCRWSVR 206) avec un chevauchement de 6 résidus aa sur le prochain peptide synthétique pour affiner la région d'épitope de 195-206 aa par point blot.
  3. Conception et synthèse 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 et 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201 et 197 VSVLCR 202) et 5-mères peptides (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201 et 198 SVLCR 202) avec un chevauchement de 6, 5 et 4 résidus aa, respectivement, sur des leurs peptides voisins afin de minimiser la région de l'épitope par point blot.

4. Dot-blot Hybridation

  1. Dissoudre chaque peptide synthétisé dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration finale de 10 mg / ml.
    Remarque: Afin de surmonter la solubilité varie de peptides synthétiques, les peptides de synthèse doit être dissous dans du DMSO. DMSO est un bon solvant pour dissoudre complètement les peptides hydrophobes ou hydrophiles.
  2. Faire tremper la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) avec du methanol pendant 2 min.
    NOTE: membrane de PVDF est jusqu'à résistante au DMSO 100%; d'autres peuvent ne pas être aussi.
  3. Équilibrer la membrane de PVDF avec du tampon modifié Towbin (Tris 25 mM, glycine 192 et 0,1% de SDS, pH 8,3) pour2 min.
    NOTE: 10-20% (v / v) de méthanol peut être ajouté à un tampon Towbin modifié afin d'améliorer les résultats de transfert.
  4. Rincez un morceau de papier de chromatographie avec le tampon Towbin modifié. Placer la membrane PVDF sur le papier de Chromatographie. Attendre jusqu'à ce que le tampon Towbin modifié a disparu de la surface de la membrane de PVDF avant de passer à l'étape suivante.
  5. Ajouter 2 ul de chaque échantillon de peptide sur la membrane avec une pointe de 10 ul. Sécher à l'air de la membrane PVDF sur le papier de chromatographie pendant 10 min. Ajouter chaque échantillon de peptide lentement et progressivement sur la membrane pour éviter une trop grande diffusion.
  6. Bloquer la membrane dans du tampon TBST (0,05% (v / v) de Tween-20, Tris 20 mM et NaCl 150 mM, pH 7,4) avec 5% de lait écrémé pendant 30 minutes à température ambiante avec agitation douce.
  7. Ajouter le RG-M56 mAb à une dilution finale de 1: 1000 dans le tampon TBST à 5% de lait écrémé à la membrane. Incuber la membrane à 37 ° C pendant 1 h avec agitation douce.
  8. Retirer l'anticorps ainsirésolu-. Laver la membrane dans le tampon TBST pendant 5 minutes en agitant doucement. Répéter deux fois.
  9. Ajouter l'anticorps secondaire (chèvre anti-souris IgG Fc, la phosphatase alcaline conjuguée) à une dilution finale de 1: 5000 dans le tampon TBST à 5% de lait écrémé à la membrane. Incuber la membrane à 37 ° C pendant 1 h avec agitation douce.
  10. Jeter la solution d'anticorps. Laver la membrane dans le tampon TBST pendant 5 minutes en agitant doucement. Répéter deux fois l'étape de lavage.
  11. Développer la membrane avec une solution de substrat BCIP / NBT à la température ambiante pendant 15 min dans l'obscurité. Arrêtez le développement par lavage de la membrane avec ddH 2 O lorsque le signal apparaît.
  12. Sécher à l'air la membrane et capturer l'image de transfert en point en utilisant un système d'image.
  13. Mesurer l'intensité de chaque dot blot en utilisant un logiciel d'analyse d' image 3.

5. Numérisation Alanine et Substitution

  1. Concevoir et synthétiser 3 alanine et methides peptides de substitution onine. Remplacer chaque résidu aa avec alanine pour le peptide 8-mer 195 VNVSVLCR 202 et synthétiser des peptides 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 et 195 VNVSVLCA 202 . Remplacer résidu aa leucine 200 en méthionine pour créer le SJNNV génotype épitope peptide 195 VNVSVMCR 202.
  2. Suivez la section 4 pour effectuer un balayage de l'alanine et la substitution mutagenèse dot blot.

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Résultats

Le but de cette expérience était d'identifier un épitope par dot blot en utilisant mAb. Pour affiner rapidement et efficacement en bas de la région antigénique reconnu par mAb, la pleine longueur et YGNNV protéines d'enveloppe recombinante en série tronquée avec une fusion tag 6xHis à l'extrémité C-terminale ont été exprimées à partir d' un système d'expression E. coli PET 10 (figure 1A). Les protéines recombinantes ré...

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Discussion

Ce protocole offre une technique simple et rapide pour identifier un épitope linéaire mAb reconnu. Prenant en considération le coût de la synthèse peptidique et l'efficacité des peptides de synthèse de la production, de la région antigénique de la protéine d'enveloppe du virus a été réduite par l'expression de protéines recombinantes tronquées en série avant l'analyse de balayage de peptides. En tant que tel, le système d'expression pET de E. coli fiable et efficace a été utilisé pour produi...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts lié à ce rapport.

Remerciements

Les auteurs remercient Mlle Ching-Chun Lin et Mlle Diana Lin de la plate-forme de l’Institut de biologie cellulaire et organique (ICOB) de l’Academia Sinica d’avoir offert leur expertise sur la synthèse peptidique et le séquençage de l’ADN, respectivement. Cette étude a été soutenue par l’Academia Sinica.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Hybride-SFM moyenGibco12045-076
Solution saline tamponnée au phophate de Dulbeccos (PBS)Gibco21600-069
ADN polymérase Pfu  ;Thermo Scientific  ;EP0502  ;Inclure les tampons
T4 ADN LigaseRoche10799009001Y compris tampons
NdeI  ;New England BiolabsR0111SY compris les tampons
XhoI  ;New England BiolabsR0146SIncluant tampons
pET-20b(+) vecteurNovagen, Merck Millipore69739
E. coli DH-5&alpha ; cellule compétenteRBC BioscienceRH617
E. coli BL-21(DE3) cellule compétenteRBC BioscienceRH217
AmpicillineAmresco0339-25G
Bouillon LB  ;Invitrongen12780-052
Isopropylthio-&beta ;-D-thiogalactoside (IPTG)MDBio, Inc.101-367-93-1
MéthanolMerck Millipore106009
Polyoxyéthylène 20 Monolaurate de sorbitan (Tween-20)J.T.BakerX251-07
Diméthylsulfoxyde (DMSO)SigmaD2650
GlycineAmresco0167-5KG
TrisAffymetrix, USB75825
NaClAmresco0241-1KG
EDTAAmresco0105-1KG
GlycérolAmresco0854-1L
NaN3SigmaS2002-500G
BCIP/NBTPerkinElmerNEL937001PK
Chèvre Anti-Souris IgG, Anticorps fragment FcJackson ImmunoResearch115-055-008
Immobilon-P (fluorure de polyvinylidène, PVDF)Merck MilliporeIPVH00010
Protein G Agarose Fast FlowMerck Millipore16-266
QIAquick PCR Purification kitQiagen28106
UVP BioSpectrum 600 Image SystemUVPn/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8UVPn/a
Thermocycleur MyCyclerBioRad1709713

Références

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Mots-clés

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