Article de méthode

Analyse de terminaison de la transcription Utilisation d'exécution sur la transcription (TRO) Approche BrUTP brin spécifique

DOI :

10.3791/55446

⸱

12 mars 2017

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1Department of Biological Sciences, Wayne State University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons une approche expérimentale de base pour l’analyse de la terminaison de la transcription par l’ARN polymérase II in vivo en utilisant BrUTP par l’approche TRO (Strand-specific transcription run-on) chez la levure bourgeonnante. Ce protocole peut être étendu à l’étude de la terminaison de la transcription par d’autres ARN polymérases chez la levure et les eucaryotes supérieurs.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit décrit un protocole de détection de terminaison de la transcription défaut in vivo. Le protocole TRO spécifique de brin en utilisant BrUTP décrit ici est une approche expérimentale puissante pour analyser le défaut de terminaison de transcription dans des conditions physiologiques. Comme le dosage TRO traditionnel, il repose sur la présence d'une polymerase transcriptionnellement actif au - delà de l' extrémité 3 'du gène comme un indicateur d'un défaut de terminaison de transcription 1. Il surmonte deux problèmes majeurs rencontrés avec le dosage de la TRO traditionnelle. Tout d'abord, il peut détecter si la polymerase lecture par le signal de terminaison est celui qui a initié la transcription de la région promotrice-proximale, ou si elle est simplement représente une polymérase transcrivant pervasively qui a initié de façon non spécifique de quelque part dans le corps ou la région 3 ' du gène. D'autre part, on peut distinguer si le signal de polymerase transcriptionnellement actif au-delà de larégion de terminaison est vraiment la polymérase transcrivant un ARNm sens translecture ou un signal d'ARN anti-sens non codant terminateur initiée. En bref, le protocole implique perméabilisation des cellules de levure en croissance exponentielle, ce qui permet la transcription initiatrices in vivo allongé en présence du nucleotide BrUTP, la purification de l' ARN BrUTP marqué par l'approche par affinité, la transcription inverse de l'ARN naissant purifié et l' amplification de l'ADNc en utilisant des amorces spécifiques à brin flanquant le promoteur et les régions terminatrices du gène 2.

Introduction

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Le cycle de transcription eucaryote se compose de trois étapes principales; initiation, l'élongation et la terminaison. La terminaison de la transcription par l' ARN polymérase II se compose de deux étapes interdépendantes distinctes 3. La première étape implique le clivage, la polyadénylation et la libération de l'ARNm à partir du modèle, et est immédiatement suivie par la seconde étape, marquée par le désengagement de la polymérase du modèle. Terminaison appropriée est cruciale pour le recyclage de la polymérase lors de l' initiation / réinitiation de la transcription, pour empêcher l' interférence avec la transcription des gènes en aval, et pour garder la transcription aberrante dans le contrôle en limitant la transcription de l' ARN omniprésente 4, 5 non codante. Malgré les progrès récents, la résiliation est de loin l'étape la moins comprise du cycle de transcription de l'ARN polymérase II. Un test de terminaison fiable est essentielle pour étudier le mécanisme underlying terminaison de la transcription par l' ARN polymérase II in vivo.

Un certain nombre d'approches expérimentales sont utilisées pour détecter le défaut d'interruption dans un gène transcrivant activement dans des conditions physiologiques. Ceux-ci comprennent Northern blot, le facteur de terminaison ChIP (Immunoprécipitation de la chromatine) et le dosage de la TRO traditionnelle. Chacune de ces techniques présentent des avantages et des inconvénients. L'essai de TRO traditionnel utilisé pour être l'approche la plus fiable et sensible pour la détection d'un défaut de terminaison de la transcription in vivo 1. Ce dosage se localise les molécules de polymerase transcriptionnellement actif sur différentes régions d'un gène dans la cellule. Dans des conditions normales, l'essai montre des molécules de polymerase transcriptionnel engagés strictement répartis entre la région promoteur et le terminateur du gène (figure 1A). En cas de résiliation défectueux, cependant, la polymérase est incapable de lire le signal de terminaisonet est détecté dans la région en aval de l'extrémité 3 ' du gène (figure 1B).

Un défaut de terminaison de la transcription se manifeste en présence d'une polymérase des sens de transcription qui a initié à partir de la région du promoteur proximal et étant incapable de lire le signal de terminaison, continue transcrivant la région en aval de l' extrémité 3 'd'un gène tel que représenté sur la figure 2A. Avec la prise de conscience que le génome eucaryote présente transcription omniprésente écrasante dans le sens ainsi que les directions anti-sens dans et autour d' un gène 6, 7, 8, 9, 10, il est vite devenu clair que le dosage de la TRO traditionnelle ne peut pas détecter si le signal de la polymérase en aval d'un gène représente la transcription du promoteur initié (figure 2A) ou un ARN aberrant qui a initié somewhere au milieu du gène ou en aval de l'élément de terminaison (figure 2B) ou la transcription de la polymerase dans le sens anti-sens de l' extrémité 3 'du gène (figure 2C). Le TRO dosage spécifique de brin en utilisant BrUTP décrit ici peut distinguer si le signal de la polymérase translecture observée représente promoteur initiée sens large ARNm ou une transcription anti-sens qui a initié en aval du gène en cours d'examen. Nous avons utilisé avec succès cette approche pour démontrer le rôle de Kin28 kinase dans terminaison de la transcription dans la levure bourgeonnante 2. Employant l'approche ici nous montrons que Rna14 est nécessaire pour la terminaison de la transcription du ASC1 dans la levure bourgeonnante.

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Protocole

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NOTE: Cette méthode a été utilisée dans l'article de recherche rapporté dans Medler, S et Ansari, A. 2.

1. la mise en culture et de récolte des cellules

  1. Démarrer une ml de culture de cellules dans un milieu YPD (extrait 10 g / l de levure, 20 g / L de peptone, 2% de glucose) 5 à partir d' une plaque de Saccharomyces cerevisiae fraîchement striée.
  2. Cultiver les cellules pendant une nuit dans un agitateur orbital à 30 ° C et à 250 tours par minute.
  3. Diluer la culture croître pendant une nuit à 100 fois à un volume final de 100 ml dans un milieu YPD dans un flacon à chicanes de 250 mL.
    NOTE: Un total de 100 ml de culture est nécessaire par réaction de TRO; si plusieurs réactions sont nécessaires, un plus grand volume de culture doit être utilisé.
  4. Cultiver les cellules à une densité optique de 0,8 à 1,0 à 600 nm (A 600 ~ 0,8 à 1,0).
  5. Récolter les cellules par centrifugation à 820 g pendant 5 min à 4 ° C dans un tube stérile de 50 ml conique.
  6. Resuspendre les cellules dans 10 ml de glace froide bu TMNffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl) et on incube sur de la glace pendant 5 min.
  7. Centrifuger à 820 g pendant 5 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules. Retirez délicatement le surnageant par aspiration.

2. perméabilisant et cellules Préparation pour Run-on Assay

  1. Resuspendre les cellules dans 1 ml de solution de sarkosyl 0,6% en pipetant doucement à l' aide d' un tronc P 1000 pointe. Transférer la suspension cellulaire à un tube de microcentrifugeuse réfrigérée de 1,5 ml.
  2. Secouer doucement les cellules à 4 ° C pendant 25 min sur un agitateur à plateau.
    NOTE: Les tubes de centrifuger doivent être emballés dans un tube de 50 ml conique avec de la glace pour maintenir une température froide, en évitant la possibilité de tout nouveaux événements d'initiation qui se produisent au niveau du promoteur à ce stade.
  3. Centrifuger les cellules à 1200 g pendant 6 min à 4 ° C en utilisant une table réfrigérée centrifugeuse.
  4. Aspirer doucement le surnageant pour éliminer tout excès de liquide de la perculot cellulaire meabilized.

3. Run-sur Transcription Réaction

  1. Ajouter 150 ul de la transcription d' exécution sur le tampon (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 100 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 2 mM de DTT (dithiothréitol), 0,75 mM de chacun des ATP, CTP, GTP et BrUTP, 200 U RNase inhibiteur) au culot de cellules perméabilisées.
  2. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas en utilisant un P 200 pointe tronquée.
    NOTE: Si le traitement de plusieurs échantillons, tout garder sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons sont prêts, puis passez à l'étape suivante.
  3. Incuber pendant 5 min à 30 ° C dans un bain d'eau.
    REMARQUE: Réglez le temps d'incubation de 1 à 5 min pour assurer l'incorporation optimale de BrUTP dans l'ARN naissant.
  4. Arrêter la réaction en ajoutant 500 pi de réactif à froid, prêt à l'emploi isolement de l'ARN. Incuber pendant 5 min à température ambiante.

4. Extraction de l'ARN

  1. Ajouter 200 ul de billes de verre lavées à l'acide à la suspensi cellulaire(étape 3.4), et agiter vigoureusement pendant 20 min à 4 ° C dans un mélangeur à vortex.
  2. Piquer le fond du tube à centrifuger à l'aide d'une 22 aiguille chaude G et placez-le sur le dessus d'un tube conique stérile de 15 ml.
  3. Centrifuger à 300 g pendant 1 min à 4 ° C pour recueillir le lysat cellulaire. Transférer le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
  4. Ajouter 500 ul d'ARN froid réactif d'isolement et de 200 ul de chloroforme au lysat cellulaire. Mélanger le contenu sur un mélangeur à vortex et centrifuger à 16168 xg pendant 20 min à 4 ° C.
  5. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
  6. Ajouter un volume égal de froid du phénol / chloroforme / alcool isoamylique (125: 24: 1) à pH 4-5. Agiter vigoureusement sur un mélangeur à vortex et centrifuger à 16168 xg pendant 15 min à 4 ° C.
  7. Transfert de l'ARN aqueuse supérieure de phase contenant un nouveau tube de microcentrifugeuse. Répétez l'étape 4.6 deux fois plus.
  8. À la phase aqueuse finale contenant de l'ARN, ajouter 5 M de NaCl stock pour obtenir une concentration finale de 0,3 M. Ajouter 3 fois le volume d'éthanol froid pour précipiter l'ARN.
    1. Incuber pendant 1 h ou une nuit à -20 ° C.
      REMARQUE: Effectuer les étapes 4.9 - 4.11 tandis que les perles anti-BrdU sont incubés pour le blocage (voir étape 5.3).
  9. Centrifuger à 16168 xg pendant 20 min à 4 ° C. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot d'ARN dans 100 pi de DEPC (pyrocarbonate de diéthyle) de l'eau.
  10. Utilisez un kit d'isolement de mini-ARN pour séparer l'ARN à partir des nucléotides BrUTP non constituées en société. Éluer l'ARN de la colonne avec 100 pi d'eau sans RNase.
  11. Incuber l'ARN dans un bain d'eau à 65 ° C pendant 5 min, puis transfert à la glace pendant au moins 2 min.

5. Purification par affinité de l'ARN marqué BrUTP

  1. Pour 25 pi d'anti-BrdU réglé perles, ajouter 500 pi de 0.25x SSPE (Sodium Saline Phosphate EDTA) de tampon de liaison (20x SSPE: 3 M de NaCl, 0,2 M NaH 2 PO 4 , 0,02 M d'EDTA, pH 7,4, 1 mM d'EDTA, 0,05% de Tween mM, NaCl 37,5). Centrifuger à 200 xg pendant 30 s à 4 ° C et retirer le surnageant.
  2. Répétez l'étape 5.1 trois fois.
  3. Ajouter 500 pi de tampon de blocage (1 x tampon de liaison, 0,1% de polyvinylpyrrolidone, 1 mg ultra-pure de sérum-albumine bovine (BSA)) pour les billes et agiter doucement pendant 1 - 2 h à 4 ° C sur un agitateur à plateau.
  4. Laver les billes deux fois avec 500 pi de tampon de liaison, tel que décrit dans l'étape 5.1.
  5. Ajouter 400 pi de tampon de liaison aux billes.
  6. Transférer 100 pi d'ARN (étape 4.11) directement sur les billes. Incuber en agitant doucement pendant 1 - 2 h à 4 ° C sur une plate-forme shaker.
  7. Laver les billes successivement avec 500 pi de tampon de liaison, 500 pi d'un tampon pauvre en sel (0,2 x SSPE, 1 mM d'EDTA, 0,05% de Tween), 500 ul de tampon à haute teneur en sel (0,25 x SSPE, 1 mM d'EDTA, 0,05% de Tween, NaCl 100 mM) et deux fois avec 500 pi de tampon TE TET (1x, 0,05% Tween), tournant à200 g pendant 30 s à 4 ° C entre chaque cycle de lavage.
  8. Éluer l'ARN BrUTP marqué à partir de billes de façon séquentielle, deux fois avec 150 pi et une fois avec 200 pi de tampon d'élution (20 mM de DTT, 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, EDTA 1 mM, SDS 0,1%), en incubant pendant 4 min à 42 ° C dans un bain d'eau suivie d'une centrifugation de courte durée pour séparer les billes du surnageant.

6. La précipitation de l'ARN BrUTP Étiqueté

  1. Ajouter 500 pi de froid du phénol / chloroforme / alcool isoamylique (125: 24: 1) à pH 4-5 à l'purifiée par affinité étiquetée BrUTP ARN. Mélanger dans un mélangeur à vortex et centrifuger à 16168 xg pendant 15 min à 4 ° C.
  2. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
  3. Ajouter 5 M NaCl disponible pour obtenir une concentration finale de 0,3 M et 3 fois le volume d'éthanol froid pour précipiter l'ARN.
  4. Incuber à -20 ° C pendant une nuit.
  5. Recueillir l'ARN précipité par centrifugation à 16.168 xg pendant 30 min à 4 ° C.
  6. Retirer le surnageant et laisser le culot sécher à l'air pendant 10 minutes.
  7. Remettre en suspension le culot d'ARN dans 26 ul d'eau DEPC.
  8. Déterminer la concentration finale d'ARN en mesurant l'absorbance à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre. En outre, déterminer le rapport 260/280. Un ratio ~ 2 est indicatif d'un échantillon d'ARN pur.
  9. Stocker les échantillons d'ARN dans des aliquotes à -80 ° C jusqu'à son utilisation pour la synthèse d'ADNc.

7. Transcription inverse de l'ARN BrUTP marqué

  1. Ajuster la concentration d'ARN à 100 ng / pl en utilisant de l'eau DEPC. Utiliser 0,5 ug d'ARN de chaque réaction de synthèse d'ADNc.
    Remarque: la concentration de matrice d'ARN peut varier de 0,5 à 1,0 pg pour obtenir la synthèse d'ADNc optimale.
  2. Transcription inverse de l'ARN en utilisant plusieurs amorces inverses conçus en aval du poly (A) site (site de terminaison) , comme indiqué sur la figure 3A.
  3. Pour chaque réaction de transcription inverse, ajouter 5 ul d'ARN template (0,5 pg), 1 pl de mélange de dNTP (10 mM chacun), 2 pi d'amorce inverse C, D, E, F ou G (50 uM chacun) (voir la figure 3A) et de l' eau sans nucléase. Le volume réactionnel final dans chaque tube est de 13 pi.
    NOTE: Le nombre de réactions de transcription inverse dépend du nombre d'amorces inverses utilisées pour la synthèse d'ADNc. Par exemple, ASC1 pour cinq amorces antisens ont été utilisés , et donc cinq réactions de transcription inverse ont été mis en place. Étiqueter les tubes comme C, D, E, F et G sur la base de l'amorce antisens utilisée pour la synthèse d'ADNc.
  4. Incuber les tubes contenant la matrice d'ARN, un mélange de dNTP et d'amorces dans un thermocycleur à 65 ° C pendant 5 min pour éliminer toute conformation structurelle secondaire, puis refroidir à 4 ° C pendant au moins 2 min.
  5. Ajouter 1 ul transcriptase (200 U / ul) inverse, tampon 4 pi et 2 pi de DTT 0,1 M dans chaque tube contenant la matrice d'ARN et l'amorce (étape 7.4). Mélanger en pipetant doucement monter et descendre.
  6. Effectuer une transcription inverse en faisant incuber le mélange réactionnel dans un thermocycleur à 42 ° C pendant 60 min.
  7. Inactiver la transcriptase inverse à 65 ° C pendant 20 min.
  8. Stocker l'ADNc à -20 ° C ou passer à l'étape suivante.

8. Amplification d'ADNc

  1. Effectuer la réaction de PCR pour l' amplification de chaque préparation d'ADNc (marqué C, D, E, F et G pour ASC1) de l' étape 7.8 comme suit: 3,0 ul d' ADNc matrice de l' étape 7.8, 1,0 ul amorce sens B (10 pM), 1,0 pl amorce inverse de C ou un tampon D ou E ou F ou G (10 de pM), 2,5 pl 10x polymerase PCR, 0,5 ul de mélange de dNTP (10 mM chacun), 1,0 ul de MgCl2 (2,5 mM) 15,5 eau de qualité uL PCR et 0,5 ul enzyme polymérase thermostable.
    REMARQUE: Les différentes dilutions d'ADNc matrice allant de 1: 5 à 1: 100 doivent être testés pour optimiser le rendement du produit de PCR. Un seul promoteur proximal amorce directe sera utilisée pour amplifier l'ADNcobtenus en utilisant différentes amorces inverses. Par exemple, une seule amorce B avant située à proximité du promoteur a été utilisé en combinaison avec cinq amorces inverses de C à G pour ASC1. BC, BD, BE, BF et BG ont été utilisés dans des tubes étiquetés comme C, D, E, F et G , respectivement , comme le montre la figure 3A.
  2. Exécutez le PCR en utilisant les paramètres des cycles thermiques suivants: 1 cycle 95 ° C pendant 2 min (démarrage à chaud pour l'activation de la polymérase), 30 - 40 cycles de 95 ° C pendant 30 s (dénaturation), 54 ° C pendant 15 s (recuit) , 68 ° C pendant 1 minute (extension), et 1 cycle de 68 ° C pendant 5 minutes (extension finale).
    REMARQUE: La température de recuit peut varier en fonction des amorces spécifiques utilisées et le temps d'extension varie en fonction de la taille attendue du produit.
  3. Séparer le produit de PCR par électrophorèse sur 0,8%, 1,5% ou 2% de gels d'agarose en fonction de la taille attendue du produit.
  4. Quantifier le produit de PCR comme décrit dans El Kaderi et al. 2012 11.
    REMARQUE: Vous pouvez également utiliser stratégie en temps réel RT-qPCR pour quantifier la quantité de transcrits naissants.

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Résultats

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Pour démontrer l'applicabilité de la procédure de TRO BrUTP brin spécifique dans la détection d' un défaut de terminaison de la transcription, nous avons utilisé, un mutant de RNA14 sensible à la température de terminaison défectueuse appelé rna14-1. Le rôle de Rna14 dans la terminaison de la transcription par l' ARN polymérase II a été démontrée en utilisant l'essai TRO traditionnel qui a détecté l' ARN dans la région de terminaison proximale de gènes choisis

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Discussion

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Le protocole TRO spécifique de brin utilisé ici a été adapté du protocole utilisé pour GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) analyse dans les cellules de mammifères 12. Nous avec succès le protocole modifié pour étudier la transcription naissante dans la levure bourgeonnante. Pour analyser précisément le défaut de terminaison de transcription, nous avons ajusté le protocole additionnel en se débarrassant de l'étape d'hydrolyse de l'ARN. Cela nous a permis de détecter spécifiquement la lo...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La recherche dans le laboratoire d’Ansari a été soutenue par la subvention de recherche (No. MCB 1020911) de la National Science Foundation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mélange phénol-chloroforme-alcool isoamyliqueSigma-Aldrich77619pH 4-5
Réactif TRIzolLife technologies15596-026
Inhibiteur de RNase, placenta humainNew England BiolabsM0307S
Perles anti-BrdUSanta Cruz Biotechnologysc-32323AC
Protoscript IINew England BiolabsM03368Lou une enzyme équivalente
Advantage 2 polymérase MixClontech639201ou une enzyme équivalente
5-Bromouridine 5' triphosphate sel sodiqueSanta Cruz Biotechnologysc-214314A
RNeasy Mini kitQiagen74104
ATPNew England BiolabsN0451AA
CTPN0454AA
GTPN0452AA
Albumine sérique bovine ultra-pure (BSA)MC LabsUBSA-100
Asc1 BAGATTCGTCGGTCACAAGTCC
Asc1 CGAACTTTATACATATTTTTAGTT
AGCAGTC
Asc1 DTGTACATATGTATTTTCGCAGCA
Asc1 EGCCAAGGAGACTGAATTTAATG
Asc1 FCTATGGAATGGGGGTTTTAAG
Asc1 GGGTTATGGCAGACATGCCAC
5s ADNcAGATTGCAGCACCTGAGT
5' 5s inverseGGTTGCGGCCATATCTAC
3' 5s inverseTGAGTTTCGCGTATGGTC

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Transcription TerminationBrUTP TROStrand Specific TROYeast CellsRNA PurificationNascent TranscriptsPolymerase DetectionPromoter TerminatorcDNA Synthesis

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