Article de méthode

Automatisé Contraction L'analyse des tissus humains Engineered cardiaque pour le dépistage de la sécurité cardiaque médicaments

DOI :

10.3791/55461

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15 avril 2017

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1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous montrons la génération de tissu cardiaque humain conçu à partir de cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) cardiomyocytes dérivée de. Nous présentons une méthode pour analyser la force de contraction et de modification à titre d'exemple de configuration de contraction de l'inhibiteur du canal hERG E-4031. Cette méthode montre haut niveau de robustesse et l'aptitude pour le dépistage des drogues cardiaque.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ingénierie de tissu cardiaque décrit des techniques pour constituer trois forces génératrices de dimensions tissus d'ingénierie. Pour la mise en œuvre de ces procédures dans la recherche fondamentale et le développement préclinique de médicaments, il est important de développer des protocoles pour la production et l'analyse automatisée dans des conditions normalisées. Nous présentons ici une technique pour générer du tissu cardiaque Engineered (EHT) de cardiomyocytes de différentes espèces (rat, souris, humaines). La technique repose sur l'assemblage d'un gel de fibrine contenant des cardiomyocytes dissociées entre les postes polydiméthylsiloxane élastique (PDMS) dans un format à 24 puits. En trois dimensions, HASTI produisant une force constituent dans les deux semaines après la coulée. Cette procédure permet la génération de plusieurs centaines de HASTI par semaine et est techniquement limitée que par la disponibilité des cardiomyocytes (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Evaluation des contractions musculaires auxotonique est effectuée dans une chambre d'incubation modifié avec un mécaninterlock ical pour plaques à 24 puits et une caméra placée au-dessus de cette enceinte. Un logiciel commande une caméra déplacée sur un système d'axes XYZ de chaque EHT. contractions EHT sont détectées par un algorithme de reconnaissance automatique de la figure, et la force est calculée sur la base de raccourcissement de la EHT et la propension élastique et la géométrie des postes de PDMS. Cette procédure permet une analyse automatisée des nombres élevés de EHT dans des conditions normalisées et stériles. La détection fiable des effets des médicaments sur la contraction des cardiomyocytes est crucial pour le développement de médicaments et la pharmacologie cardiaque de sécurité. Nous démontrons, avec l'exemple du système E-4031, que le EHT humain inhibiteur du canal hERG reproduit les réponses des médicaments sur la cinétique de contraction du cœur humain, ce qui indique qu'il est un outil prometteur pour le dépistage cardiaque de l'innocuité des médicaments.

Introduction

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effets secondaires cardiaques tels que le syndrome du QT long induite par le médicament ont conduit à des retraits du marché au cours des dernières années. Les statistiques indiquent qu'environ 45% de tous les prélèvements sont dus à des effets indésirables sur le système cardio - vasculaire 1. Cette défaillance du médicament après le processus de développement coûteux et l'approbation est le pire scénario pour les entreprises pharmaceutiques. services de recherche et de développement se concentrent donc sur la détection de ces effets cardiovasculaires indésirables tôt. Pour des questions économiques et éthiques, les efforts visant à réduire l' expérimentation animale et les remplacer par de nouveaux tests de dépistage in vitro sont en cours.

Un ensemble de tests établis sont inclus dans les lignes directrices et des aliments aux États-Unis Drug Administration (FDA) et l' Agence européenne des médicaments (EMA) pour l' évaluation préclinique des effets des médicaments proarythmiques 2. La technologie de cellules somatiques suivi reprogrammation par la différenciation desLes cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) stimulé ce champ de recherche 3. Il offre maintenant la possibilité de dépister de nouveaux médicaments candidats sur cardiomyocytes humains in vitro et évite les problèmes avec des différences entre espèces. Protocoles de différenciation cardiaques récents 4, 5 fournissent l' offre illimitée de cardiomyocytes sans souci éthique. Cependant, la mesure de la force contractile, le plus important et le mieux caractérisé en ce paramètre vivo de cardiomyocytes, est pas bien établie. Ceci est lié à la relative immaturité 6 des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) par rapport à la cardiomyocytes adulte. Un progrès possible est de concevoir trois dimensions du tissu cardiaque à partir de cellules individuelles 7 (ingénierie tissulaire cardiaque, EHT). Le protocole EHT est basée sur l' incorporation des cardiomyocytes humains ou murins unique 8 sup>, 9, 10 en hydrogel de fibrine entre deux postes polydiméthylsiloxane flexible (PDMS) 11 en format 24 puits. En quelques jours, les cardiomyocytes commencent à se contracter spontanément comme des cellules individuelles et commencent à former des réseaux cellulaires. Après 7-10 jours, les contractions macroscopiques du tissu entier sont visibles. Au cours de ce processus est remodelé la matrice extracellulaire, ce qui conduit à une diminution du diamètre et de la longueur. Le raccourcissement des résultats EHT en flexion des PDMS même post pendant le repos, la soumission cardiomyocytes dans le développement EHT à la charge continue. HASTI continuent d'effectuer des contractions musculaires auxotonique pendant plusieurs semaines. HASTI humains montrent des réponses à la stimulation physiologique et pharmacologique indiquant leur aptitude à modéliser le dépistage des drogues et de la maladie 7.

Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole robuste et facile pour les generatisur de EHT humain, et l'analyse de la contractilité automatisée des changements dépendant de la concentration du motif de contraction en présence d'inhibiteurs du canal hERG.

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Protocole

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REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent un protocole de culture cellulaire. S'il vous plaît effectuer dans des conditions stériles et utiliser les médias préchauffées.

1. La différenciation cardiaque des hiPSC

  1. Cultiver le hiPSC
    1. Manteau de plaques à 6 puits (1 ml / puits) ou des flacons T75 (7 ml / flacon) avec un facteur de croissance réduite matrice de membrane basale (par exemple geltrex, 1: 200; voir le tableau des matériaux) dilué dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) pour 30 min à 37 ° C. Préparer moyen FTDA 12 par mélange du milieu DMEM / F-12 de base avec 2 mM de L-glutamine, 0,5% de pénicilline / streptomycine, 5 mg / L transferrine, 5 sélénium ug / L, 0,1% d' albumine de sérum humain, 1x lipide-mix, 5 mg / L d'insuline, 50 nM dorsomorphin, 2,5 ng / ml d'activine A, 0,5 ng / mL de TGFß1 humain et 30 ng / ml de FGF2.
    2. HiPSC des semences (~ 3 x 10 5/10 cm²) dans un milieu FTDA et la culture à 37 ° C, 5% CO 2, 21% de O 2 avec changement de milieu tous les jours (Figure 1A). À 80% de confluence, le passage (1: 2-1: 6) avec l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA; 0,5 mM, le temps d'incubation ~ 4 min).
  2. La formation de corps embryoïdes (EB)
    1. Cultiver hiPSC dans des flacons T75 à haute densité.
      1. Laver les flacons avec des cellules confluentes à deux reprises avec une solution saline tamponnée au phosphate sans calcium et magnésium (PBS) et incuber dans 0,5 mM d'EDTA pendant ~ 10 min. Assurez-vous que les cellules ne se détachent pas du fond du flacon.
      2. Retirer EDTA avec pipette en verre, rincer à cellules avec 10 ml de PBS, flacons de robinet au banc pour détacher les cellules.
        REMARQUE: Utiliser grattoir cellulaire si nécessaire.
      3. Recueillir les cellules dans un tube conique de 50 ml, ajouter ¼ de volume (par exemple 10 ml RPMI à 40 ml de suspension cellulaire) du milieu RPMI 1640 (ou tout autre moyen classique contenant 1,8 mM de calcium) et centrifuger à 250 g pendant 5 min.
    2. Resuspendre culot de cellules dans du milieu additionné de FTDA 4 mg / ml d'alcool polyvinylique (PVA) et10 uM Y27632 et compter les cellules dans une chambre de Neubauer.
    3. Remplir le flacon à rotation avec la suspension de cellules (30 x 10 6 cellules / 100 ml de milieu FTDA additionné de PVA et Y-27632; voir l' étape 1.2.2) et initier la formation EB dans des flacons à centrifuger (régler la vitesse du rotor d' un agitateur magnétique à 40 tours par minute ) dans l'incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2, 5% de O 2) pendant une nuit.
  3. Différenciation mésodermique
    1. Pendant la formation EB, la culture de cellules d'enveloppe flacons appropriés pour une culture en suspension avec un agent tensioactif non ionique (14 mL / T175) pendant une nuit à 37 ° C.
    2. Le lendemain matin, lavage des flacons revêtus d'agents tensioactifs deux fois avec du PBS (30 ml / T175). Ajouter à nouveau PBS et maintenir dans l'incubateur jusqu'à ce que nécessaire.
    3. Retirez le flacon à rotation de l'incubateur.
      REMARQUE: la suspension cellulaire doit être clair avec de petites EB macroscopiquement visibles (figure 1B).
    4. Transfert de suspension 50 ml à une cuve conique de 50 mle et se contenter de laisser EBs min 5-20.
    5. Eliminer le surnageant et laver le culot avec 7 ml de RPMI 1640 additionné de 2% de PVA et 10 uM Y-27632. suspension des transferts à un tube conique de 15 ml graduée et estimation du volume EB (~ 50 à 100 uL).
    6. Transférer le contenu des flacons spinner à flacons T175 non couchés et laisser sur support en forme de V pour la sédimentation jusqu'à 20 min. Retirer le surnageant et laver les corps embryoïdes comme indiqué ci-dessus. Ne pas remplir le flacon T175 avec plus de 200 ml que la sédimentation prendrait trop de temps. Si le volume initial de ballon rotatif est supérieure à 200 ml, diviser la suspension EB à plusieurs flacons T175 et mélanger à nouveau après le lavage EBs.
    7. Retirer le milieu de lavage et remise en suspension dans un milieu de différenciation mésodermique, qui est RPMI additionné de 4 mg / ml de PVA, 0,5% de pénicilline / streptomycine, 10 mM de 4- (2-hydroxyéthyl) -1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES), 0,05% de sérum humain l'albumine, 5 pg / ml de transferrine, 5 ng / ml de sélénite de sodium, un mélange de 0,1% de lipides, 250 uM phospho-ascorbate, 10 uM Y-27632, 10 ng / mL os, et 3 ng / ml d'activine protéine morphogénique-4 (BMP-4), 5 ng / ml de FGF2 stable.
    8. Retirer le PBS de flacons T175 revêtues d'agents tensioactifs et remplir de suspension cellulaire (200 ul EB dans 40 mL). Utilisez de petits flacons pour le volume EB plus petit.
    9. Cultiver EB en suspension pendant trois jours (37 ° C, 5% de CO 2, 5% de O 2). Echange 50% du milieu (même composition que dans l'étape 1.3.7) tous les jours (utilisation de l'armoire de sédimentation en forme de V). Préparer tous les jours du milieu frais avant l'alimentation.
  4. différenciation cardiaque
    1. Préparer de nouveaux vaisseaux enduit surfactant la veille et traiter comme indiqué ci-dessus (1.3.2).
    2. Après trois jours d'induction mésodermique, laissez EBs se contenter de jusqu'à 5 min sur la grille de sédimentation. Éliminer la majeure partie du milieu et laver avec du RPMI 1640 additionné de 0,5% de pénicilline / streptomycine et 10 mM d'HEPES.
    3. Transférer 10 ml de suspension EB à graduétube de 15 ml et estimer le volume EB après la sédimentation.
    4. Resuspendre EB soigneusement dans un milieu de différenciation cardiaque consistant en RPMI 1640 supplémenté avec 0,5% de pénicilline / streptomycine, 10 mM HEPES, 0,05% d'albumine de sérum humain, 5 ug / ml de transferrine, 5 ng / ml de sélénite de sodium, un mélange de 0,1% de lipides, 250 uM phospho ascorbate, 1 uM Y-27632, 100 nM Wnt-inhibiteur DS-I-7 13.
    5. Transfert à de nouveaux flacons EBs de culture cellulaire enduit tensioactif (~ 200 ul dans 46 ml EBs / T175).
    6. Incuber pendant trois jours (37 ° C, 5% CO 2, 21% de O 2) avec 50% de changement moyen (composition moyenne voir l' étape 1.4.4) sur le deuxième et troisième jour. Ne pas modifier le milieu dans les 48 premières heures.
    7. Incuber dans un milieu constitué de RPMI 1640 additionné de 500 uM de 1-thioglycérol, 10 mM de HEPES, 0,5% de pénicilline / streptomycine, 1 uM Y-27632, 2% de supplément de culture cellulaire neurale exempt de sérum (par exemple , B27) , l' insuline, 100 nM Wnt -inhibitor DS-I-7 avec échange quotidienne de 50% moyen pour les quatre prochains jours. Devraient commencer à battre EBs pendant cette période.
    8. Après une semaine de la différenciation cardiaque, passez au même milieu sans inhibition Wnt et avec la culture de cellules neurales sans sérum supplément. Changer 50% du milieu tous les jours, sauf pour le premier jour.
  5. Dissociation des cardiomyocytes humains
    NOTE: Après deux semaines de protocole de différenciation EbS doit montrer des contractions spontanées (Figure 1C). Si oui, commencer la dissociation et préparer la solution de collagénase.
    1. Préparer la collagénase solution en pesant et en résolvant 200 U / ml dans une solution saline équilibrée de Hanks exempte de calcium sans calcium / magnésium (HBSS) et ajouter 1 mM de HEPES, 10 uM Y-27632, 30 uM de N-benzyl-p-toluène sulfonamide ( BTS). Stériliser par filtration (filtre de 0,2 um) et des aliquotes de stocker à -20 ° C. Décongeler aliquotes à 4 ° C pendant la nuit.
    2. Installez-vous sur la grille de ballasts électroniques sédimentation,moyen d'aspiration et le remplacer par 20 à 25 ml de HBSS préchauffé. Répétez une fois de plus cette étape de lavage.
    3. Aspirer HBSS et le remplacer par une solution de collagénase préchauffé (15 mL / T175). Incuber pendant 4 heures dans l'incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO 2, 21% O 2).
    4. Préparer du tampon de blocage avec du DMEM additionné de 1% de pénicilline / streptomycine et de la DNase (12 ug / mL).
    5. Appuyez sur les flacons de culture cellulaire sur le banc, dissociées devrait se désintégrer et EBs tomber en morceaux (sinon, augmenter le temps d'incubation). suspension cellulaire doucement trituré et transférer dans un tube conique de 50 ml. Laver les flacons avec un tampon de blocage (15 mL / T175) et le transférer dans le tube.
    6. Centrifuger pendant 10 min à 100 x g. Resuspendre les cellules dans DMEM chaud, trituré et compter les cellules.

2. Génération d'ingénierie tissulaire cardiaque (EHT)

  1. Autoclave racks PDMS disponibles dans le commerce et les entretoises de polytétrafluoréthylène (PTFE) (voir Matériels etTableur de l' équipement; La figure 2) et de préparer les solutions suivantes dans des conditions stériles, un jour avant la génération EHT.
    1. Préparer 2% d'agarose en pesant et en dissolvant dans un volume approprié de PBS, autoclave, stocker immédiatement à 60 ° C.
    2. Préparer l'aprotinine (33 mg / mL) en pesant et en dissolvant dans un volume approprié de iniectabilia d'annonces Aqua, filtre stérile (filtre de 0,22 um), aliquote et stocker à -20 ° C.
    3. Préparer le fibrinogène (200 mg / mL) en dissolvant le fibrinogène stérile dans un volume approprié de NaCl à 0,9% stérile (tiède), aliquote et stocker à -20 ° C.
    4. Préparer la thrombine (100 U / mL) en dissolvant la thrombine stérile en trois parties du PBS stérile et 2 parties d'aqua iniectabilia d'annonces, des portions aliquotes de 3 ul dans de petits tubes et conserver à -20 ° C.
    5. Préparer 10x DMEM en dissolvant 670 mg 10x DMEM poudre dans 5 ml d'eau iniectabilia d'annonces, filtre stérile et conserver à 4 ° C.
    6. Préparer 2x DMEMen mélangeant 2 ml de DMEM 10X avec 2 ml de sérum de cheval inactivé par la chaleur, 0,2 ml de pénicilline / streptomycine et 5,8 ml iniectabilia eau publicitaires, filtre stérile et conserver à 4 ° C.
    7. Préparer le milieu sous pression EHT (ECM) par mélange DMEM avec 10% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur, 1% de pénicilline / streptomycine et 1% de L-glutamine (200 mM), entreposer à 4 ° C.
  2. Préparer des moules de coulée dans des plaques à 24 puits par pipetage de 1,6 ml d'agarose à chaud (2%, PBS) et en plaçant l'élément d' espacement de PTFE (Figure 2A) dans les puits.
    REMARQUE: La place entretoise immédiatement après pipetage dans un maximum de 8 puits - agarose se solidifie très rapidement. Ne laissez pas l'agarose à la température ambiante pendant plus de 5 min.
  3. Après solidification d' agarose (~ 10 min, de l' agarose tournera opaque), retirer les espaceurs en PTFE (figure 2C) et placer les supports de PDMS (figure 2B) dans les moules de coulée de sorte que des paires de poteaux PDMS atteindre dans chaque moule (figure 2D).
  4. Resuspendre les cardiomyocytes dans ECM avec une concentration minimale de 15 x 10 6 cellules / ml.
  5. Préparez 110% du tube volume de mélange de reconstitution dans un fond rond de 15 mL estimée sur ice.For 24 HASTI, une pipette le mélange de reconstitution énumérés dans le tableau 1 pour les cardiomyocytes humains, de rat ou de souris, respectivement (10% supplémentaire est inclus).
    REMARQUE: La concentration cellulaire du mélange de reconstitution est différente pour l' homme (10 x 10 6 cellules / ml), de rat (4,1 x 10 6 cellules / ml) et de souris (6,8 x 10 6 cellules / ml) HASTI. En fonction de la concentration de la suspension cellulaire, ajouter ECM supplémentaire à un volume final de 2640 ul. Fibrinogène doit être tiède pour pipetage. Remplissez lentement la pointe de la pipette et ne pas toucher la surface du mélange de reconstitution froide avec la pipette contenant le fibrinogène lors de l'ajout fibrinogène au mélange de reconstitution - la viscosité du fibrinogène dans la pointe de la pipette augmenterait immédiatement.
  6. Triturer le mélange de reconstitution 10 - 15 fois avec une pipette sérologique jusqu'à ce que le caillot de fibrinogène est dissous. Vérifiez le mélange de reconstitution dans la pipette d'homogénéité.
  7. Pour chaque EHT, pipeter 100 uL mélange de reconstitution dans une portion aliquote de la thrombine (3 pi dans le tube 200 ul), mélanger et pipetter le mélange dans les fentes d'agarose aussi rapidement que possible (figure 2E). Utiliser un nouvel embout de filtre pour chaque EHT. Remettre en suspension le mélange de reconstitution (avec pipette sérologique trituration 5-10 fois) après 8 HASTI.
  8. Une fois que toutes les fentes sont remplies avec le mélange de reconstitution, fermer le couvercle de la boîte de culture de cellules et incuber à 37 ° C, 7% CO 2 pendant 2 h.
  9. Retirer la plaque de l'incubateur et placer sous une hotte stérile. Couvrir chaque puits avec une petite quantité de milieu (par exemple DMEM, à environ 200 - 500 pl), agiter doucement la plaque et incuber à nouveau à 37 ° C pendant au moins 10 min. L'addition de DMEM facilitera l'enlèvement à partir de gels de fibrine à partir de moules de coulée d'agarose.
  10. Préparer une nouvelle plaque de 24 puits avec 1,5 mL EHT-milieu par puits consistant en DMEM additionné de 10% de sérum de cheval inactivé par la chaleur, 1% de pénicilline / streptomycine, 10 pg / ml d'insuline, 33 ug / ml d'aprotinine.
  11. Retirer délicatement les grilles PDMS à partir des moules de coulée d'agarose et les transférer sur le support rempli de plaque à 24 puits (figure 2F). Placer la cuvette dans l'incubateur (37 ° C, 7% CO 2, 40% de O 2 pour HASTI humain et de rat, 21% de O 2 pour HASTI de souris) et les aliments lundi, mercredi et vendredi avec EHT-milieu fraîchement préparé. HASTI devraient montrer des contractions spontanées dévier les messages des racks PDMS 7-10 jours après la coulée (figure 1D, 2G).
    1. Pour HASTI souris ajouter 25 pg / ml de βDarabinofuranoside 5 cytosine au milieu de culture pendant 48 heures afin de limiter la prolifération des fibroblastes.

3. Analyse de Contraction

NOTE: L'analyse de la contraction est basée surenregistrement vidéo-optique dans un instrument d'analyse EHT disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux). L'unité centrale de cet instrument est une chambre d'incubation (Figure 3A). Le logiciel fourni avec l'instrument calcule la force de contraction en fonction de la déviation des messages de PDMS avec le module d' élasticité et de la géométrie connue 11 (complémentaire Figure 1).

  1. Mettre en marche le dispositif de chauffage de la machine 2 h avant la mesure. Allumez l'alimentation en gaz et la fourniture électronique du système d'axe immédiatement avant l'analyse de la contraction.
  2. Pour l' enregistrement de référence (point de référence dans l'analyse), placez le 24 puits plaque avec les HASTI dans EHT-milieu dans l'instrument d'analyse EHT et lancer le logiciel d'analyse de contraction selon le manuel du fournisseur.
    1. Cliquez sur l'onglet « Protocole » sur le panneau droit et saisir des informations pertinentes concernant le nom de l'étude, l'utilisateur, les espèces, CEtype II, l'âge, la durée d'enregistrement et de remarques supplémentaires.
    2. Cliquez sur l'onglet « Vue de la caméra » sur le panneau gauche et la caméra démarrer le mode en temps réel avec le mode de détection automatique de la figure. Cliquez sur l'onglet « Configuration » sur le panneau de droite etrégler la position de la caméra avec les coordonnées xyz pour chaque puits dans le bien-plat 24. Assurez-vous que le EHT est au centre de la fenêtre et la mise au point de la caméra.
      1. Assurez-vous que le couvercle de la boîte de culture cellulaire n'est pas brumeuse comme cela gênera la reconnaissance et l'analyse de la contraction figure.
        NOTE: L'algorithme de reconnaissance de chiffre est basé sur la détection des zones de contraste élevé et le suivi de leur changement de position. Dans le logiciel de reconnaissance de ces domaines figure seront marqués d'une croix bleue qui se déplace avec les contractions de l'EHT.
      2. Assurez - vous que les positions des croix bleues sont à la fois les extrémités supérieure et inférieure de l'HASTI et le déplacement correspondant à seulement verticalement les contractions des HASTI (figure 3B). Spositions de configuration ave de chaque puits en appuyant sur la touche « position ok ».
    3. Ensuite, cliquez sur l'onglet « Paramètres » sur le panneau gauche. Les paramètres affichés ici définissent les critères par lesquels le logiciel identifie un pic de contraction et il marque avec un carré vert. Ces valeurs sont très importantes pour l' identification correcte des pics de contraction (figure 3C) et pas de points de données fausses (Figure 3E-F).
      NOTE: Une liste des espèces et des exemples de paramètres dépendants est représenté à la figure 3H. Pour plus de détails, s'il vous plaît consulter le manuel du logiciel.
    4. Cliquez sur l'onglet « automatique » sur le panneau de droite et de lancer l'analyse en activant le bouton « Démarrer ». Le logiciel se déplacera successivement d'un puits à l'autre, et enregistrer les contractions EHT calculer la force pendant l'enregistrement (affiché dans l'onglet « temps réel » sur le panneau de gauche). A la fin de l'analyse, un rapport pdf summarizing les résultats seront générés automatiquement.
  3. Enregistrer et analyser le rapport pdf système généré pour résumer les résultats.
  4. Surveiller les paramètres contractiles par des mesures répétées sur plusieurs jours. Le EHT augmentera la force de contraction jusqu'à ce qu'elle ait atteint un plateau (généralement autour de jour 15 de la culture).
  5. Dépistage de drogues
    1. Préparer protéine solution de Tyrode libre un jour avant la mesure et équilibrer dans des plaques à 24 puits (2 mL / puits) dans l'incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 7% CO 2, 40% O 2) pendant une nuit: 120 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 0,1 à 5 mM de CaCl2, 0,4 mM de NaH 2 PO 4, 22,6 mM de NaHCO3, 5 mM de glucose, 0,05 mM Na 2 EDTA, 25 mM de HEPES. Additionnez de calcium à 1,8 mM ou déterminé précédemment [CE 50] pour étudier les effets inotropes positifs.
    2. Peser et dissoudre le médicament dans le DMSO et le filtre stérile, le cas échéant.Préparer 6 différentes solutions 1000x-sous-actions (dans du DMSO) à la concentration de travail (par exemple 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 uM pour la gamme nanomolaire) respective.
    3. Diluez le stock respectif dans les plaques de Tyrode (2 pi dans chaque puits de 2 ml) et bien mélanger. Placez les plaques dans l'incubateur jusqu'à ce que nécessaire.
    4. Commencer la mesure de référence en prenant la première 24 puits de la plaque remplie de Tyrode-stériles sous le capot et la position des électrodes carbone dans les puits. Transférer les racks PDMS avec les HASTI placés au-dessus des électrodes de carbone, fermer le couvercle, placer la plaque dans l'incubateur et attendre une période d'équilibrage de 30 min ~.
    5. Transférer les HASTI de l'incubateur au verrouillage dans l'instrument d'analyse EHT. Fermez l'instrument et enregistrer la contractilité base spontanée (20 s / EHT).
    6. Connecter les électrodes de carbone au câble de stimulation et de commencer la stimulation électrique des HASTI (2,5 V, 4 ms de durée d'impulsion, de l'homme: ~ 1 Hz, rat: ~ 2Hz, souris: ~ 4 Hz). Enregistrez la ligne de base "rythme" (10 s / EHT). Assurez-vous que tous les HASTI sont correctement arpenté. la fréquence de stimulation et la tension peut varier de la lignée cellulaire de la lignée cellulaire.
    7. Après l'enregistrement de référence, retirer les HASTI de l'appareil et transférer les électrodes avec les crémaillères PDMS sur le dessus, pour le bien-plaque 24 avec la première concentration de médicament. Transférer le HASTI arrière sur le dispositif de verrouillage de l'instrument d'analyse EHT immédiatement et incuber il (temps d' incubation de médicament standard , par exemple 20 min).
    8. Reconnecter les câbles de stimulation, ajuster la reconnaissance de la figure et l'enregistrement des contractions EHT répondant à la première concentration de médicament.
    9. Pour les concentrations de médicaments suivants, répéter l'étape 3.5.7 et 3.5.8 avec les 24 puits à des plaques contenant des concentrations de médicament plus élevées.
    10. Enregistrer tous les enregistrements pdf. Vérifiez chaque enregistrement pour la reconnaissance de la figure, le positionnement correct des carrés verts identification des pics de contraction et des artefacts (voir 3.2.1 et Figure 3 ).
    11. Effectuer une analyse hors - ligne supplémentaire si nécessaire.
      1. Choisissez la course respective de la base de données « Runs » sur le panneau de gauche en cliquant sur « Select run ». Dans l'onglet « Paramètres » à gauche, modifier le paramètre pour l'analyse de la contraction. Maintenant, choisissez « analyse hors ligne » dans l'onglet « Hors ligne » sur le panneau droit de réanalyser les vidéos.
      2. Pour régler la reconnaissance de la figure et donc enregistrer un nouveau fichier vidéo, choisissez « examen de l'échantillon » après ajustement de la reconnaissance figure dans l'onglet « temps réel ». REMARQUE: examen de l'échantillon ne peut réanalyser un puits à la fois, alors que l'analyse hors ligne peut appliquer de nouveaux paramètres pour tous les puits en cliquant sur le bouton « paramètre utilisation sur tous les puits » dans le panneau « Paramètres » à gauche. Les deux types d'analyses hors ligne crée automatiquement de nouveaux fichiers de données et pdf afficher les résultats.
    12. Analyser l'expérience en combinant les résultats du biologiques réplique et résumer les données de courbes de réponse de concentration pour la fréquence, la force de contraction, le temps de contraction et de temps de relaxation (Figure 5D) et / ou l' affichage graphique des pics de contraction moyenne (Figure 5C).
      REMARQUE: Les barres de PDMS et l'entretoise de PTFE peuvent être utilisés de façon répétée (PDMS racks max 5 fois, et PTFE entretoise à l'infini.). Après utilisation, nettoyez-les avec de l'eau manuellement, faire bouillir deux fois dans de l'eau déminéralisée et autoclave. Soyez conscient des effets potentiels de report, en cas de réutilisation des supports, comme les médicaments peuvent être absorbés par les PDMS.

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Résultats

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Différenciation cardiaque et préparation de EHT

HiPSC ont été étendus sur le facteur de croissance réduite matrice de la membrane basale, dissociées avec EDTA et corps embryoïdes (EbS) formés dans des flacons spinner pendant la nuit. Après l'induction mésodermique pendant trois jours, la différenciation cardiaque a été initiée avec l'inhibiteur Wnt. Après ~ 17 jours de protocole de différenciation, en battant EB ont été dissociée...

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Discussion

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tissu cardiaque conçu offre une option valable à la boîte à outils de la recherche cardiovasculaire. HASTI dans le format de 24 puits se sont révélés utiles pour la modélisation de la maladie 8, 14, le dépistage de l' innocuité des médicaments 7, 8, 10, 11, 15, ou la recherche cardiovasculaire de ...

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Déclarations de divulgation

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IM, TE et AH sont co-fondateurs de EHT Technologies GmbH, Allemagne.

Remerciements

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Les auteurs remercient Alessandra Moretti et Dennis Schade pour leur contribution type de matériel. Nous reconnaissons le grand soutien du groupe de travail iPS et EHT au Département de pharmacologie et de toxicologie expérimentale de l'UKE. Le travail des auteurs est pris en charge par des subventions du DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire) et le ministère allemand de l'éducation et de la recherche (BMBF), la Fondation allemande pour la recherche (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), Centre national britannique pour le remplacement Raffinement et réduction des animaux en recherche (NC3Rs CRACK-IT accorde 35911-259146), la British Heart Foundation RM / 13/30157, le Conseil européen de la recherche (Advanced Grant IndivuHeart), la Fondation allemande du cœur et la ville libre et hanséatique de Hambourg.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Instrument d’analyse EHTEHT Technologies GmbHA0001Le logiciel est inclus
EHT PDMS rackEHT Technologies GmbHC0001
EHT PTFE spacerEHT Technologies GmbHC0002
EHTelectrode EHT Technologies GmbHP0001
EHT pace adaptateur/câbleEHT Technologies GmbHP0002
Plaque à 24 puitsNunc144530
Plaque de culture cellulaire à 6 puitsNunc140675
tube de faucon de 15 mL, gradué.Sarstedt62,554,502
Racleur à cellulesSarstedt831,830
Fiole tournanteIntegra182 101
Agitateur Variomag/ Cimarec Biosystem Direct  ;Thermo scientific70101Régler la vitesse du rotor à 40 tr/min
Fiole de culture cellulaire T175  ;Sarstedt  ;831 812 002
Crémaillère de sédimentation en VFabriqué sur mesure chez UKE Hamburgna
10& fois ; DMEMGibco52100
1-Thioglycérol  ;Sigma AldrichM6145
Acide 2-phospho-L-ascorbique sel trisodiqueSigma Aldrich49752
Activine-A  ;R& D systems338-AC
Agarose  ;Invitrogen15510-019
AprotininSigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS insuline  ;Gibco17504-044
BMP-4R& D systems314-BP
Collagénase II  ;WorthingtonLS004176
DMEMBiochromF0415
DMSO  ;Sigma AldrichD4540
DNase II, type V (à partir de la rate bovine)Sigma  ;D8764
Dorsomorphine  ;abcamAB120843
EDTA  ;Roth8043.2
Sérum de veau fœtalGibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
Fibrinogène (bovin)Sigma AldrichF8630
Geltrex  ;GibcoA1413302Pour l’enrobage : dilution 1:200
HBSS sans Ca2+/Mg2+s ;Gibco14175-053
HEPES  ;Roth9105.4
Sérum de chevalTechnologies de la vie26050088
Albumine sérique humaineBiological Industries05-720-1B
Insuline humaineSigma AldrichI9278
L-GlutaminGibco25030-024
Lipidmix  ;Sigma AldrichL5146
MatrigelBD Biosciences354234Pour EHT reconstitutionmix.
N-Benzyl-p-ToluènesulfonamideTCIB3082-25G
PBS sans MgCl2/CaCl2Biochrom14190
Pénicilline/StreptomycineGibco15140
Pluronic F-127  ;Sigma AldrichP2443
Alcool polyvinylique  ;Sigma AldrichP8136
RPMI 1640  ;Gibco21875
Sélénite de sodiumSigma AldrichS5261
TGFß ; 1Peprotech100-21
ThrombinSigma AldrichT7513
Transferrin  ;Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCFabriqué sur mesure à l’UKE hamburgna
iCell cardiomyocyteskit Cellular Dynamics InternationalCMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocytekit PluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocyteskit Axiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytesTakara Bio USA, Inc.Y10075

Références

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  27. EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.

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Mots-clés

Assemblage de gel de fibrinepiliers en PDMSmesure de forced tection par cam raalgorithme de reconnaissance de figuresinhibition du canal hERGr ponse pharmacologique l E 4031

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