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Article de méthode

La purification de l'ADN de haut poids moléculaire Génomique de oïdium pour le séquençage de longue Lire

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DOI :

10.3791/55463

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31 mars 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California Berkeley, 2John Innes Centre, Norwich Research Park, 3Department of Plant and Microbial Biology, University of Zürich, 4USDA-ARS Sunflower and Plant Biology Research Unit

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

décrit ici une méthode d’extraction, de purification et de contrôle de la qualité de l’ADN génomique de l’agent pathogène fongique biotrophe obligatoire, l’oïdium, pour une utilisation dans le séquençage du génome à lecture longue.

Résumé

Les champignons oïdium sont un groupe d'agents pathogènes des plantes fongiques économiquement importantes. On sait peu de choses sur la biologie moléculaire et de la génétique de ces agents pathogènes, en partie en raison d'un manque de ressources génétiques et génomiques bien développées. Ces organismes ont de grands génomes répétitifs, qui ont fait le séquençage du génome et de l'assemblage prohibitive difficile. Nous décrivons ici les méthodes de collecte, de l' extraction, la purification et l' évaluation du contrôle de la qualité de l' ADN génomique de haut poids moléculaire d'une espèce de oïdium, Golovinomyces cichoracearum. Le protocole décrit comprend une rupture mécanique de spores suivi d'un phénol optimisé / chloroforme extraction de l'ADN génomique. Un rendement typique était de 7 pg d'ADN par 150 mg de conidies. L'ADN génomique est isolé en utilisant cette procédure est appropriée pour le séquençage de longue lecture ( par exemple,> 48,5 kpb). mesures de contrôle de la qualité pour assurer la taille, le rendement et la pureté de l'ADN génomique sont égalementdécrit dans le présent procédé. Le séquençage de l'ADN génomique de la qualité décrite ici permettra l'assemblage et la comparaison des génomes multiples de l'oïdium, qui à son tour conduire à une meilleure compréhension et un meilleur contrôle de ce pathogène agricole.

Introduction

Oïdium sont un groupe de plantes fongique biotrophe obligatoire des agents pathogènes qui, lorsqu'ils sont pris ensemble, sont la principale cause de maladies des plantes dans le monde entier 1. Il y a plus de 900 espèces décrites de l' oïdium, qui ont été regroupées en cinq taxonomiquement tribus au sein de la famille Erisyphaceae 2. En raison de leur importance à la fois économique et la relation intime qu'ils développent avec leurs hôtes, les maladies oïdium ont fait l'objet de la recherche pour> 100 ans. Lors de l'infection, l'oïdium provoquent des changements radicaux dans la structure cellulaire, le métabolisme et la biologie moléculaire de leurs hôtes, de bénéficier de ce pathogène. Cependant, l'étude de l' oïdium est particulièrement difficile en raison de leur mode de vie obligatoire, et la croissance du champignon en culture pure n'a pas encore été décrit 3, 4, 5,"xref"> 6, 7, 8. Fiable, la transformation génétique stable de l' oïdium a pas encore été accompli, bien que la transformation transitoire a été rapportée chez certaines espèces 9, 10.

Le séquençage et l'assemblage des génomes oïdium est avéré difficile en raison d'un certain nombre de caractéristiques du génome lui-même. Génomes de l' oïdium sont grandes (120-180 Mbp) par rapport à d' autres génomes fongiques, et se composent de 60 - 90% des éléments répétitifs répartis uniformément 11. Ces éléments comprennent des répétitions terminales non-longues, ainsi que des éléments répétitifs non catégorisés. Deux formae d'une Speciales seule espèce oïdium, Blumeria graminis f. sp. hordei et f. sp. tritici (BGH et Bgt, respectivement), ainsi que l'oïdium de la vigne Erysiphe necator, ont abeillen séquencés, et les projets de génomes pour plusieurs autres ont été réalisées 12, 13, 14. Le caractère répétitif des génomes a fait l' assemblage difficile, et le génome Bgh complété a été assemblé en 6,989 supercontigs avec un L50 de 2 Mb 12.

Malgré le grand génome, les oïdium semblent avoir un petit nombre de gènes codant pour des protéines, avec 5,845 et 6.540 gènes prédits dans Bgh et Bgt, respectivement. Les oïdium séquencés semblent également manquer au moins 99 gènes essentiels qui sont essentiels dans d' autres champignons, ce qui est cohérent avec la dépendance des champignons sur leur plante hôte pour la survie 11, 12, 13, 14.

séquences répétitives proches de télomères, centromères, ribosomal RNA matrices de gènes et des régions enrichies en éléments transposables sont mal assemblés à partir de stratégies de séquençage courte lecture et sont souvent sous-représentés dans les assemblages de génome 15. Ces régions sont considérées comme responsables de bon nombre des lacunes qui se produisent dans des séquences du génome, et cela vaut pour les oïdium avec leur vaste expansion des éléments répétitifs 16. Très régions du génome plastique sont souvent trouvés dans ces régions répétitives 3. Ils servent un site de réarrangements chromosomiques et encodent souvent des gènes sous forte pression sélective, tels que les gènes codant pour des protéines effectrices et les gènes codant pour des enzymes du métabolisme secondaire. Les progrès des technologies de séquençage à long lecture seule molécule offrent une solution potentielle pour le séquençage à travers les régions répétitives des génomes 15. Par exemple, Faino et al. (2015) ont trouvé que l'inclusion de longue séquence de lecture optique et des technologies mapping leur a permis de produire une séquence du génome de fente inférieure à deux souches de l'agent pathogène des plantes fongique dahlia Verticillium, triplant la proportion de séquences d'ADN répétitives dans le génome, ce qui augmente le nombre d'annotations de gènes (et réduire le nombre d'annotations de gènes partielles ou manquantes ) et le génome révélateur réarrangements 17.

Pour utiliser ces technologies de séquençage de longue lecture, de fortes concentrations d'ADN génomique de haute qualité, avec des tailles minimum> 20 kbp, sont nécessaires. Nous décrivons ici nos méthodes de collecte conidies, la purification de l' ADN à haut poids moléculaire de conidies et nos évaluations de contrôle de la qualité en utilisant la cichoracearum de l'espèce de oïdium Cultivé sur le concombre 18. Ce protocole est basé sur un protocole développé dans le groupe B. laboratoire Keller (Université de Zürich, Zürich Suisse) 13, 19et comprend plusieurs modifications qui ont conduit à des rendements accrus d'ADN et une proportion plus élevée d'ADN> 48,5 kpb de taille. Le protocole comprend également des mesures de contrôle de la qualité en fonction des recommandations du ministère américain de l' énergie Joint Genome Institute 20, 21, 22.

La fonction de chaque réactif inclus dans le tampon de lyse, et la justification de chaque étape de purification, sont tels que décrits dans Henry (2008) 23. Protocoles publiés disponibles pour l' isolement de l' ADN génomique de haut poids moléculaire à partir de tissus végétaux et microbiens ont également été consultés lors de la conception de ce protocole 24, 25, 26, 27, 28.

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Protocole

1. Préparation du matériel Fungal

  1. De plus en plus oïdium
    1. Faire pousser des plantes dans des chambres de culture avec les conditions suivantes: 22 ° C Température de jour, température de 20 ° C la nuit, 80% d' humidité relative, jour de longueur de 14 h et une intensité lumineuse de 125 uE / m2 / s (fournies par l' éclairage fluorescent ).
    2. Infectent plants de concombre (Cucumis sativa variété Champion Bush) avec la UCSC1 de souche Golovinomyces comme décrit 18, 29.
  2. La récolte oïdium conidies
    1. conidies de récolte de plantes infectées à 7 - 10 jours après l'inoculation au moyen d'un petit aspirateur avec une sur laquelle les conidies accumulent filtre (11 pm) en ligne. En appliquant une légère pression, exécuter la buse d'aspiration le long de la surface de la feuille pour collecter les conidies.
      NOTE: Le rendement moyen de G. cichoracearum est de 20 mg de conidies à partir d' un très infeDECCT feuille de concombre d'environ 130 cm 2 de surface.
    2. Brosser environ 150 mg de conidies (environ 375 ul de volume, ou conidies de 7-8 feuilles de concombre infectées) du filtre sur une feuille de papier propre. A partir de là, transférer conidies dans 2 ml cryotubes avec deux 5 / diamètre de 32 pouces pré-refroidie (dans de l'azote liquide) billes de broyage en acier. retourner immédiatement tubes à l'azote liquide. des tubes de conserver à -80 ° C.
  3. Briser ouvert conidies par broyage à boulets
    1. des plaques d'aluminium gel éclair de broyeur à billes dans de l'azote liquide. Charge cryotubes dans le rack broyeur à boulets. agiter vigoureusement les cryotubes avec des boules de conidies et de l'acier dans le broyeur à boulets pendant 30 s à 30 cycles / s (à température ambiante). Immédiatement recongeler cryotubes dans de l'azote liquide.
      NOTE: Dans un premier temps, accéder à un échantillon de conidies par microscopie à grossissement 100X pour l'efficacité de la rupture de la paroi cellulaire au cours du broyage. Si nécessaire, rectifier pendant encore 1 - 2 tours de 30 s pour 30 cycles / s, but garder le nombre de tours au minimum. une évaluation systématique de rupture conidies par microscopie à ce stade est inutile une fois que les conditions optimales ont été établies.

2. Génomique de purification d'ADN

  1. conidies lyse
    1. Travailler rapidement pour éviter conidies de décongélation, retirez les billes d'acier de cryoampoules avec un aimant. Ajouter 700 ul 65 ° C tampon de lyse (tableau 1) et vortex 5 - 10 s jusqu'à ce qu'une pâte se forme.
    2. Ajouter 300 ul préchauffé (65 ° C) 5% (v / v) de sarcosyle et inverser doucement pour mélanger (1 inversion par 3 s) cinq fois. Incuber les tubes pendant 30 minutes à 65 ° C; inverser doucement 3 fois à 10, 20 et 30 min. En utilisant une pointe de pipette de grand diamètre, transfert solution complète au nouveau tube de 2 ml. A toutes les étapes ultérieures, mélanger doucement, l'inversion lente et transférer les solutions contenant de l'ADN avec grand diamètre des embouts de pipette.
  2. Extraction de l'ADN I
    1. Ajouter 1 volume de chloroforme: alcool isoamylique (24: 1 v / v) à la solution de lyse et inverser doucement pour mélanger cinq fois. Incuber pendant 10 min à température ambiante, en inversant doucement pour mélanger cinq fois au niveau du point à mi-chemin et à nouveau à la fin de l'incubation. Centrifuger à température ambiante pendant 15 min à 14 000 x g. Utilisation de la pointe de pipette de grand diamètre, transférer soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 2 ml; éviter d'inclure du contenu de l'interface.
  3. ADN Précipitations I
    1. Ajouter 1 volume température ambiante 100% de l'isopropanol (environ 750 pi) et inverser doucement pour mélanger six fois. Centrifuger à température ambiante pendant 15 min à 14 000 x g. Retirez délicatement le surnageant et le jeter.
    2. Ajouter 450 ul de pré-refroidie (-20 ° C) 70% d'éthanol. Centrifuger pendant 5 minutes à la température ambiante à 14 000 x g. Retirez délicatement le surnageant et le jeter. Centrifuger à 1000 g pendant 3 s, retirez délicatement le surnageant avec une pointe de pipette fine et jeter. Sécher à l'air la pastille pendant 15 min unt température ambiante. Ne pas sécher pendant plus de 15 min.
    3. Remettre en suspension le culot dans 300 ul de TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM d'acide ethylene diamine tétra-acétique, pH 8,0). Incuber pendant une nuit à 4 ° C. tapotez doucement pour remettre en suspension tout matériau résiduel qui ne va pas dans la solution.
  4. Pour éliminer la contamination de l'ARN, ajouter 10 pi RNase A (10 mg / ml). Retournez délicatement mélanger trois fois. Centrifuger à 1000 g pendant 3 s. Incuber à 37 ° C pendant 2 h.
  5. Extraction de l'ADN II
    1. Ajouter 300 ul de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1 v / v) et inverser doucement pour mélanger cinq fois. Incuber 10 min à température ambiante, en inversant doucement pour mélanger cinq fois à la mi-course et à nouveau à la fin de l'incubation. Centrifuger 15 min à température ambiante à 14 000 x g. En utilisant une pointe de pipette de grand diamètre, transférer le surnageant à nouveau 1,5 ml microtube.
  6. ADN II Précipitations
    1. Ajouter 0,01 volume de 3 M à pH 5,2 d'acétate de sodium (approximately 3 ul), inverser doucement pour mélanger cinq fois. Ajouter 2,5 volumes de pré-refroidie (-20 ° C) 100% d'éthanol (environ 750 pi). Retournez délicatement pour mélanger cinq fois. Incuber pendant une nuit à -20 ° C
    2. Centrifuger 30 min à 4 ° C à 14000 x g. Retirez délicatement le surnageant et le jeter.
    3. Ajouter 450 ul de pré-refroidie (-20 ° C) 70% d'éthanol. Centrifuger pendant 5 minutes à 4 ° C à 14000 x g. Retirez délicatement le surnageant et le jeter. Centrifuger à 1000 g pendant 3 s. Retirez délicatement le surnageant avec une pointe de pipette fine et défausse.
    4. Sécher à l'air la pastille pendant 30-60 min à température ambiante. Remettre en suspension le culot dans 27,5 ul de TE. Incuber pendant une nuit à 4 ° C. tapotez doucement pour remettre en suspension tout matériau résiduel qui ne va pas dans la solution.
    5. Aliquote de 2,5 ul dans 22,5 ul de TE (volume final 25 ul) pour les tests de contrôle de qualité (voir ci-dessous). Des échantillons d'ADN de conserver à 4 ° C jusqu'à ce que la transmission pour le séquençage. Pour stockage à long terme, des échantillons de magasinà -80 ° C et réduire les cycles de gel-dégel pour éviter le cisaillement.
      REMARQUE: Faites attention lors de pipetage à cette étape que l'ADN génomique de haut poids moléculaire peut être difficile à pipette, et il est important de veiller à ce que « QC aliquote » est une représentation précise de l'échantillon d'ADN génomique.

3. Contrôle de la qualité

  1. Pureté échantillon
    1. L'utilisation d'un blanc TE, évaluer la pureté de l'échantillon de l'ADN en chargeant 1 pi du QC aliquote sur un spectrophotomètre petit volume. Enregistrez A260 / A280 et A260 / A230. Lectures L'ADN pur aura un rapport A260 / A280 d'environ 1,8 et A260 / A230 rapport entre 1,8 et 2,2.
  2. Quantification de l'ADN génomique
    1. Effectuer la quantification de la portion aliquote QC en utilisant un kit de dosage de quantification d'ADN double brin commercial conformément aux instructions du fabricant.
  3. ADN évaluation de la qualité I
    1. Charge d'environ 60 ng d'ADN génomique etEchelle d'ADN sur un gel d'agarose à 0,7% en TAE 1X (40 mM de Tris, 20 mM d'acide acétique, et 1 mM d'EDTA, pH 8,0). Appareil de gel de fonctionner à 70 V pendant 40 - 45 min jusqu'à ce que les bandes d'ADN génomique sont d'environ 2 cm de la séparation de puits et la bande de l'échelle est apparente. Ces conditions peuvent devoir être ajustée en fonction de l'appareil d'électrophorèse sur gel disponible.
  4. ADN qualité II Évaluation
    1. Charge d'environ 60 ng d'ADN génomique et une échelle d'ADN de poids moléculaire élevé (adapté à l'électrophorèse sur gel en champ pulsé) sur un gel d'agarose à 1% dans 0,5 x TBE (44,5 mM de Tris, d'acide borique 44,5 mM, EDTA 1 mM, pH 8,3) et exécuter dans un tampon de migration 0,5 x TBE en utilisant un 5 - Protocole d'électrophorèse sur gel 80 de forme d'onde kpb en champ pulsé pendant 16 h.
  5. Évaluation des bactéries, des champignons et des contaminants végétaux
    1. Effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier les espaceurs transcrits internes (ITS) appropriées régions des gènes ribosomiques en utilisant des amorces et des conditions d'amplification listeed dans le tableau 2. Charge: 10 ul de la réaction résultant sur un gel.
      NOTE: Une bande représentant le oïdium région ITS devrait être amplifié avec les amorces ITS fongiques. L'ADN de ce amplicon et tout amplicon généré avec les bactéries, ou des amorces végétales doivent être séquencés pour déterminer l'origine de la contamination. Seulement oïdium des séquences ITS doit être trouvée dans le amplicon fongique.

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Résultats

Un exemple représentatif de 60 ng d' ADN génomique purifié à partir de G. cichoracearum sur un gel d' agarose en utilisant une électrophorèse sur gel et par électrophorèse sur gel en champ pulsé sont représentés sur les figures 1 et 2, respectivement. Des préparations d'ADN génomique qui passent, passent légèrement et échouent le contrôle de la qualité sont représentés. Des préparations d'ADN génomique qui passen...

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Discussion

Afin d'obtenir de l' ADN pur, génomique de haut poids moléculaire de la obligatoire champignons de l' oïdium biotrophe, une version modifiée de procédés décrits précédemment a été développé 30. Le rendement moyen en utilisant ce protocole optimisé est de 7 pg d'ADN par 150 mg de conidies, un doublement du rendement obtenu avec un protocole antérieur. En outre, la taille moyenne est passée d'environ 20 kbp à plus de 48,5 kbp. Ce protocole a été optimisé dans le système G. c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce protocole a été développé à l’appui d’un projet de séquençage conjoint de l’Institut du génome et de la communauté (#1657). Le travail a été soutenu en partie par la Fondation Philomathia, la National Science Foundation (#0929226) et l’Energy Biosciences Institute à S. Somerville ; et par le Fonds national suisse de la recherche scientifique (#310030_163260) à B. Keller. Nous tenons à remercier nos collègues, M. Figureroa et M. Miller (Université du Minnesota), R. Panstruga (Université RWTH d’Aix-la-Chapelle), C. Pedersen (Université de Copenhague), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (Université de Californie à Berkeley), M. Wildermuth (Université de Californie à Berkeley), R. Wise (Université d’État de l’Iowa) et S. Xiao (Université du Maryland) pour leurs généreux conseils et pour avoir offert leurs protocoles lors de l’élaboration du protocole décrit ici.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MM400 Broyeur à bouletsRetsch20.745.0001Ou broyeur à boulets équivalent
Tubes de 2 mL pour le broyage à bouletsSarstedt  ;72.694.007
Billes de fraisage en acier inoxydable 5/32"OPS DiagnosticsGBSS 165-5000-01
Bain-marie 280 contrôlé par microprocesseur Préréglé à 65 ° ; C  ;Thermo Fisher Scientific2825ou bain-marie équivalent
Bain-marie 280 contrôlé par microprocesseur Préréglé à 37 ° ; CThermo Fisher Scientific2825Ou équivalent à bain d’eau
Eppendorf 5417R microcentrifugeuse réfrigéréeKrakeler Scientific  ;38-022621807ou microcentrifugeuse équivalente
Chlorform :IAA (24:1 v/v)Sigma-Aldrich  ;C0549Dangereux en cas de contact cutané ou d’inhalation. Porter des gants en nitrile, des lunettes de protection, une blouse de laboratoire et travailler avec une cagoule chimique
Phénol :Chloroforme :IAA
(25:24:1 v/v)		Thermo Fisher Scientific15593031Dangereux en cas de contact avec la peau ou d’inhalation. Portez des gants en nitrile, des lunettes de protection, une blouse de laboratoire et travaillez avec une cagoule
chimique 100 % IsopropanolSigma-Aldrich  ;
100 % éthanolSigma-Aldrich  ;34923Refroidir à -20 ° ; C utilisation antérieure
Acétate de sodiumSigma-Aldrich  ;S2889
Rnase, sans Dnase (10 mg/mL)Thermo Fisher ScientificEN0531
Métabisulfite de potassiumSigma-Aldrich  ;P2522
Laurylsacroinate de sodiumSigma-Aldrich  ;L9150
Base TrisSigma-Aldrich  ;
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sigma-Aldrich  ;EDS
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma-Aldrich  ;S9888
Bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB)Sigma-Aldrich  ;H6269
Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, UvextremeStaples423263Ou lunettes équivalentes
Gants en nitrile High Five COBALT, LARGENeta ScientificHFG-N193Ou gants équivalents
GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000x dans l’eauBiotium41003
Bromure d’éthidium 10 mg/mLBiotium40042Dangereux en cas de contact avec la peau. Porter des gants en nitrile et des lunettes de protection
Agarose Ultrapure BioreagentVWR International LLCJT4063
GeneRuler 1 kb Plus Échelle d’ADNThermo Fisher ScientificFERSM1332
8 - 48 kb Normes de taille d’ADN CHEFBio-Rad170-3707
Pippin PrepLife Technologies Corporation4472172Ou équivalent en gel à champ pulsé aparatus
Papier filtre qualitatif Whatman, Grade 1Sigma-Aldrich  ;WHA1001042Ou chambre de croissance équivalente
Chambre de croissance PercivalAR66LXC9
NanoDrop 8000 Spectrophotomètre UV-VisThermo Fisher ScientificND-8000-GLOu spectrophotomètre équivalent
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit ThermoFisher ScientificP11496
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50x)Thermo Fisher ScientificB49Diluer 1/50 avec de l’eau avant utilisation (à 1x)
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015  ;
Tris-Borate-EDTA, 10x Solution (Électrophorèse)Thermo Fisher ScientificBP13334Diluer 1/10 avec de l’eau avant utilisation (à 1x)
AzoteAzote liquide (-196 ° ; C) est un risque de gel. Il se dilatera également rapidement lors du réchauffement et ne doit pas se conserver dans un récipient hermétiquement fermé
W29290710708976001 liquide

Références

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