Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic

Ashley M. Fox-Loe; Brandon J. Henderson; Christopher I. Richards

doi:10.3791/55466

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Article de méthode

Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic

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DOI :

10.3791/55466

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16 mars 2017

Ashley M. Fox-Loe¹ , Brandon J. Henderson² , Christopher I. Richards¹

¹Department of Chemistry, University of Kentucky, ²Department of Biomedical Sciences, Marshall University

Dans cet article

Résumé

Etiquetage du domaine extracellulaire d'une protéine membranaire avec un fluorophore sensible au pH, superecliptic pHluorin (SEP), permet la localisation subcellulaire, l'expression et le trafic à déterminer. les protéines d'imagerie septembre marqué avec un total de microscopie par fluorescence par réflexion interne (TIRFM) permet la quantification des niveaux de protéine dans la membrane du RE et le plasma périphérique.

Résumé

Comprendre protéine membranaire traite, l'assemblage et l'expression nécessite une approche qui établit une distinction entre ceux qui résident dans des organites intracellulaires et ceux localisés sur la membrane plasmique. Les mesures classiques basées sur la fluorescence manquent de la capacité de distinguer des protéines membranaires résidant dans différents organites. Méthodologies de pointe dépassent les méthodes traditionnelles de couplage des fluorophores sensibles au pH à la microscopie par fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM). illumination FRBR excite l'échantillon jusqu'à environ 150 nm à partir de l'interface verre-échantillon, diminuant ainsi fond, augmenter le rapport signal sur bruit, et l'amélioration de la résolution. Le volume d'excitation dans TIRFM englobe la membrane plasmique et à proximité des organites tels que l'ER périphérique. Superecliptic pHluorin (SEP) est une version sensible au pH de la GFP. Génétiquement codant septembre dans le domaine extracellulaire d'une protéine membranaire d'intérêt positionne sur le fluorophorele côté luminal du RE et dans la région extracellulaire de la cellule. Septembre est fluorescent lorsque le pH est supérieur à 6, mais reste dans un état d'arrêt à des valeurs de pH inférieures. Par conséquent, les récepteurs marqués avec une fluorescence septembre lorsqu'il réside dans le réticulum endoplasmique (RE) ou lors de l'insertion dans la membrane plasmique (PM), mais pas quand il se trouve dans une vésicule de trafic ou d'autres organites tels que l'appareil de Golgi. Le pH extracellulaire peut être ajustée pour dicter la fluorescence des récepteurs sur la membrane plasmique. La différence de fluorescence entre les images TIRF à pH extracellulaire neutre et acide pour la même cellule correspond à un nombre relatif des récepteurs sur la membrane plasmique. Ceci permet une mesure simultanée de récepteurs résidant intracellulaires et membranaires plasmiques. événements unique d'insertion des vésicules peuvent également être mesurés lorsque le pH extracellulaire est neutre, ce qui correspond à un faible pH vésiculaire de trafic fusionner avec la membrane plasmique et la transition vers un état fluorescent. Cette versatiltechnique de e peut être exploitée pour étudier la localisation, l'expression et le trafic des protéines membranaires.

Introduction

Les changements dans l' expression du récepteur, la distribution et l' assemblage ont été connectés à une grande variété de maladies, y compris la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la fibrose kystique et la toxicomanie ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^5. Par exemple, la nicotine et d' autres ligands nicotiniques influencent le trafic des récepteurs nicotiniques de l' acétylcholine (nAChR) conduisant à des changements dans le trafic, l' expression et la régulation positive ^<....