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Summary

Etiquetage du domaine extracellulaire d'une protéine membranaire avec un fluorophore sensible au pH, superecliptic pHluorin (SEP), permet la localisation subcellulaire, l'expression et le trafic à déterminer. les protéines d'imagerie septembre marqué avec un total de microscopie par fluorescence par réflexion interne (TIRFM) permet la quantification des niveaux de protéine dans la membrane du RE et le plasma périphérique.

Abstract

Comprendre protéine membranaire traite, l'assemblage et l'expression nécessite une approche qui établit une distinction entre ceux qui résident dans des organites intracellulaires et ceux localisés sur la membrane plasmique. Les mesures classiques basées sur la fluorescence manquent de la capacité de distinguer des protéines membranaires résidant dans différents organites. Méthodologies de pointe dépassent les méthodes traditionnelles de couplage des fluorophores sensibles au pH à la microscopie par fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM). illumination FRBR excite l'échantillon jusqu'à environ 150 nm à partir de l'interface verre-échantillon, diminuant ainsi fond, augmenter le rapport signal sur bruit, et l'amélioration de la résolution. Le volume d'excitation dans TIRFM englobe la membrane plasmique et à proximité des organites tels que l'ER périphérique. Superecliptic pHluorin (SEP) est une version sensible au pH de la GFP. Génétiquement codant septembre dans le domaine extracellulaire d'une protéine membranaire d'intérêt positionne sur le fluorophorele côté luminal du RE et dans la région extracellulaire de la cellule. Septembre est fluorescent lorsque le pH est supérieur à 6, mais reste dans un état d'arrêt à des valeurs de pH inférieures. Par conséquent, les récepteurs marqués avec une fluorescence septembre lorsqu'il réside dans le réticulum endoplasmique (RE) ou lors de l'insertion dans la membrane plasmique (PM), mais pas quand il se trouve dans une vésicule de trafic ou d'autres organites tels que l'appareil de Golgi. Le pH extracellulaire peut être ajustée pour dicter la fluorescence des récepteurs sur la membrane plasmique. La différence de fluorescence entre les images TIRF à pH extracellulaire neutre et acide pour la même cellule correspond à un nombre relatif des récepteurs sur la membrane plasmique. Ceci permet une mesure simultanée de récepteurs résidant intracellulaires et membranaires plasmiques. événements unique d'insertion des vésicules peuvent également être mesurés lorsque le pH extracellulaire est neutre, ce qui correspond à un faible pH vésiculaire de trafic fusionner avec la membrane plasmique et la transition vers un état fluorescent. Cette versatiltechnique de e peut être exploitée pour étudier la localisation, l'expression et le trafic des protéines membranaires.

Introduction

Les changements dans l' expression du récepteur, la distribution et l' assemblage ont été connectés à une grande variété de maladies, y compris la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la fibrose kystique et la toxicomanie ^{1, 2, 3, 4, 5.} Par exemple, la nicotine et d' autres ligands nicotiniques influencent le trafic des récepteurs nicotiniques de l' acétylcholine (nAChR) conduisant à des changements dans le trafic, l' expression et la régulation positive ^{1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10.} La nicotine augmente le nombre total de nAChR assemblés dans une cellule, le trafic augmente vers la membrane plasmique, und modifie l'assemblage de sous-unités pour favoriser une version haute sensibilité de certains sous-types. Résoudre des changements distincts dans le trafic, l'assemblage et l'expression des récepteurs dans un modèle de la maladie fournit des détails cruciaux mécanistes qui sont essentielles pour définir des cibles de médicaments. Une approche idéale serait rapidement différencier les récepteurs intracellulaires et ceux localisés sur la membrane plasmique. Cela est particulièrement difficile dans les cas où une majorité d'une protéine particulière réside intracellulaire, comme avec nAChR. Puisque la majorité des nAChR sont localisées dans le réticulum endoplasmique, les mesures traditionnelles manquent la résolution spatio-temporelle nécessaire pour identifier la localisation et la traite des changements le long de la voie sécrétoire. Trafic de récepteurs et d' expression des études de nAChR ont principalement été réalisées en utilisant radioligand de liaison ^11, des essais de biotinylation ^12, western blot ^13, ou immunoprécipitation techniq ues ^12. Celles-ci dépendent de la spécificité de liaison d'une molécule rapporteur ou la fixation des cellules et ne sont pas capables de distinguer simultanément entre résident de la membrane plasmique et les récepteurs intracellulaires. Par conséquent, les études de montage de canal ionique et vésiculaires dynamique ont largement compté sur les bas-débit techniques électrophysiologiques ^14.

résolution spatiale et temporelle supérieure est possible avec les progrès de la microscopie par fluorescence. Molécules reporters codés génétiquement, tels que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses variantes, d' éliminer les problèmes de liaison non spécifiques et d' augmenter la sensibilité ^15. Une variante sensible au pH de la GFP, connu sous superecliptic pHluorin (SEP), peut être utilisé pour exploiter les différences de pH inhérentes entre les compartiments à l' intérieur d' une cellule pour déterminer la localisation ^{5, 7, 8,}ref "> ^{9, 16, 17, 18.} septembre fluoresce lorsque le pH est supérieur à 6, mais reste dans un état d' arrêt à un pH inférieur. Par conséquent, les récepteurs marqués avec SEP sur leur côté luminal sont détectés lorsqu'ils sont présents dans le réticulum endoplasmique ( ER) ou lors de l'insertion dans la membrane plasmique (PM), mais pas quand il se trouve dans une vésicule de traite. la manipulation du pH extracellulaire en contact avec des récepteurs sur la membrane plasmique modifie par conséquent la fluorescence et donc la détection de ces récepteurs. Si la même cellule, séquentiellement imagée à la fois à un pH extracellulaire neutre et un pH inférieur à 6, la différence entre les images est attribuée à des récepteurs situés sur la membrane plasmatique. Ceci permet une mesure simultanée de intracellulaire (ER périphérique) et les récepteurs de la membrane plasmique résidentes ^{5, 7, 8} </su^{p>, 9.} événements unique d'insertion des vésicules peuvent également être résolus lorsque le pH extracellulaire est neutre. Une fois qu'un faible trafic vésiculaire pH fusionne avec la membrane plasmique, la partie luminale de la vésicule est exposée à la solution extracellulaire neutre, ce qui provoque une transition détectée comme une rafale de fluorescence de ^{7, 18, 19, 20.} Septembre permet la mesure des récepteurs localisés à la membrane plasmique et réticulum endoplasmique périphérique, et fournit un moyen de mesurer le trafic des récepteurs entre ces régions subcellulaires ^{5, 7, 18.}

Pour obtenir une résolution plus élevée à la membrane plasmique, avec un récepteur codé génétiquement septembre est imagée par microscopie de fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM). Cette méthode est particulièrementutile si la plupart des récepteurs sont localisés dans les régions intracellulaires, puisque TIRFM augmente la visibilité de la membrane plasmique. TIRFM permet également la résolution de la dynamique de trafic de vésicules individuelles portant des récepteurs SEP-marqués lors de l'insertion dans le PM. La réflexion totale interne se produit à l'interface des matériaux ayant différents indices de réfraction, par exemple entre une cellule et une lamelle couvre- objet en verre ^{21, 22.} Septembre fluoresce lorsqu'il est irradié par excitation à 488 nm, qui est orientée pour obtenir une réflexion interne totale à l'interface de la solution de verre et de la cellule. Cela produit une onde évanescente qui pénètre environ 150 nm dans l'échantillon, seulement fluorophores passionnantes dans ce volume. Seulement septembre contenant des récepteurs dans un environnement de pH neutre dans cette plage d'excitation sont détectés, correspondant à celles se trouvant sur la membrane plasmique ou réticulum endoplasmique périphérique. Depuis la détection est limitée to excitation par l'onde évanescente, la fluorescence de fond de la région intracellulaire est réduite , et le rapport signal sur bruit est augmenté de ^{21, 22.} En outre, étant donné que le rayonnement ne pénètre pas la majeure partie de la cellule, le photovieillissement est réduite au minimum qui permet l'imagerie des cellules vivantes au cours du temps. En conséquence, TIRFM couplé avec génétiquement codé septembre fournit la haute résolution et la sensibilité requise pour la mesure de localisation et de trafic dynamique subcellulaire des récepteurs membranaires le long de la voie sécrétoire.

Protocol

1. Culture cellulaire et transfection Maintenir le neuroblastome de souris 2a (N2a) , les cellules dans des milieux de croissance. Obtenir 500 ml de milieu de croissance N2a de 200 ml de milieu d'Eagle selon Dulbecco (DMEM) riche en glucose avec 250 ml de sérum réduit support, 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS) et 5 ml de pénicilline / streptomycine (100x). Maintenir les cellules dans un flacon T75 à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Fractionner les cellules 1:15 lorsque cela est nécessaire, ou à environ 80-90% de confluence. Cela est généralement 2-3 fois par semaine. Coat 35 mm verre plat en bas de poly-D-lysine. Dans une enceinte de sécurité biologique à flux laminaire, ajouter 200 ul de 0,1 ug / ml de poly-D-lysine sur du verre plat zone inférieure stérile de 35 mm. Placez plat dans un incubateur à 37 ° pendant 1 heure. Rincer soigneusement plat avec ddH 2 O 3-4 fois. Laisser la vaisselle sécher complètement pendant plus de 1 h. Steriliser plats en utilisant la lumière UV dans l'enceinte de sécurité biologique si nécessaire. Plaque cellules N2a pour l' imagerie TIRFM. Retirez le support de croissance à partir de cellules adhérentes. Détacher les cellules du flacon par incubation avec 1 ml de 1 x trypsine (+ EDTA) pendant 5 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Inactiver trypsine en ajoutant 9 ml de milieu de croissance. Mélanger les médias, la trypsine et les cellules détachées à l'aide d'une pipette. Visuellement compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et calculer le volume correct d'ajouter 90.000 cellules à chaque verre enduit plat fond poly-D-lysine. Cette densité est nécessaire pour la transfection efficace et simple imagerie TIRF cellulaire. Ajouter 2 ml de milieu de croissance à chaque plat à fond de verre contenant 90.000 cellules. Incuber la boîte à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant 16 à 24 heures. N2a transfection Obtenir un produit d'assemblage de plasmide contenant un fluorophore incorporé septembredans la région extracellulaire de la protéine d'intérêt. Des techniques de clonage standard , telles que l' amplification par PCR 5 peuvent être utilisés pour générer la construction. NOTE: SEP doit être incorporé dans la région extracellulaire de la protéine membranaire de sorte qu'il se trouve dans la lumière du reticulum endoplasmique ou le trafic des vésicules et est exposée à une solution extracellulaire lors de la membrane plasmique. Septembre est similaire en taille à la GFP et les stratégies de clonage similaires peuvent être utilisés. Remplacer le milieu de croissance sur les cellules ensemencées avec 1,5 ml de milieu sérique réduite (par exemple, Opti-MEM), soit environ 30 minutes avant l'addition du réactif de transfection. REMARQUE: Pour étudier les changements de drogue induite dans les récepteurs, une concentration appropriée de médicament peut être ajouté au moment de la transfection. Ajouter 500 ng de chaque plasmide souhaité construire à 250 pi réduite médias de sérum (tube 1). Ajouter 2 ul du réactif de transfection dans un tube séparé contenant 250 ul de milieu de sérum réduit. Incuber tube 2 à la température ambiante pendant 5 min. Le rapport du réactif de transfection à l'ADN plasmidique doit être optimisé pour exprimer chaque protéine d'intérêt. Combinez tubes 1 et 2 pour obtenir une solution contenant 500 pi de réactif de transfection et le plasmide mélange. Incuber à température ambiante pendant 25 min. Ajouter les cellules pré-métallisés 500 ul transfection mélange pour un volume total de 2 ml par boîte. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant 24 heures. Après 24 heures, retirer le mélange de transfection et rincer les cellules avec un milieu de croissance, puis ajouter 2 ml de milieu de croissance à chaque plat. REMARQUE: si un médicament a été ajouté au moment de la transfection, elle peut être réapprovisionnée à nouveau à cette étape. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant 24 heures. cellules d'image 48 h après la transfection. 2. imagerie de cellules vivantes par Total EnRéflexion externe Fluorescence Microscopy (TIRFM) Mise en place d' imagerie Réaliser une imagerie avec un microscope à fluorescence inversé mis en place avec une étape de balayage tel que représenté sur la figure 1. Ceci requiert un alignement d'une source laser à SSAD 488 nm, un moteur pas à pas pour ajuster la position du faisceau 488 nm et une ouverture numérique (NA 1,49) 60X ou 100X objectif à immersion d'huile. Passez le faisceau laser à travers le filtre d'excitation appropriée (bande passante 488/10 nm). Aligner le faisceau laser polarisé à travers une fibre optique monomode reliée à un lanceur monté sur un moteur pas à pas. En mode épifluorescence, le faisceau d'excitation est centré au milieu de l'ouverture arrière de l'objectif. Pour atteindre FRBR, utilisez le moteur pas à pas pour traduire le faisceau laser focalisé sur l'ouverture arrière de l'objectif jusqu'à ce que l'angle critique est atteinte et le faisceau est plus transmis à travers l'échantillon et est plutôt totalement réfléchi sur le verre-cell 'interface. Capture d'images en utilisant un EMCCD (512 x 512 pixels) contrôlé avec le logiciel d'imagerie (par exemple Metamorph) avec le filtre d'émission approprié monté dans la voie d'émission (525/50 nm). Préparer la solution d'imagerie Préparer 200 ml d'une solution extracellulaire (ECS) en mélangeant 150 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, CaCl2 2 mM, HEPES 10 mM et 10 mM de glucose dans ddH 2 O. solutions mères de NaCl, KCl, MgCl 2, et CaCl 2 peut être préparé à l' avance et combiné avec de l' HEPES et du glucose frais le jour de l' imagerie. Ajuster le pH d'une solution contenant 100 ml d'ECS à un pH de 7,4. Ajustez les 100 ml restants de ECS à un pH de 5,4. Rincer les cellules transfectées avec 2 ml d'ECS (pH 7,4). Ajouter 2 ml d'ECS (pH 7,4) pour les cellules transfectées avant l'imagerie. Imagerie cellulaire Live in FRBR Allumez l'ensemble du système, including 488 nm laser, appareil photo, le stade de la traduction, et le programme d'imagerie. Concentrez le faisceau épifluorescence et ajuster la puissance à environ 1 mW à l'objectif 60X. Ajouter l'huile à l'objectif et placer un plat de cellules transfectées sur la scène de la traduction. Fixer le plat en place en utilisant les montures de scène pour assurer qu'il ne bouge pas par rapport à l'étape de sorte que les cellules peuvent être visualisés à plusieurs reprises. En mode épifluorescence, focaliser le microscope et de localiser les cellules fluorescentes, transfectées. Les cellules resteront axées sur plusieurs plans de mise au point. Repérez simples, des cellules isolées pour procéder à la FRBR. Dans le programme d'imagerie, réglez le temps d'exposition à 200 msec et d'optimiser l'intensité de fluorescence en réglant le gain EM. Passer le faisceau laser en TIRF en traduisant le faisceau à travers l'objectif d'une manière progressive à l'aide du moteur pas à pas. À l'approche de l'angle critique, le faisceau sera visiblement traduire à travers le bord du plat jusqu'à ce qu'il converge à thpoint de réflexion interne totale sur le plan de l'échantillon e. Vérifiez que les cellules sont en mode FRBR en ajustant le bouton de mise au point. Dans TIRF, un seul plan de cellules peut être concentré ( par exemple à environ 150 nm de l' interface verre), produisant une image bien définie avec une résolution élevée de la membrane plasmique. Imagerie septembre pour déterminer la localisation subcellulaire Localiser transfectées, les cellules saines, simples dans le plan d'imagerie. Acquérir une image focalisée de la cellule à pH 7,4. Septembre marqué des récepteurs sur la membrane plasmique et réticulum endoplasmique doit être visible. bloquer rapidement le faisceau laser atteigne l'échantillon pour prévenir le photoblanchiment. Mémoriser les positions de scène correspondant à chaque cellule en utilisant un logiciel d'imagerie de microscope capable d'enregistrer plusieurs emplacements xy. Répétez les étapes 2.4.1-2.4.4 pour 20-30 cellules par boîte tout en utilisant le logiciel pour enregistrer la position de chaque cellule. Un Fter toutes les images de cellules à un pH de 7,4 sont recueillies, retirer manuellement la solution ECS à pH 7,4 à l'aide d'une pipette. Ne touchez pas le plat car cela pourrait déplacer les positions de scène mémorisées. Soigneusement ajouter 2 ml de pH 5,4 ECS au plat et attendre 10 min. Pendant ce temps, enregistrer des images précédemment acquises. Sous le même ensemble de conditions utilisées pour recueillir des images à pH 7,4, déplacer la scène à chaque position enregistrée et d'acquérir une image de la même cellule à pH 5,4. Les cellules doivent regarder moins définis puisque toute fluorescence détectée est originaire de réticulum endoplasmique confinés septembre récepteurs marqués. Enregistrez les images de cellules pH 5,4. Imaging simples événements d'insertion des vésicules dans les cellules vivantes Remplacer les médias de cellules transfectées de croissance avec 2 ml pH 7,4 ECS, ou L-15 des médias Leibovitz. Le pH de L-15 de médias Leibovitz est CO 2 indépendant, permettant l' imagerie à se dérouler sur une longue période de temps si nécessaire. Place la boîte de cellules transfectées sur la platine du microscope. Fixer et se concentrer une seule cellule dans la FRBR suivant l'étape 2.3 ci-dessus. Le cas échéant, régler la mise au point automatique de sorte que la mise au point ne dérive pas sur la période de l'imagerie. Enregistrement d'une série de 1000 images, capture en continu des images à une vitesse de 200 msec de cadre. Eclats de fluorescence seront visibles pendant ce temps, correspondant à des vésicules à faible pH de trafic de fusion avec la membrane plasmique, exposant la SEP au pH extracellulaire 7.4. Trouver un autre cellule unique et répétez l'étape ci-dessus. Réinitialiser autofocus si nécessaire. 3. Analyse de l'image et de traitement de données L' analyse de la fluorescence septembre afin de déterminer la localisation subcellulaire Ouvrez les images de cellules en utilisant un logiciel d'analyse d'image tels que Metamorph ou ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Soustraire l'arrière-plan à la fois 5,4 pH et de pH 7,4 images en utilisant le réglage de roulement à billes. Utiliser un seuil basé sur l'intensité de fluorescence pour quantifier à partir d'une seule cellule. sélectionner manuellement une région d'intérêt autour de la cellule dans l'image de pH 7,4. Mesurer la surface cellulaire, intensité moyenne, et la densité intégrée à l'aide d'un plugin dans ImageJ ou en utilisant le construit en fonction "Mesure" sous l'onglet Analyser. Répéter les étapes 3.1.1-3.1.3 pour la même cellule, à un pH de 5,4, en ajustant avec soin le seuil en fonction de l'intensité et de la région d'intérêt de la même manière. Une fois la densité intégrée est obtenue pour des images de cellules à la fois à pH 7,4 et 5,4, calculer la densité intégrée de la membrane plasmique en soustrayant la valeur de pH 5,4 à partir de la valeur de pH 7,4. La différence correspond au nombre des récepteurs par rapport à la membrane plasmique au sein de la région d'excitation TIRF. En tant que mesure de la traite, de calculer le pourcentage relatif de septembre marqué des récepteurs situés sur la membrane plasmatique par rapport aux récepteurs visibles dans les excitati TIRF restantessur le volume en divisant la membrane plasmique densité intégrée par la densité totale intégrée à un pH de 7,4, multipliée par 100. L' analyse des événements d'insertion unique vésiculaires Ouvrez la série de 1000 images TIFF en utilisant un logiciel d'analyse d'image. Soustraire l'arrière-plan de toutes les trames en utilisant le réglage de roulement à billes. Réglez la balance des couleurs de l'enregistrement afin de maximiser les régions intenses correspondant aux vésicules événements d'insertion. compter manuellement les rafales de fluorescence d'une durée de 3 images (> 600 msec).

Representative Results

Septembre incorporation dans un récepteur permet la détection directe de ce récepteur dans une cellule vivante. Couplé à TIRFM, ce qui permet d'évaluer les niveaux d'expression relatifs à la membrane plasmique et la distribution des récepteurs à l'intérieur des emplacements subcellulaires dans la région de l'excitation TIRF. Simples événements de trafic de vésicules peuvent également être résolus. …

Discussion

La sensibilité au pH de septembre permet à des récepteurs se trouvant sur la membrane plasmique à distinguer des récepteurs intracellulaires dans le réticulum endoplasmique, et il peut être utilisé pour résoudre des événements d'insertion de vésicules ^{5, 7, 8, 9, 18, 19, 20} …

Materials

Reagent/Material
Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2	VWR	82050-856
35 mm glass bottom petri dishes, sterile	Cell E&G	GBD00002-200
Poly-D-lysine	vwr	215017510
Dulbecco Modified Eagle Medium‎ (DMEM), High Glucose	Fisher Scientific	11-965-084
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco / Fisher Scientific	31-985-088
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)	Gibco / Fisher Scientific	16-000-044
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Fisher Scientific	12604-021
Penicillin-Streptomycin Solution	VWR	45000-652
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Gibco / Fisher Scientific	21083027	Optional
Lipofectamine	Fisher Scientific	11668030	Gently mix; Do not vortex
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-10
Magnesium chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Objective immersion oil	Olympus	Type F
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Microscope	Olympus	IX81
Camera	Andor	iXon Ultra 897
60x, 1.49 NA oil immersion objective	Olympus	APON 60XOTIRF
Motorized stage	Prior	IXPROXY
Motorized actuator (stepper motor)	Thorlabs	ZST213
MetaMorph (or other imaging program)	Metamorph
488 nm laser	Market Tech
Single mode fiber	Thorlabs	SM450
Mirrors	Thorlabs	BB1-E01
Dichroic 488 nm LP	Semrock	Di02-R488-25×36
Bandpass filter, 488 nm	Semrock	LL01-488-12.5
Bandpass filter, 525/50	Semrock	FF03-525/50-25