Application de Codé génétiquement fluorescent oxyde nitrique (NO •) Sondes, les geNOps, pour l'imagerie en temps réel de NO • Les signaux dans les cellules simples

Résumé

Ce manuscrit présente des protocoles pour l’application de nouvelles sondes d’oxyde nitrique (NO•) génétiquement codées (geNOps) pour surveiller les fluctuations de NO• d’une cellule unique en temps réel à l’aide de la microscopie à fluorescence. La formation de NO• déclenchée par le Ca²⁺ au niveau des cellules endothéliales individuelles a été visualisée en combinant les geNOps avec un capteur chimique Ca²⁺.

Résumé

L'oxyde nitrique (NO •) est un petit radical, qui médie plusieurs fonctions cellulaires importantes chez les mammifères, les bactéries et les plantes. Malgré l'existence d'un grand nombre de méthodes de détection de NO • in vivo et in vitro, la surveillance en temps réel de NO • au niveau d'une seule cellule est très difficile. Les effets physiologiques ou pathologiques de NO • est déterminée par la concentration réelle et de temps de séjour de ce radical. Par conséquent, des procédés qui permettent la détection de cellules isolées de NO • est hautement souhaitable. Récemment, nous avons élargi la palette de NO • indicateurs en introduisant unique à base de protéine fluorescente génétiquement codée oxyde nitrique (NO) • sondes (de geNOps) qui répondent directement aux cellulaires NO • fluctuations et, par conséquent, répond à ce besoin. Ici, nous démontrons l'utilisation de geNOps pour évaluer intracellulaires NO • signaux en réponse à deux chimique différente NO • molécules -liberating. Nos résultats also confirmer que fraîchement préparée de 3- (2-hydroxy-1-méthyl-2-nitrosohydrazino) -N-méthyl-1-propanamine (NOC-7) a un potentiel beaucoup plus élevé pour évoquer des changements dans les niveaux intracellulaires NO • par rapport à la inorganique NO • nitroprussiate donneur de sodium (SNP). En outre, deux couleurs imagerie des cellules vivantes en utilisant les geNOps verts (G-GENOP) et l'indicateur chimique Ca ²⁺ Fura-2 a été réalisée pour visualiser la réglementation stricte de Ca ²⁺ dépendante NO • formation dans les cellules endothéliales simples. Ces expériences représentatives démontrent que geNOps sont des outils appropriés pour enquêter sur la génération en temps réel et la dégradation des unicellulaires NO • signaux dans divers montages expérimentaux.

Introduction

Nous avons récemment développé une nouvelle classe de fluorescents NO • sondes codées génétiquement, appelé les geNOps ^1. Ces capteurs sont constitués par un simple bâti, les bactéries dérivées, NO ² • domaine de liaison, qui est conjugué à une protéine fluorescente distincte (FP) variante ³ (cyan, vert ou orange FP). NO • liaison au fer non hémique (II) Centre ⁴ dans les geNOps instantanément réduit l'intensité de fluorescence ^1. Fait important, la fluorescence de geNOps récupère rapidement et complètement lorsque intracellulaires NO • Les niveaux diminuent ^1. Par conséquent, geNOps permettent l'imagerie en temps réel de (sous-) cellulaires NO • fluctuations. Bien que NO • détection du mécanisme de geNOps restent peu claires à ce jour, ils se sont avérés être d'excellents NO • journalistes, et ont donc le pouvoir d'ouvrir une nouvelle ère de polychromie, quantitative NO • bioimaging avec de hautes résolutions spatiales et temporelles ^{1, 5.} Autres disponibles fluorescents NO • sondes sont basées sur de petits composés chimiques, qui doivent être chargés dans les cellules, et sont modifiées de façon irréversible par NO • ^6. Inconvénients supplémentaires de NO • petites fluorophores sensibles sont leur cytotoxicité potentiel et spécificité relativement faible ce qui rend difficile de les utiliser d'une manière fiable, analytique et concluante ^{7, 8, 9.} Bien que l'utilisation efficace des sondes fluorescentes codées génétiquement nécessite des techniques de transfert de gènes efficaces, capteurs codés génétiquement à base de FP ont émergé comme des outils indispensables qui ont révolutionné notre compréhension du fonctionnement interne des cellules ^{10, 11.} Avant le développement des geNOps simples à base de FP, un groupe Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) à base • capteur de NO, appelé NOA-1 ^12, a été construit. Sato et al. conçu cette sonde sophistiquée qui se compose de deux sous - unités du NO • -sensible guanylate cyclase soluble (CGT), les deux capteurs à base de FRET de conjugués de rapports guanosine monophosphate cyclique (GMPc) niveaux ^12. Comme cette sonde répond aux cGMP, il détecte indirectement intracellulaires NO • fluctuations ^12. Bien que NOA-1 répond à NO • élévations dans la gamme de nano-molaire, cet outil n'a pas été utilisé fréquemment jusqu'à présent, probablement en raison des limitations concernant la disponibilité et la praticabilité de ce capteur bipartites encombrant.

Fonctions polyvalentes de NO •, ayant un impact fondamental des processus biologiques ont été bien caractérisés ^{13, 14.} De nombreuses études ont montré que le NO • Concentration dans les cellules et sous - domaines qui détermine le destin des cellules dans la santé et les maladies ^{14, 15, 16.} Dans les mammifères, NO • est principalement générée par voie enzymatique dans divers types de cellules par le bien caractérisé l'oxyde nitrique synthase (NOS) famille ^17. Jusqu'à présent, trois isoformes de NOS ont été décrits ^{18, 19, 20;} ce sont les Ca ²⁺ / calmoduline-dépendante NOS endothéliale (eNOS ou NOS-3) ¹⁸ et la NOS neuronale (nNOS ou NOS-1) ¹⁹ et le Ca ²⁺ / calmoduline-indépendante constitutivement active NOS inductible (iNOS ou nos- 2) ^20. En outre, l'existence de mitochondrial NSA (mtNOS) a également été suggéré ^21. Cependant, mtNOS est considéré comme une variante d'épissage de la nNOS, et est donc non classé séparément comme une isoforme ^21. Une autre isoforme, à l' exception de ceux des cellules de mammifères, est le soi-disant NOS bactérienne (bNOS), trouve principalement dans les bactéries gram-positives ^22. La production enzymatique de NO • est fortement contrôlée et dépend de la disponibilité de plusieurs cofacteurs tels que le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH), flavine adénine dinucléotide (FAD), la tétrahydrobioptérine (BH4), l' oxygène moléculaire et de la L-arginine ^17. L'acide aminé L-arginine cationique est le substrat qui est converti en L-citrulline lors de la production NO • ^17. En plus de la génération enzymatique hautement régulé de NO •, il a été postulé que le radical peut être réduit de façon non enzymatique à partir de pools de nitrite par les mitochondries dans des conditions hypoxiques ^23. • Une fois que NO est produit à l' intérieur d' une cellule, il peut diffuser librement à travers les membranes biologiques ^14,ref "> 15. Cependant, la demi-vie très courte de ce radical est principalement déterminée par les conditions environnementales et différentes voies et les réactions chimiques se dégradent efficacement NO • niveaux ^24. Finalement, la formation, la diffusion et la dégradation de NO • dépend les paramètres environnementaux variés qui déterminent la concentration efficace de la molécule biologiquement active hautement ^24.

La technologie geNOps permet la détection directe de (sous) NO cellulaire • fluctuation ¹ et est donc adapté à réexaminer, et récemment découvrir les mécanismes responsables de l'accumulation et la décomposition des cellulaires NO • signaux. Ici, nous fournissons des protocoles simples et des résultats représentatifs pour l'utilisation de geNOps pour visualiser de manière exogène évoquée et NO • profils générés de manière endogène, au niveau des cellules individuelles. En outre, la technologie de geNOps peut être adapté pour applicature dans d'autres systèmes de modèles de cellules pour étudier les motifs complexes de NO • la formation, la diffusion et à la dégradation en réponse aux stimuli cellulaires et des contraintes diverses.

Protocole

1. Préparation de Tampons et solutions chimiques

1. Préparer un tampon de stockage contenant 135 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de _CaCl2, 1 mM de _MgCl2, 10 mM HEPES, 2,6 mM _NaHCO3, 0.44 mM de KH ₂ PO _4, 0,34 mM de Na ₂ HPO ₄ mM , D - 10 glucose, 2 mM de l-glutamine, vitamines 1x MEM, 1x MEM acides aminés, 1% stylo streptocoque, et 1% amphotéricine B. Dissoudre tous les composants dans de l'eau distillée et agiter le tampon pendant 20 minutes en utilisant un agitateur magnétique à température ambiante. Ajuster le pH à 7,44 à l'aide de NaOH 1 M. Lors de l'addition goutte à goutte de NaOH, de mesurer le pH en utilisant un pH-mètre, tout en agitant en continu.
2. Préparer un rapport Ca ²⁺ contenant un tampon physiologique qui se compose de 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de _CaCl2, 1 mM de _MgCl2, 10 mM de D-glucose et 10 mM de HEPES. Ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH comme décrit dans l'étape 1.1.
3. Préparer un tampon exempt de ^{Ca2 +} qui se compose des mêmes ingrédientscomme indiqué dans l'étape 1.2. Utiliser EGTA 1 mM au lieu de 2 mM.
4. Solubiliser Fura-2 heures dans du DMSO pour obtenir une solution mère 1 mM. Aliquoter la solution mère dans des flacons hermétiquement fermés et conserver à -20 ° C pendant jusqu'à un mois. En cas de gel, laisser la solution mère à équilibrer à la température ambiante pendant au moins 1 heure à l'abri de la lumière. Diluer la solution stock Fura-2 heures dans 1 tampon de stockage de ml (étape 1.1) pour obtenir une concentration finale de 3,3 uM.
5. Préparer 1 ml d'une histamine solution mère 100 mM dans de l'eau distillée (pH 7,0). Diluer l'histamine solution mère 100 mM dans 100 ml Ca ²⁺ contenant un tampon physiologique à une concentration finale de 100 uM d' histamine.
6. Solubiliser Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) dans 100 ml de tampon physiologique contenant du calcium pour obtenir une concentration finale de 300 uM. Stocker les solutions à 37 ° C bain d'eau pendant au moins 1 heure jusqu'à ce que la L-NNA est complètement dissous.
7. Solubiliser 10 mg CNP-7 wa distilléeter (pH 7,0) pour obtenir une solution mère à 10 mM. Aliquoter la solution mère dans de petites aliquotes dans des flacons hermétiquement fermés et stocker immédiatement à -70 ° C. Diluer la solution stock NOC-7 dans un tampon physiologique pour obtenir une concentration finale de 10 uM NOC-7.
   NOTE: NOC-7 est un petit composé chimique qui libère spontanément NO avec une demi-vie courte. Toujours préparer les tampons de travail qui consiste NOC-7 juste avant chaque expérience.
8. Préparer une solution de nitroprussiate de sodium 1 mM (SNP) dans un tampon physiologique de calcium et de préparer une dilution de 10 pm.
   NOTE: Toujours préparer de petites quantités (~ 10 ml) de solutions NO-donneurs en raison de la vitesse de dégradation rapide.
9. Préparer une solution tamponnée de phosphate (PBS) constitué de 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 9,2 mM de Na ₂ HPO ₄ et 1,5 mM de KH ₂ PO _4. Ajuster la valeur du pH à 7,44 avec du NaOH / HCl.

2. Préparation des cellules

NOTE: En oRDONNANCE pour obtenir une uniformité des performances de la mesure de l' oxyde nitrique (NO •) dans des cellules individuelles à l' aide geNOps, les cellules doivent être pré-incubées avec un fer (II) / vitamine C , contenant un tampon avant les expériences d'imagerie afin de rétablir Fe ²⁺ dans le NO • domaine liant le du NO • -probes. Dans le cas des cellules EA.hy926 et HEK293, incubation pendant 20 minutes avec le fer (II) solution de rappel conduit à l'activation complète des NO • capteurs.

1. Graine de 5,5 x 10 ⁵ EA.hy926 ou cellules HEK293 pour le lendemain ou 3,5 x 10 ⁵ cellules pour le jour après jour suivant, le 30 mm couverture de microscope verres dans un puits d'une plaque à 6 puits. Incuber les cellules à 37 ° C dans un environnement humidifié à 5% de CO _2.
   NOTE: Des informations détaillées concernant une infection adénovirale de cellules de mammifères et la construction de virus a été décrit par Zhang et al. ^25. Cette étape ne concerne pas les cellules HEK 293 exprimant de manière stable G-GENOP.
2. Prenez le sérum de veau foetal (FCS) et l'aigle de milieu modifié de Dulbecco (DMEM) sans antibiotique et ajouter le type de virus adéno-associé 5 (AAV5) vecteur portant le gène codant pour G-GENOP (MOI: 500 pour les cellules EA.hy926 rendement presque 100 % de cellules positives; MOI: 1 est efficace pour les cellules HEK293).
   NOTE: L'utilisation de vecteurs viraux adéno-associés est affecté au groupe de risque 2. niveau de biosécurité 2 de confinement est généralement requis pour le travail avec ce vecteur. Le cas échéant, l'infection par le virus peut également être effectuée dans du FCS contenant du milieu. Alternativement, les cellules peuvent être transfectées de manière transitoire en utilisant des supports à base de ^lipides-1.
3. Retirez le milieu de culture et laver les cellules avec pré-chauffé (37 ° C) PBS. Ajouter 1 ml de milieu DMEM / VAA5 dans chaque puits pendant 1 h. Cette étape ne concerne pas les cellules HEK 293 exprimant de manière stable G-GENOP.
4. Ajouter 1 ml de 20% de FCS contenant du DMEM à chaque puits à une concentration finale de 10% de FCS. Ne pas retirer le support AAV5 contenant des cellules. gentlemanly SEESAW la plaque pour homogénéiser le milieu dans les puits. Incuber les cellules pendant 48 heures à 37 ° C dans un environnement humidifié à 5% de CO _2. Cette étape ne concerne pas les cellules HEK 293 exprimant de manière stable G-GENOP.
5. Après 48 h, laver les cellules avec pré-chauffé PBS. ajouter ensuite 2 ml préchauffé tampon de stockage (section 1.1) à chaque puits et incuber les cellules à la salle RT pendant au moins 1 heure à l'abri de rayonnement lumineux.
6. Remplacer le tampon de stockage avec 1 ml / puits de (II) une solution d'amplificateur de fer à la température ambiante (RT). Incuber les cellules pendant exactement 20 minutes dans l'obscurité.
   NOTE: Ne pas dépasser ou de réduire le temps d'incubation optimal, car cela pourrait affecter la réactivité des NO • sondes.
7. Laver les cellules une fois avec du tampon de stockage et incuber chaque puits avec 2 ml de tampon de stockage pendant au moins 2 heures à température ambiante afin de permettre aux cellules d'atteindre l'équilibre.
8. Remplacer le tampon de stockage avec 3,3 uM de Fura-2 heures dans un tampon de stockage de 1 ml pendant 45 minutes à la température ambiante, à l'abride la lumière.
9. Laver les cellules deux fois avec du tampon de stockage et incuber encore une fois pendant au moins 30 minutes afin de permettre aux cellules d'atteindre l'équilibre.

3. Imagerie de cellules vivantes NO • et Ca ²⁺ signaux dans les cellules individuelles

1. Fixer une lamelle de 30 mm revêtu de cellules EAhy.926 ou HEK293 (de l'étape 2.1) dans une chambre de perfusion en métal et placez-le sur le microscope. Connecter le tube d'arrivée aux réservoirs de tampon et l'efflux à une pompe à vide. Assurer un flux régulier et éviter la vidange de la lamelle.
2. Démarrer la perfusion par gravité avec un tampon physiologique de calcium (étape 1.2), en utilisant un système de perfusion semi-automatique.
   REMARQUE: Un tel système est constitué de réservoirs de tampon, les tubes respectifs, les vannes magnétiques qui sont commandés électroniquement et une pompe à vide (voir figure 1B). Le débit peut varier de 1 à 3 ml / min, dépendant de la hauteur des réservoirs de perfusion. Pour appli cohérentes de drogue locauxcation, le taux de tous les réservoirs utilisés de débit doit être à peu près égale. Ceci doit être testé avant des expériences d'imagerie. Considérez que les cellules endothéliales répondent à une augmentation de la contrainte de cisaillement qui peut être induite par une perfusion rigoureuse.
3. Mettre en marche le système d'imagerie et de permettre d'échauffement de tous les dispositifs pendant 30 min.
4. Définir les paramètres d'imagerie utilisant des logiciels respectifs. Sélectionnez la longueur d'onde d'excitation de 340 nm et 380 nm pour fura-2 imagerie et 480 nm pour exciter G-GENOP. Pour minimiser la fluorescence blanchiment augmenter le binning de la caméra à 4 et à réduire l'intensité d'excitation et des temps d'exposition. Voir aussi les étapes 3,6-3,8.
   REMARQUE: Les paramètres d'imagerie et les paramètres dépendent des appareils utilisés, fura-2 efficacité de chargement et de niveaux d'expression G-GENOP.
5. Sélectionnez la région d'imagerie en déplaçant le xyz table du microscope jusqu'à ce que plusieurs cellules fluorescentes sont dans le foyer. Ensuite, définir des régions d'intérêt (ROI) par l'intermédiaire de l'outil logiciel respectif. Dessinez régions couvrant plusieurs ensemble single cellules fluorescentes par champ d'imagerie manuellement. En outre, définir une région d'arrière-plan de taille similaire.
   NOTE: Une fois que les images ont été acquises et stockées ROIs peut également être défini récemment après le processus d'imagerie pour l'analyse en outre l'utilisation des logiciels d'analyse d'imagerie respectifs (voir la liste des matériaux).
6. Début de la collecte des données sur un microscope à fluorescence inversé et avancé avec un étage d'échantillon motorisé, et une source de lumière monochromatique. exciter alternativement à 340 nm et 380 nm pour le Fura-2 heures et à 480 nm pour le G-GENOP, respectivement. Régler les temps d'exposition respectifs de telle sorte que pour tous les canaux, un signal de fluorescence clair est détectable au fil du temps. Voir aussi l'étape 3.4.
   NOTE: Cela dépend de l'intensité de la lumière d'excitation et le binning de la caméra. Par exemple, utiliser 15% d'intensité de la lumière d'excitation, un binning de caméra de 4 et 150 ms pour 340 nm, 50 ms pour 380 nm, et 300 ms pour 480 nm. Voir aussi l'étape 3.4.
7. Recueillir la lumière émise à 510 nm pour fura-2 / h, 520 nm pour G-Genop en utilisant un dispositif (CCD) à couplage de charge avec l'ensemble de filtre approprié constitué de l'excitateur de 500 nm, un dichroïque 495 nm et un émetteur 510-520 nm. Enregistrez un total d'images toutes les 3 s.
8. Enregistrer les premières minutes ( le cas échéant jusqu'à 3 min) dans un tampon physiologique ^{Ca2 +} (1,2) afin d' obtenir la ligne de base des signaux de fluorescence respectifs dans le temps.
9. Une fois par fluorescence de base stable est observée, passer à 100 histamine uM ou ATP (1 uM ou 100 uM) contenant physiologique Ca ²⁺ tampon pour stimuler les cellules pendant 3 min.
   NOTE: Les cellules EA.hy926 qui répondent aux agonistes montrent une forte augmentation du ratio fura-2 (fluorescence excitée à 340 nm divisée par la fluorescence excitée à 380 nm) et une nette diminution du signal de fluorescence G-GENOP.
10. Revenez à la mémoire tampon physiologique Ca ²⁺ sans histamine ou ATP et L-NNA pendant 5 min pour éliminer les composés à partir des cellules. Cette étape peut être prolongée jusqu'à ce que les fluoreschangements cence sont récupérés complètement.
11. Administrer 10 uM NOC-7 dans un tampon physiologique ^{Ca2 +} pendant 2 minutes en utilisant le système de perfusion. Le donneur NO affecte fortement G-GENOP fluorescence qui diminue habituellement par> 20% en réponse à 10 uM NOC-7. Dans les cellules EA.hy926 l'effet NOC-7 est d'environ 3 fois plus forte par rapport à l'agoniste du G-GENOP fluorescence induite par trempe.
12. Laver le NO • composé -releasing pendant environ 10 min avec Ca ²⁺ physiologique tampon et arrêter l' enregistrement une fois la fluorescence basale est récupéré.

Analyse 4. Données

1. Exporter l'acquisition des données d'intensité de fluorescence moyenne des cellules individuelles au fil du temps, le logiciel d'analyse de données.
2. Soustraire des valeurs de référence respectives, et calculer le rapport de 340 nm à 380 nm par des Fura-2 signaux respectifs de chaque cellule unique dans le temps.
3. Soustraire les valeurs de fond du canal G-GENOP pour obtenir la fl réelleuorescence intensité de la NO sonde (F) au fil du temps en utilisant un logiciel de calcul.
4. Prendre des valeurs de fluorescence de base en F ₀ (F ₀ est la fluorescence de la sonde de NO au cours du temps sans stimulation). Voir aussi l' étape 4.5 et la figure 1C.
5. Calculer une fonction au fil du temps pour que les effets de fluorescence de blanchiment à l' aide de l'équation suivante: F = ₀ F _inital • exp (-K • Time) + F _plateau. F _inital: signal de fluorescence maximale une fois l' imagerie est commencé; K: constante de taux de fluorescence de blanchiment au fil du temps; F _plateau: fluorescence minimale atteinte par la décoloration au fil du temps; Voir aussi les étapes 4.3- 4.4 et Figure 1C.
   NOTE: Pour l'approximation, toutes les valeurs de fluorescence au cours du temps avant et après la stimulation des cellules peuvent être utilisés. De plus amples détails sont précisés par Bentley et al. ^27.
6. Pour normaliser le signal G-GENOP au fil du temps, calculer 1-F / F₀ (étapes 4,3-4,5). Voir la figure 1C et 1D.

Résultats

Visualisation des cellules uniques NO • Profils en réponse à transitoirement appliquée NO donateurs

Nous avons utilisé un clone de cellules HEK qui exprime de manière stable G-GENOP (figure 1A), afin de visualiser NO • signaux sur le niveau de la cellule unique en réponse à deux petits composés chimiques NO libérant différentes, CNP-7 et SNP. Les NO • donateurs ont été consécutivement appliqués et retirés à partir de cellules lors de l' imagerie à l' aide d' un système de perfusion par gravité qui a assuré flux continu (figure 1B). Toutes les cellules exprimant G-GENOP avec des intensités différentes ont montré une nette diminution de la fluorescence en réponse à la CNP-7 et SNP (figure 1C), indiquant rapide NO • accumulation dans les cellules lors de l'addition des NO • donateurs. Signaux de fluorescence normalisés (1-F / F ₀₎ ont démontré que le NO • donateurs évoqués cellula homogèner NON • élévations qui a complètement récupéré après lavage des NO • composés -releasing (Figure 1D). Cependant, 10 uM de SNP induit seulement 50% du NO cellulaire • Signal (9,63 ± 1,05%, n = 3/38) qui a été atteint par 10 uM NOC-7 (18,10 ± 1,20%, n = 3/38, p < 0,0001). Afin d'atteindre l' égalité intracellulaires NO • niveaux avec le NO • donateurs, une concentration de 1 mM de SNP était nécessaire (Figures 1C, 1D).

Ensuite, nous avons testé la capacité fraîchement préparé par rapport a expiré NOC-7 pour élever intracellulaires NO • niveaux dans les cellules HEK. A cet effet, nous avons préparé quatre tampons expérimentaux contenant 5 uM NOC-7. Le NO • donneur a été soit ajouté fraîchement juste avant la mesure, ou maintenue dans les réservoirs pendant 1 h, 2 h et 3 h à la température ambiante avant la mesure. Les différents tampons ont été successivement appliqués à f éliminésROM , les cellules exprimant le G-GENOP en utilisant un système de perfusion (figure 2B). Cette approche a dévoilé la stabilité des aqueuses NOC-7 solutions qui, comme prévu, ont montré une diminution des capacités au fil du temps pour élever intracellulaires NO • niveaux (Figures 2A, 2C). Fait intéressant, NO • Les signaux récupérés nettement plus rapide lors de l'enlèvement des tampons expirés, par rapport à la intracellulaire NO • réponse qui a été évoquée par frais CNP-7 (figure 2C), l' adhérence indiquant peut - être des molécules intactes NO • -liberating à composants cellulaires .

Visualisation simultanée de Ca ²⁺ et NO • Les signaux dans les cellules endothéliales simples

Afin d'étudier Ca ²⁺ -triggered NO • formation dans les cellules endothéliales, l'endothéliales immortalisées cellules de remplacement couramment utilisé, la lignée cellulaire EA.hy926, était transiently transfectées avec G-GENOP et chargé avec Fura-2 / h (voir le protocole 2.8). La transfection a abouti à environ 10% des cellules endotheliales positives G GENOP (n = 6, la figure 3A), ce qui est suffisant pour enregistrer ^{Ca2 +} -evoked NON • la production au niveau des cellules endothéliales seules. Cependant, nous avons atteint près de 100% G-GENOP cellules EA.hy926 positives en utilisant un vecteur viral adéno-associé (n = 6; voir le protocole 2.2). Avant les mesures multi - canaux, les cellules ont été incubées pendant 20 min à température ambiante dans un tampon de stockage constitué par la L-NNA, un puissant inhibiteur irréversible ^NOS-26. Les cellules témoins ont été maintenus dans le même tampon de stockage sans L-NNA (voir Protocole 1.1) (figure 3B). Le traitement des cellules témoins avec l' histamine, un inositol 1,4,5-triphosphate puissant (IP ₃₎ générant un agoniste, cytosolique instantanément élevée ^{Ca2 +} niveaux suivie d'une augmentation progressive du NO intracellulaire • jusqu'à ce que l'agoniste a été removed (figures 3C, 3D). Les cellules pré-traitées avec le NOS-inhibiteur montré cytosolique Ca ²⁺ signaux similaires, alors que le NO intracellulaire • niveau est resté à peu près inchangée en réponse à l' histamine (Figure 3E). EA.hy926 cellules exprimant G-GENOP ont également été traitées avec 1 uM et 100 uM de l'IP ₃ générant agoniste ATP afin de tester si oui ou non geNOps conviennent de surveiller NO • signaux en réponse à la fois une faible physiologique et supra-physiologiques Les concentrations d'un agoniste (figure 3F). Dans la lignée cellulaire endothéliale 1 pM ATP évoqué un cytosolique clair NO • signal, qui était d' environ la moitié du signal obtenu par 100 pM ATP (Figure 3F).

Figure 1: profils de NO intracellulaires en réponse à différentes NO-liberati ng molécules. (A) images larges de cellules HEK de terrain exprimant de manière stable cytosolique G-GENOP. Barre d'échelle = 20 pm. (B) Représentation schématique d'un système de perfusion par gravité à base de semi-automatique pour l'application commandée et le retrait de la NOC-7 et le SNP. (C) représentatif (sur 3 expériences indépendantes) non normalisée d' intensité de fluorescence de cellules uniques traces en unités arbitraires en fonction du temps des cellules HEK exprimant de façon stable cytosolique G GENOP en réponse à 10 uM NOC-7, 10 uM de SNP, et 1 mM SNP. courbe gras noir représente la courbe moyenne de 26 traces unicellulaires (courbes gris clair). Courbe noire représente Parsemé F _0, qui a été utilisé pour la normalisation. (D) traces simples Normalisé et inversées (1-F / F _0, courbes gris clair), et courbe moyenne (courbe noire en gras) au fil du temps en réponse à 10 uM NOC-7, 10 uM SNP, et 1 mM SNP extrait de panneau C.es / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Essai de stabilité de la NOC-7 en utilisant des cellules HEK stable G-GENOP exprimant. (A) représentant NO • courbe de réponse de concentration dans le temps de manière stable G-GeNOps exprimant des cellules HEK lors de l' application de la NOC-7 solutions tampons fraîches et anciennes. Tous les tampons contenant de la CNP-7 ont été préparées d'abord avec une concentration finale de 5 uM en utilisant la même solution de stock (50 mM). Le temps écoulé des solutions respectives après la préparation jusqu'à ce que des quantités d'imagerie à 1 h, 2 h et 3 h comme indiqué. (B) Représentation schématique d'un système de perfusion de semi-automatique par gravité consécutivement ajouter et supprimer des solutions de la CNP-7 contenant lors de l' imagerie. (C) corrélations temporelles decellulaire NO • signaux en réponse fraîchement préparés et vieux CNP-7 tampons. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: imagerie multicanal simultanée de NO • et Ca ²⁺ signaux dans les cellules EA.hy926 simples. (A) représentatifs grand champ images de fluorescence des cellules exprimant EAhy.926 G-GENOP (panneau de gauche) qui sont chargés avec fura-2 / h (moyenne et panneaux de droite). Barre d'échelle = 20 pm. (B) Représentation schématique du traitement des cellules avec 500 uM EAhy.926 Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) pendant 20 minutes dans une plaque à six puits avant la mesure. (C) au cours du temps représentatif d'un enregistrement simultané de fura-2 (excitation: 340 nm / 380 nm emission: 510 nm) et des signaux G GENOP (excitation: 480 nm; émission: 520 nm) en réponse à 100 uM d'histamine. Comme indiqué histamine a été éliminé au bout de 3 min à l'aide d'un système de perfusion. (D) Les courbes représentent des enregistrements simultanés de cytosolique Ca ²⁺ (-2 fura signaux de rapport, F ₃₄₀ / F ₃₈₀ est gris ligne pleine) et NO • (courbe normalisée et inversée, 1-F / F ₀ est une ligne solide vert) signaux au fil du temps d'une seule fura-2 / am chargé cellules endothéliales exprimant transitoirement G-GENOP. Les cellules ont été stimulées avec 100 uM d' histamine pendant 3 min dans un ^{Ca2 +} (2 mM _CaCl2) contenant un tampon (n = 03/08). (E) représentant enregistré simultanément Ca ²⁺ (ligne solide gris) et NO • Les signaux (ligne verte solide) au fil du temps d'une cellule EA.hy926 qui a été prétraités avec 500 uM Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) avant à la mesure (n = 03/12). Les cellules ont été traitées avec 100 uM d'histamine en présence de 2 mMCa ^2+. (F) représentant les courbes moyennes cytosoliques NO • Les signaux en réponse à 1 uM d' ATP suivie d'une seconde stimulation des cellules avec 100 pM d' ATP. Les barres représentent les valeurs moyennes ± écart-type des signaux G GENOP maximaux en réponse à 1 uM d'ATP (barre blanche) et 100 uM d'ATP (barre verte) de 4 expériences indépendantes; p <0,001 par rapport à 1 pM d'ATP. P-valeur a été calculée en utilisant un test t non apparié. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Depuis la découverte de NO • comme une molécule de signalisation importante dans la biologie ^28, la mesure spécifique en temps réel du radical dans des cellules individuelles, des tissus et des animaux entiers avec une haute résolution d'une manière réaliste et fiable a été aspiré. Nous rapportons ici l'application de récemment mis au point génétiquement codés fluorescents NO • sondes (geNOps) qui permettent précisément l' imagerie des cellules vivantes de NO • signaux utilisant grand champ de microscopie par fluorescence ^1.

Pour contourner les procédures de transfection élaborées et invasives clone de cellules HEK qui exprime de manière stable fluorescente verte G-GENOP a été utilisé pour quantifier une seule cellule générée de manière exogène NO • profils. Comme les cellules HEK normalement ne produisent pas de manière endogène • NO ^29, ce type de cellule est apte à la génération d'une lignée de cellules de détection à base GENOP, ce qui pourrait être utile pour de nombreuses autres applications dans des conditions de co-cultureavec NO • produire des cellules primaires ou même chez les animaux ³⁰ vivant. Toutefois, dans cette étude, nous démontrons la capacité de divers composés NO • -liberating, de différentes concentrations et stabilités, pour évoquer intracellulaires NO • signaux en utilisant le modèle de cellules HEK G-GENOP exprimant. Nos données ont révélé que le NO • donneur de concentration, la qualité et la méthode d'application éventuellement déterminer les motifs de NO intracellulaires • profils. Ces informations sont indispensables pour la pharmacocinétique in situ la caractérisation des différentes NO • donateurs, qui sont indicatifs de plusieurs maladies. Notamment, geNOps ont été montré pour répondre de manière stable à de multiples applications répétitives de NO • donneur de impulsions sur une très longue période ^1. En conséquence, les expériences utilisant NO • -liberating composés présentés ici, permettent des conclusions semi-quantitatives sur les diverses amplitudes et la cinétique de NO cellulaire respective226; les signaux (figures 1 et 2).

Bien que le HEK exprimant de manière stable le clone cellulaire provient probablement d'une seule cellule, une grande hétérogénéité du G-geNOps les niveaux d'expression a été observée (figure 1). Ceci est une caractéristique commune des clones cellulaires stables comme la transcription du (génome intégré) gène d'intérêt est sous le contrôle de nombreux facteurs tels que divers stress environnementaux ³¹ qui influencent les taux de croissance des cellules ³² et l'état du cycle cellulaire ^33. Les geNOps simples à base de FP sont des sondes non-ratiométrique et, par conséquent, le NO • perte induite par des augmentations d'intensité de fluorescence avec le niveau d'expression GENOP ^1. En conséquence, la normalisation des signaux de geNOps est essentiel pour la quantification cellulaires NO • signaux particulièrement dans le cas d'une analyse comparative. Comme le montre notre étude récente, une stricte corrélation linéaire bntre l'intensité de fluorescence basale de geNOps et la force de l'extinction de la fluorescence induite par NO • sur une large gamme d'intensités de fluorescence a été trouvée ^1. Ceci est une caractéristique importante de geNOps pour la quantification absolue des cellulaires NO • signaux. Comme le montre la figure 1, la normalisation des signaux G-geNOps en réponse à NDP-7 et SNP a révélé homogènes NO • signaux dans différentes cellules HEK de la même plaque, ce qui indique que les cellules HEK ne sont pas diversifiés quant à leur capacité à prendre et dégrader le radical NO • qui provient du NO • donneur. En revanche, à l'aide de geNOps dans les cellules HeLa ont démontré hétérogénéités claires de cellulaires NO • signaux entre différentes cellules en réponse à la CNP-7. Ces différences pointer spécifiques du type NO • métabolisme et décomposition des taux de cellules, ce qui pourrait avoir des implications multiples dans la physiologie cellulaire et la pathologie, et peut être découvert en utilisant la GENOPla technologie de l'art.

Néanmoins, deux caractéristiques importantes de geNOps doivent être soigneusement examiné pour l'utilisation correcte des capteurs et des interprétations de données: i) geNOps nécessitent suffisamment de fer (II) pour répondre pleinement aux NO • ¹ et ii) en fonction de la variante FP, geNOps peut être sensible au pH ^1. Nous décrivons ici un protocole qui a été jugé approprié pour la supplémentation en fer non toxique (II) de geNOps, qui sont exprimés dans les deux HEK, des cellules HeLa ou EA.hy926 (voir Protocole 2.6). Bien qu'il ait été démontré que le traitement des cellules avec du fer (II) / vitamine C n'a pas affecté la morphologie cellulaire, la viabilité cellulaire et l' activité métabolique des cellules ^1, il peut être nécessaire d'optimiser cette étape importante pour d' autres types de cellules et tissus. Cependant, dans certaines conditions expérimentales, l'exigence de fer (II), le chargement peut limiter l'applicabilité de geNOps. Notamment, il a été démontré que l'ascorbate peut réduire le NO • ³⁵ et ascorbate de fer (II) complexes sont capables de piéger NO • ^{36, 37.} En outre, l' excès de fer (II) et l' ascorbate peuvent induire des réponses inflammatoires ³⁹ et eNOS découpler ^41. Ces effets doivent être pris en considération lors de l'utilisation de la technologie geNOps. Il a été démontré que , dans certaines conditions expérimentales, le pH intracellulaire est affecté de manière significative ^34, qui a le potentiel d'influencer la fluorescence geNOps ^1. Notamment, les variantes de cyan et geNOps verts sont relativement sensibles au pH montrant une diminution de la fluorescence lors de l' acidification ^1. Par conséquent, des changements aigus de la (sous) pH cellulaire peuvent simuler de faux NO • signaux lorsque vous utilisez les geNOps sensibles au pH. Comme suggéré dans nos travaux précédents, l'utilisation parallèle de NO • geNOps insensibles (geNOps ^mut) en tant contro négativels est recommandé de disséquer réelle cellulaire NO • signal du pH change ^1. En plus des changements de pH cellulaire peuvent être inspectés en utilisant des sondes de pH tels que Sypher ^34.

En outre, nous avons visualisé enzymatique NO endogène • la formation en réponse à un agoniste physiologique ^{Ca2 +} dans la cellule mobilisant l' endothelial porteuse EA.hy926. La lignée cellulaire EA.hy926 est un système modèle fréquemment utilisé exprimant constamment eNOS ^38. Utilisation de geNOps transitoirement exprimés dans les cellules EA.hy926, a confirmé que IP ₃ médiée les signaux de Ca évoquent profonde NO • formation dans ce type de cellule, qui a été presque complètement bloquée par L-NNA. Afin de corréler temporellement Ca ²⁺ avec NO • Les signaux, les cellules G-GENOP exprimant ont été chargées avec la excitables-UV chimique Ca ²⁺ -Indicateur fura-2 / h. La séparation spectrale du Ca ²⁺ lié et non lié fura-2 Fluo rescence du signal G GENOP peut être facilement réalisé avec des jeux de filtres disponibles dans le commerce ^40. Imagerie les deux sondes ont dévoilé que le Ca ²⁺ enzymatique -triggered NO • formation se produit beaucoup plus lent par rapport à la hausse du cytosolique Ca dans ce type de cellules endothéliales. Cinétiques similaires de unicellulaires NO • signaux dans les cellules endothéliales de l' artère pulmonaire bovine sur le traitement des cellules avec l'agoniste bradykinine IP _3, générant ainsi que les contraintes de cisaillement ont été rapportés en utilisant NOA-1, un capteur très NO • -sensible indirecte ¹² . Par conséquent, ces données soulignent que le ^{Ca2 +} -evoked eNOS dérivé NON • la formation nécessite un certain temps de démarrage jusqu'à ce que l'activité enzymatique totale est atteinte. Bien que la cinétique cellulaire NON • la formation, la diffusion et la dégradation peuvent être extraites à partir d' autres données, par exemple sur la base des mesures de tensions de NO • induite par la relaxation des vaisseauxss = "xref"> 26, le grand avantage de NO fluorescentes • sondes est qu'ils convertissent directement cellulaires NO • fluctuations en signaux visibles en temps réel. Par conséquent, l'imagerie cellulaire NO • signaux avec geNOps fournit une résolution spatiale et temporelle, et offre des possibilités uniques en (re) enquêter sur le (sous) cellulaire NO • homéostasie. Par exemple, l' imagerie eNOS la navette ⁴² en combinaison avec la technologie de geNOps dans les cellules endothéliales unique peut être adapté pour établir une corrélation entre la formation de NO • la localisation subcellulaire et la translocation de l'enzyme NO • productrices ou d' autres protéines appropriées telles que la calmoduline et ⁴³ cavéoline.

Nous décrivons ici l'application possible du G-GENOP exprimant des cellules HEK et EA.hy926 de visualiser de manière exogène et endogène généré cellulaires NO • signaux sur le niveau d'une seule cellule et en temps réel sur une large fluorescence de champ m classiqueicroscope. Nos données impliquent que geNOps sont appropriés pour suivre spécifiquement (sous-) cellulaires NO • Dynamique dans diverses conditions expérimentales en utilisant toutes sortes de types de cellules intéressantes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NaCl	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	3957.20	chlorure de sodium
KCl	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	6781.1	chlorure de potassium
CaCl2· ; 2H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	T885.1	chlorure de calcium dihydraté
MgCl2· ; 6H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	2189.2	chlorure de magnésium hexahydraté
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	9105.3	4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinééthanesulfonique
NaHCO3	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	8551.1	hydrogénocarbonate de sodium
KH2PO4	Merck, Darmstadt, Allemagne	104873	dihydrogénophosphate de potassium
Na2HPO4· ; 2H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	4984.1	hydrogénophosphate de sodium dihydraté
D(+)-Glucose monohydraté	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	6780.1	>99.5 %; pour la culture cellulaire, sans endotoxines
EGTA	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	3054.2	éthylène glycol-bis(2-aminoéthyléther )-N⁠ ;,⁠ ; N⁠ ;,⁠ ; N⁠ ; et prime ; ⁠ ;,⁠ ; N⁠ ; et prime ; ⁠ ; -acide tétraacétique ; agent chélateur de calcium
NaOH	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	6771.1	hydroxyde de sodium
HCl	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	4625.1	acide chlorhydrique, fumant, 37 % (~10 N)
DMSO	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	4720.1	diméthylsulfoxyde ;   ; solvant organique hautement polaire et aprotique
chlorhydrate d’acide L-glutamique  ;	Sigma Aldrich, Vienne, Autriche	G2128	(S)-2-Acide aminoglutarique
DMEM, faible teneur en glucose	Sigma Aldrich, Vienne, Autriche	D5523	Dulbecco' s Aigle modifié' s Glycémie moyenne à faible ; avec 1 000 mg/L de glucose et de L-glutamine, sans bicarbonate de sodium, en poudre, adapté à la culture cellulaire.
Solution vitaminique MEM (100x)	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11120037	100 fois plus de vitamines que l’on trouve dans le milieu essentiel minimum standard (MEM)
Solution d’acides aminés MEM (50x)	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11130036	50 fois plus d’acides aminés essentiels (sauf la L-glutamine) que l’on trouve dans le milieu essentiel minimum standard (MEM)
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/ml)	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140122.00	antibiotiques pour prévenir la contamination bactérienne des cultures cellulaires
Amphotéricine B	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	15290026.00	Gibco Amphotéricine B contient 250 µ ; g d’amphotéricine B (Fungizone) et 205 µ ; g de désoxycholate de sodium ; empêche la contamination des cultures cellulaires par des levures et des champignons multicellulaires
FCS	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270106	Sérum de veau fœtal, qualifié, approuvé par l’UE, origine Amérique du Sud
PBS, pH 7,4	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	10010031.00	solution saline tamponnée au phosphate
Fura-2 (AM)	Teflabs, Austin, TX, USA	102	dichlorure
d’hydrochlorure d’histamine	Sigma Aldrich, Vienne, Autriche	H7250	dichlorhydrate de 2-(4-imidazolyl)éthylamine ; agoniste générateur d’IP3  ;
N&omega ;-Nitro-L-arginine	Sigma Aldrich, Vienne, Autriche	N5501	Acide N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoïque ; L-NNA ;   ; inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase
NOC-7	Calbiochem/Merck, Darmstadt, Allemagne	487952	3-(2-Hydroxy-1-méthyl-2-nitrosohydrazino)-N-méthyl-1-propanamine ; donneur d’oxyde nitrique (NO) Courte demi-vie de libération de NO
Nitroprussiate de sodium dihydraté	Santa Cruz Biotechnology, Texas, États-Unis	sc-203395A	nitroferricyanure de sodium(III) dihydraté ; composé libérant de l’oxyde nitrique
30 mm Feuilles de	recouvrementKarl Hecht, Sondheim v. d. Rhö ; n, Allemagne	41001130	lamelles en verre, HECHT « Assistent », taille 1, rond, 30 mm, (VE : 100 pièces)  ;
Solution booster de fer(II)	Imagerie fluorescente de nouvelle génération (NGFI), Graz, Autriche	n.a.Tampon	physiologique contenant du fer(II) pour le chargement non toxique du fer(II) des cellules ;   ; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
Plasmide G-geNOp	Imagerie fluorescente de nouvelle génération (NGFI), Graz, Autriche	n.a.ADN	plasmidique codant pour une sonde sensible verte  ;NO (G-geNOp) ;   ; http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5	Imagerie fluorescente de nouvelle génération (NGFI), Graz, Autriche	n.a.adénovirus	codant pour une sonde verte sensible au NO (G-geNOp) ;   ; http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
Lignée cellulaire du capteur G-geNOp	Imagerie fluorescente de nouvelle génération (NGFI), Graz, Autriche	n.a.Lignée	de rein embryonnaire humain (HEK293) exprimant de manière stable une sonde verte sensible au NO (G-geNOp) ;   ; http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A lignée cellulaire	Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	R70507	de la lignée cellulaire rénale embryonnaire humaine (HEK293)  ;
Lignée cellulaire EA.hy926	American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Allemagne	Clone hybride de cellules somatiques CRL-2922 d’une lignée cellulaire de veine ombilicale humaine avec un clone résistant à la thioguanine de A549
TILL iMIC	Till Photonics, Graefling, Allemagne	n.a.microscope	numérique
Monochromateur en V polychrome	Till Photonics, Graefling, Allemagne	n.a.commutation	ultra rapide
AVT Stingray F145B	Allied Vision Technologies, Stadtroda, Allemagne	n.a.Caméra	CCD polyvalente avec capteur Sony ICX285 EXview HAD, IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40	Zeiss, Gö ; ttingen, Allemagne	n.a.40X
filtres dichroïques	Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, États-Unis	n.a.Émetteur	GFP 514/3 nm (515dcxr)
ValveBank8 Controller	AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, Californie, USA	01-08	unité de contrôle du système de perfusion programmable
BVC control	Vacuubrand, Wertheim, Allemagne	727200	Pompe à membrane de chimie ME 1C ; pompe à vide pour système de perfusion
logiciel ImageJ	; Image du NIH  ;		Programme de traitement d’images Java inspiré de NIH Image. http://imagej.net/Welcome