L'imagerie à cellules vivantes des cellules sanguines marquées dans la circulation oculaire peut fournir des informations sur l'inflammation et l'ischémie dans la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Un protocole pour étiqueter les cellules sanguines et l'image des cellules marquées dans la circulation de la rétine est décrit.
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Article de méthode
Étiquetage des colorants fluorescents des érythrocytes et des leucocytes pour étudier la dynamique du flux dans la circulation de la rétine de la souris
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La dynamique du flux sanguin rétinien et choroidal peut donner un aperçu de la pathophysiologie et des séquelles de diverses maladies oculaires telles que le glaucome, la rétinopathie diabétique, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (AMD) et d'autres affections inflammatoires oculaires. Il peut également aider à surveiller les réponses thérapeutiques dans l'œil. L'étiquetage correct des cellules sanguines, couplé à l'imagerie des cellules vivantes des cellules marquées, permet d'étudier la dynamique de l'écoulement dans la circulation rétinienne et choroïde. Ici, nous décrivons les protocoles normalisés de 1,5% d'indocyanine vert (ICG) et de 1% de fluorescéine de sodium sur l'étiquetage des souris érythrocytes et les leucocytes, respectivement. On a appliqué une ophtalmoscopie laser à balayage (SLO) pour visualiser les cellules marquées dans la circulation rétinienne des souris C57BL / 6J (type sauvage). Les deux méthodes ont démontré des cellules séparées fluorescentes dans la circulation de la rétine de la souris. Ces méthodes d'étiquetage peuvent avoir des applications plus larges dans diverses maladies oculairesdes modèles.
Introduction
L'étude de la dynamique de l'écoulement des cellules sanguines dans la circulation rétinienne et choroïdienne est impératif pour comprendre la pathogenèse des maladies oculaires potentiellement visibles pour la vision et d'autres affections inflammatoires oculaires. Cependant, les techniques d'angiographie conventionnelles, qui impliquent la liaison de colorants fluorescents aux protéines plasmatiques, ne fournissent aucune information concernant la dynamique des érythrocytes ou des leucocytes 1 . La dynamique des flux rétiniens des érythrocytes est importante pour étudier la circulation métaboliquement efficace dans la rétine ....
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Protocole
Les protocoles animaux utilisés dans cette étude ont été approuvés par le comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux de SingHealth, à Singapour et sont conformes aux directives de l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO) Déclaration pour l'utilisation d'animaux en ophtalmologie et en vision Recherche.
1. Étiquetage des érythrocytes et des leucocytes avec des colorants fluorescents
- Préparation des réactifs
- Préparer ICG (1,5 mg / mL) en dissolvant 3 mg d'ICG dans 1800 μL d'eau distillée stérilisée. Ajouter 200 μL de solution salée tamponnée au phosphate ....
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Résultats
Les érythrocytes marqués avec ICG à 1,5% ont été visualisés dans la circulation rétinienne de souris C57BL / 6J (type sauvage). L'hématocrite à 1% et à 5% des érythrocytes marqués au ICG à 1,5% se distingue par la circulation de la rétine. Cependant, les cellules étiquetées individuelles ont été visualisées plus clairement avec 1% d'hématocrite d'érythrocytes marqués ICG à 1,5% ( figure 1 ). Dans 5% d'hématocrite, en raison du grand nombre de.......
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Discussion
L'étude de l'hémodynamique dans la circulation rétinienne et choroïdienne est essentielle pour comprendre la pathophysiologie de nombreuses maladies oculaires. La dynamique du flux sanguin dans la circulation de la rétine peut être étudiée par tomographie par cohérence optique à Fourier (FD-OCT), par laser speckle flowgraphy (LSFG) et par oxymétrie rétinienne. Bien que ces méthodes utilisent différentes approches pour étudier le flux sanguin total dans la circulation de la rétine 40 .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler. Aucun conflit financier ou financier.
Remerciements
Le projet de recherche a été financé dans le cadre de la subvention du nouveau chercheur du National Medical Research Council (NMRC), à Singapour. L'équipe souhaitera reconnaître la formation de recherche fournie au docteur Agrawal à l'Institut d'ophtalmologie (IOO), au collège universitaire de Londres (UCL) au titre de la bourse de formation en recherche outre-mer du Conseil national de recherches médicales (NMRC) de novembre 2012 à octobre 2014 sous mentorat du Prof. David Shima. Le Dr Agrawal a acquis le concept et les compétences pour l'étiquetage des cellules et l'imagerie en direct dans le laboratoire du Dr Shima. L'équipe souhaitera don....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Colorant polyméthine Cardiogreen (Vert d’indocyanine) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescéine 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10x Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Albumine sérique bovine | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Tubes micro-contaminés avec K2E (K2EDTA) - Concentration en EDTA - 1,8 mg/mL de sang | BD, USA | REF | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifugeuse 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Tubes à microcentrifuger 2 mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Mélangeur Vortex | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Incubateur à agitateur | Lab Tech | ||
| Ceva Injection de kétamine (chlorhydrate de kétamine 100 mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (chlorhydrate de xylazine 20 mg/ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1 % Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1 %) | Alcon ; Laboratories, Inc. États-Unis | NDC ; 0998-0355-15 | |
| 2,5 % Mydfrin 5 mL (Chlorhydrate de phényléphrine 2,5 %) | Alcon ; Laboratories, Inc. États-Unis | NDC ; 0998-0342-05 | |
| Seringue Terumo avec aiguille 1 cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10 G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Allemagne | ||
| Tampons imbibés d’alcool | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Système d’angiographie confocale à balayage laser (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Allemagne | ||
| Hiedelberg Spectralis Logiciel du module de visualisation, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Allemagne | ||
| Microscope fluorescent | ZEISS | Modèle : axio imager z1 |
Références
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent lab....
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