La détection de G Protein-Coupled Receptor Internalisation activé de ligand par microscopie confocale

Résumé

Ce protocole décrit la détection de la microscopie confocale de l'internalisation du récepteur (GPCR) couplé à la protéine G dans les cellules de mammifères. Il comprend la culture de cellules de base, la transfection et la procédure de microscopie confocale et fournit une méthode efficace et facilement interprétable pour détecter la localisation subcellulaire et intériorisation des GPCR de fusion exprimée.

Résumé

La microscopie confocale à balayage laser (CLSM) est une technique d’imagerie optique pour l’imagerie à contraste élevé. Il s’agit d’une approche puissante pour visualiser les protéines de fusion fluorescentes, telles que la protéine fluorescente verte (GFP), afin de déterminer leur expression, leur localisation et leur fonction. La localisation subcellulaire des protéines cibles est importante pour l’identification, la caractérisation et les analyses fonctionnelles. L’internalisation est l’un des mécanismes prédominants contrôlant la signalisation du récepteur couplé aux protéines G (RCPG) pour assurer les réponses cellulaires appropriées aux stimuli. Ici, nous décrivons une méthode expérimentale pour détecter la localisation subcellulaire et l’internalisation des RCPG dans les cellules HEK293 avec la microscopie confocale. De plus, cette expérience fournit quelques détails sur la culture cellulaire et la transfection. Ce protocole est compatible avec une variété de marqueurs fluorescents largement disponibles et est applicable à la visualisation de la localisation subcellulaire d’une majorité de protéines, ainsi que de l’internalisation des RCPG. Cette technique devrait permettre aux chercheurs de manipuler efficacement l’expression du gène GPCR dans les lignées cellulaires de mammifères et devrait faciliter les études sur la localisation et l’internalisation subcellulaires des GPCR.

Introduction

Les cellules possèdent la machinerie de trafic de fret pour le transport extracellulaire matériaux tels que des ligands, des micro - organismes, des substances nutritives et des protéines transmembranaires dans la cellule pour obtenir des informations, de l' énergie, et d' autres buts ^{1, 2.} Il est essentiel pour l'homéostasie cellulaire, la fonction des tissus, et la survie globale des cellules. L'expression à base de cellules de protéines de fusion fluorescentes est un moyen puissant pour étudier la localisation et l' internalisation des récepteurs transmembranaires, telles que G récepteu....

Protocole

1. Préparation des cellules

1. La récupération des cellules
   1. Transférer le rein embryonnaire humain 293 cryoconservés cellules (HEK293) à partir d'un réservoir d'azote liquide dans un bain d'eau à 37 ° C et agiter en continu pendant 1 - 2 min.
   2. Ajouter 10 mL de milieu de croissance Equilibrated (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de solution de pénicilline-streptomycine) à une boîte de culture cellulaire de 10 cm. Incorporer délicatement les cellules décongelées au milieu de croissance équilibrée.
   3. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C CO à chemise....

Résultats

La figure 1 montre un exemple d'un système de microscope confocal. La figure 2 présente l'expression de pEGFP-N1 dans les cellules HEK293. Le signal de la GFP a été détectée dans le cytoplasme et le noyau. La figure 3 montre la localisation subcellulaire de GnRHR de S. japonica dans les cellules HEK293, conformément à nos résultats publiés précédemment ^15. La protéine de fusion avec l'étiquett.......

Discussion

Le protocole présenté ici fournit une méthode efficace et facilement interprétable pour détecter la localisation subcellulaire et intériorisation de protéines de fusion GPCR exprimé dans les cellules HEK293. La technique peut être facilement adapté pour de nombreux gènes différents et types de cellules, par exemple pour la localisation cellulaire et de l' internalisation du récepteur corazonin de Bombyx mori dans des cellules HEK293 et BMN ^16.

L'appli.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lignée cellulaire HEK293  ;
DMEM/Hyperglycémie	Hyclone	SH30022.01	Haute teneur en glucose 4,0 mM L-glutamine
Sérum fœtal bovin (FBS)	PuFei	1101-100
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Genom	GNM10010
Pénicilline-Streptomycine	Genom	GNM15140
0,25 % Trypsine & 0,02 % EDTA	Genom
Opti-MEM (1x)	GIBCO, par Life Technologies	31985-062	milieu sérique réduit
Lipofectamine 2000 Réactif de transfection	Invitrogen	11668027	Réactif 1
X-tremeGENE HP DNA Réactif de transfection	Roche	6366236001	Réactif 2
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1006
DiI	Beyotime	C1036
Antifade Montage Medium	Beyotime	P0126
Paraformaldéhyde	Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)	80096618
100 mm culture cellulaire	CORNING	430167
plaque à 6 puits  ;	ExCell Bio	CS016-0092
Plaque à 12 puits  ;	ExCell Bio	CS016-0093
Verre de couverture	NEST	801007
Lames de microscope	Citoglas	10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 Incubateur	Thermo	3111
TCS SP5II Microscope confocal à balayage laser	Leica  ;

GNM252005100001311